Name: enhanced viability for ex vivo 3d hydrogel cultures of patient-derived xenografts in a perfused microfluidic platform
Uploaded: 2020-12-05T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Enhanced Viability for Ex vivo 3D Hydrogel Cultures of Patient-Derived Xenografts in a Perfused Microfluidic Platform at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health National Cancer Institute SBIR Fase I (HHSN26120700015C) og P01CA098912.

Tumorvæv blev opnået med patientens samtykke og i henhold til en godkendt Institutional Review Board (IRB) protokol. Xenografts blev implanteret, dyrket og høstet i henhold til en accepteret Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) protokol.
BEMÆRK: Alt arbejde skal udføres i et sterilt biologisk sikkerhedsskab for at opretholde sterilitet. Alle trin skal udføres ved stuetemperatur, medmindre andet er angivet.
1. Fremstilling af materialer til PDX-for...

<ol>
	<li>Jung, J., Seol, H. S., Chang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Generation+and+Application+of+Patient-Derived+Xenograft+Model+for+Cancer+Research.">The Generation and Application of Patient-Derived Xenograft Model for Cancer Research.</a> Cancer Research and Treatment: Official Journal of Korean Cancer Association. 50 (1), 1-10 (2018).</li><li>Malaney, P., Nicosia, S. V., Dave, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One+mouse,+one+patient+paradigm:+New+avatars+of+personalized+cancer+therapy.">One mouse, one patient paradigm: New avatars of personalized cancer therapy.</a> Cancer Letters. 344 (1), 1-12 (2014).</li><li>Meehan, T. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PDX-MI:+Minimal+Information+for+Patient-Derived+Tumor+Xenograft+Models.">PDX-MI: Minimal Information for Patient-Derived Tumor Xenograft Models.</a> Cancer Research. 77 (21), 62-66 (2017).</li><li>Fong, E. L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogel-Based+3D+Model+of+Patient-Derived+Prostate+Xenograft+Tumors+Suitable+for+Drug+Screening.">Hydrogel-Based 3D Model of Patient-Derived Prostate Xenograft Tumors Suitable for Drug Screening.</a> Molecular Pharmaceutics. 11 (7), 2040-2050 (2014).</li><li>Fong, E. L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+3D+in+vitro+model+of+patient-derived+prostate+cancer+xenograft+for+controlled+interrogation+of+in+vivo+tumor-stromal+interactions.">A 3D in vitro model of patient-derived prostate cancer xenograft for controlled interrogation of in vivo tumor-stromal interactions.</a> Biomaterials. 77, 164-172 (2016).</li><li>Engel, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyaluronic+Acid-Based+Hydrogel+Formulations+Suitable+for+Automated+3D+High+Throughput+Drug+Screening+of+Cancer-Stromal+Cell+Cocultures.">Hyaluronic Acid-Based Hydrogel Formulations Suitable for Automated 3D High Throughput Drug Screening of Cancer-Stromal Cell Cocultures.</a> Advanced Healthcare Materials. 4 (11), 1664-1674 (2015).</li><li>Lanz, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapy+response+testing+of+breast+cancer+in+a+3D+high-throughput+perfused+microfluidic+platform.">Therapy response testing of breast cancer in a 3D high-throughput perfused microfluidic platform.</a> BMC Cancer. 17 (1), 709 (2017).</li><li>Wevers, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+compound+evaluation+on+3D+networks+of+neurons+and+glia+in+a+microfluidic+platform.">High-throughput compound evaluation on 3D networks of neurons and glia in a microfluidic platform.</a> Scientific Reports. 6, 38856 (2016).</li><li>Vulto, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phaseguides:+a+paradigm+shift+in+microfluidic+priming+and+emptying.">Phaseguides: a paradigm shift in microfluidic priming and emptying.</a> Lab on a Chip. 11 (9), 1596-1602 (2011).</li><li>Patru, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD133,+CD15/SSEA-1,+CD34+or+side+populations+do+not+resume+tumor-initiating+properties+of+long-term+cultured+cancer+stem+cells+from+human+malignant+glio-neuronal+tumors.">CD133, CD15/SSEA-1, CD34 or side populations do not resume tumor-initiating properties of long-term cultured cancer stem cells from human malignant glio-neuronal tumors.</a> BMC Cancer. 10, 66 (2010).</li><li>Harma, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+panel+of+three-dimensional+models+for+studies+of+prostate+cancer+growth,+invasion+and+drug+responses.">A comprehensive panel of three-dimensional models for studies of prostate cancer growth, invasion and drug responses.</a> PLoS One. 5 (5), 10431 (2010).</li></ol>

Her beskriver vi en metode til behandling og dyrkning levedygtige PDX-afledte tumorceller i et høj-gennemløb, perfunderet 3D-kultursystem. Mens denne protokol udnytter PCa PDX væv, Det er lige så effektiv for andre epitel-afledte tumorer. Tumor egenskaber varierer mellem de enkelte PDX linjer selv inden for samme væv af oprindelse (prostata, bryst, osv.). Nogle PCa PDX linjer er mere fibrotiske og vanskelige at isolere levedygtige celler fra, mens andre er mere cellulære. Tumoren størrelse bemærkes her kan varier...

I løbet af det seneste årti, inden for kræftforskning har vist fornyet begejstring for patient-afledte xenografts (PDXs) som et redskab til vurdering af kræft celle vej afhængighed og narkotika modtagelighed1. De mest almindelige PDX modeller er etableret ved subkutan eller ortotopisk implantation af menneskelige tumorceller-en tumor fragment, en klynge af dissocierede tumor-afledte celler, eller en prøve af isolerede cirkulerende tumorceller (CTC'er) -i en gnaver vært. Hvis tumoren "tage" er en succes, xenograft celler vil formere sig, vaskularisere, og ellers interagere med værten væv til at skabe en tumor, som kan høstes på en optimal størrelse, opdelt, og re-implanteret i andre værter. Blandt deres mange fordele som model system, PDXs typisk bevare en betydelig del af den indfødte tumor celle befolkningens heterogenitet og muliggøre vurderingen af human-specifikke veje og celle svar2,3. In vivo-konteksten muliggør tumorinteraktion med vaskulatur og andre tilstødende stroma og opsummerer vævsegenskaber såsom lægemiddeldiffusionsdynamik, iltspænding og ekstracellulær matrix indflydelse, der biologisk og mekanisk påvirker tumorprogression. Et negativt aspekt af PDXs er deres afhængighed af en gnaver vært, både for tumor ekspansion og i sidste ende for hypotese test. Fordi mange PDXs ikke kan tilpasse sig traditionelle to-dimensionelle (2D) kultur på vævskultur polystyren uden at miste mange af deres ønskelige egenskaber, har der været minimal mellemvej for forskere mellem denne relativt kontrollerede in vitro-metode, og den betydelige stigning i bekostning, faciliteter og tidskrav til in vivo PDX brug.
Vi har beskrevet flere in vitro-modeller, der gennemfører 3D-cellekultur inden for en støttende matrix, og for nylig udvidet dette arbejde for at demonstrere ex vivo kultur flere prostatakræft (PCa)-afledte PDXs, både alene og i co-kultur med knoglemarv-afledte fibroblaster4,5. Hyaluronsyre (HA)-baserede hydrogelmaskrømme giver brugerdefinerbar og biologisk relevant støtte til begge celletyper med letkøbskontrol over hydrogelegenskaber og optisk klarhed for billeddannelse gennem hydrogeldybden6.
Ældre PDX tumorvæv omfatter en variabel blanding af heterogene humane kræftceller og mus stroma (fibroblaster, endotelceller, osv.). At studere celle-type specifikke bidrag til tumor progression in vitro, Det kan være en fordel at adskille tumorer, adskille cellepopulationer, og eksperimentelt indarbejde dem på en organiseret måde at dissekere veje intercellulære kommunikation. De blandede cellepopulationer i vævsgravere har differentialkompatibilitet med specifikke kulturbetingelser. For eksempel, tumor-associeret fibroblast levedygtighed kræver enten overflade tilslutning eller 3D matricer funktionaliseret med integrin ligands, mens epitel-afledte PDX celler ikke typisk har disse krav, i stedet favorisere celle-celle interaktioner. Disse forskelle kan udnyttes til at opnå effektiv adskillelse af PDX celler fra forurenende mus stromale celler. Rotationskultur af vævssideestater gør det muligt at danne stromale celletilhold til vævskulturoverfladen, mens cellecellevoksninger driver PDX-celler, der flyder over den roterende kulturoverflade for at danne flercellede klynger i supernatanten i 24-48 h. Disse klyngers særlige karakteristika varierer med PDX (f.eks. store, stramme, meget sfæriske klynger eller mindre, løsere aggregater, der ligner bundter af druer), men er typisk af biologisk relevante størrelser (50-250 μm diameter), der er tilstrækkelige til at vurdere cellulære interaktioner, der er afhængige af intercellulære kontakter.
Tumor hentning og behandling uundgåeligt resulterer i en vis grad af sikkerhedsstillelse celledød, enten på grund af kortsigtede skader fra mekanisk / enzymatisk forstyrrelser, eller langsigtet uforenelighed af delpopulationer med de valgte kulturbetingelser. På trods af nytten af rotation kultur som en indledende bulk adskillelse, døde eller døende celler er uundgåeligt overføres med PDX klynger og kan påvirke den deraf følgende kultur. Disse døde celler er ofte individuelle PDX celler, der ikke var integreret i en klynge, mus stromale fibroblaster, der ikke kan overleve i udvalgte kulturbetingelser, eller særligt skrøbelige endotelceller. Sådanne døende celler kan påvirke eksperimentelle resultater fra "overlevende" og kan i væsentlig grad påvirke kvantificering, f.eks. For at forbedre udvælgelsen af levende PDX-celler fra denne metode tilpassede vi centrifugeringsmetoder med tæthedstrin for nemt at fjerne individuelle døde/døende celler fra PDX-blandinger og bevare overvejende levende flercellede klynger.
For at forbedre studiet af resulterende PDX-afledte klynger i 3D-kultur, vi udnyttede en microfluidics-baserede perfusion kultur platform, OrganoPlate (Figur 1), som er en høj-throughput organ-on-a-chip platform, der giver mulighed for samtidig kultur på op til 96 individuelle perfunderes, 3D kulturer på en 384-godt microtiter plade-base (Figur 1A)7,8. I den 2-lane mikrofluidic plade, en enkelt væv chip er forbundet med to microfluidic kanaler(Figur 1B,gel kanal: rød, perfusion kanal: blå), som spænder over fire brønde i træk. De to mikrofluidiske kanaler er adskilt af en kort plastik højderyg kaldet en Phaseguide, som forhindrer overløb af en kanal i sin tilstødende nabo kanal, og samtidig giver mulighed for en membran-fri grænseflade mellem indholdet af gel og perfusion kanal9. Fordi bunden af mikrofluidic plade er sammensat af mikroskop-grade glas, kan kulturerne ses i observationsvinduet gennem bunden af pladen med en standard eller automatiseret mikroskop. Perfusion er etableret i den mikrofluidiske plade med en programmerbar rocker, ved hjælp af tyngdekraften til at drive medier gennem de mikrofluidiske kanaler, mellem reservoir brønde (Figur 1C). Den perfusion flow-efterligner tættere opsummerer tumor mikromiljø end statisk kultur, giver mulighed for inkorporering af forskydningsstress og forbedret fordeling af gasser og næringsstoffer. Fordelene ved at opretholde en perfunderet kræftcellekultur i mikrofluidic-pladen er tidligere blevet beskrevet som perfunderes brystkræft kulturer udstillet optimal levedygtighed i forhold til en statisk 3D-kultur af de samme celler7.
Denne rapport beskriver en tilpasset tæthedsgradientcentrifugeringsmetode til isolering af levende flercellede PDX-klynger og demonstrerer dens anvendelighed til at etablere 3D PDX-kulturer inden for perfusable mikrofluidiske plader. Fordi et stigende antal forskningslaboratorier søger metoder til at lette PDX brug, forventer vi, at de protokoller, der præsenteres her, vil være af umiddelbar nytte.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:812px;" width="812">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">1N NaOH</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td style="width:224px;">any suitable tissue culture grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">60 mm round tissue culture dishes</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td>any suitable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">6-well tissue culture plates</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td>any suitable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">70 &#181;m cell strainers</td>
			<td style="width:148px;">Corning</td>
			<td style="width:189px;">431751</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:251px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:148px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:189px;">5810R with suitable rotor and buckets for 15/50 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Density gradient centrifugation solution</td>
			<td style="width:148px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:189px;">P1644</td>
			<td>Percoll</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Dimethylsulfoxide</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td>any suitable tissue culture grade</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Dissociation enzyme solution</td>
			<td style="width:148px;">StemCell Technologies</td>
			<td style="width:189px;">07921</td>
			<td style="width:224px;">ACCUMAX</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">DMEM-F12</td>
			<td style="width:148px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:189px;">11039021</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Forceps</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td>any suitable</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">HA hydrogel kit</td>
			<td style="width:148px;">ESI BIO</td>
			<td style="width:189px;">GS311</td>
			<td style="width:224px;">HyStem (Hyaluronic acid-SH and PEGDA)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Hanks Balanced Salt Solution</td>
			<td style="width:148px;">Lonza</td>
			<td style="width:189px;">10-527F</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Heat-inactivated fetal bovine serum</td>
			<td style="width:148px;">Atlanta Biologicals</td>
			<td style="width:189px;">S11150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Hemocytometer</td>
			<td style="width:148px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:189px;">02-671-51B Hausser BrightLine</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Hoechst 33342</td>
			<td style="width:148px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:189px;">H1398</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Image processing software</td>
			<td style="width:148px;">Oxford Instruments</td>
			<td style="width:189px;">Imaris 9.3</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:251px;">LIVE/DEAD Cell Viability/Cytotoxicity Kit (Calcein-AM/Ethidium Homodimer-1)</td>
			<td style="width:148px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:189px;">L3224</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Microfluidic culture plate</td>
			<td style="width:148px;">Mimetas</td>
			<td style="width:189px;">9603-400-B</td>
			<td>2-lane OrganoPlate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Microscope</td>
			<td style="width:148px;">Nikon</td>
			<td style="width:189px;">A1R</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="68">
			<td height="68" style="height:68px;width:251px;">Multichannel pipette</td>
			<td style="width:148px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:189px;">3125000036</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:251px;">PDX-derived tumor tissue</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td style="width:224px;">obtained under IRB approval for human tissue and IACUC approval for animal host</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Penicillin-streptomycin</td>
			<td style="width:148px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:189px;">15140-122</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Perfusion rocker</td>
			<td style="width:148px;">Mimetas</td>
			<td style="width:189px;">OrganoPlate Perfusion Rocker Mini</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">pH strips (pH 5-9)</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td>any suitable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Phosphate-buffered saline solution</td>
			<td style="width:148px;">Lonza</td>
			<td style="width:189px;">17-516F</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Razor blades</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td>any suitable</td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;width:251px;">Rotating xy-shaker</td>
			<td style="width:148px;">VWR</td>
			<td style="width:189px;">Advanced 3500 Orbital Shaker</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Scalpel handle</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td>any suitable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Single channel repeating pipette</td>
			<td style="width:148px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:189px;">22260201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Sterile, 15mL conical centrifuge tubes</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td>any suitable</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Sterile, 50mL conical centrifuge tubes</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td>any suitable</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

enhanced viability for ex vivo 3d hydrogel cultures of patient-derived xenografts in a perfused microfluidic platform

Patient-afledte xenografts (PDX), genereret, når resected patient tumorvæv er indskrevet direkte i immunkompromitterede mus, forblive biologisk stabil, og dermed bevare molekylære, genetiske, og histologiske træk, samt heterogenitet af den oprindelige tumor. Men ved hjælp af disse modeller til at udføre en lang række eksperimenter, herunder narkotika screening, er uoverkommelige både med hensyn til omkostninger og tid. Tre-dimensionelle (3D) kultursystemer er bredt betragtet som platforme, hvor kræftceller bevarer deres biologiske integritet gennem biokemiske interaktioner, morfologi, og arkitektur. Vores team har stor erfaring med at dyrke PDX-celler in vitro ved hjælp af 3D-matricer, der består af hyaluronsyre (HA). For at adskille musefibroblast stromale celler forbundet med PDX'er, bruger vi rotationskultur, hvor stromale celler klæber til overfladen af vævskulturbehandlede plader, mens dissocierede PDX-tumorceller flyder og forbinder sig selv i flercellede klynger. Også flydende i supernatant er enkelt, ofte døde celler, som udgør en udfordring i indsamlingen levedygtige PDX klynger til downstream indkapsling i hydrogels for 3D-celle kultur. For at adskille disse enkelte celler fra levende celle klynger, har vi ansat densitet trin gradient centrifugering. Den protokol, der er beskrevet her, giver mulighed for udtømning af ikke-levedygtige enkeltceller fra den sunde population af celleklynger, der vil blive brugt til yderligere in vitro-eksperimenter. I vores undersøgelser inkorporerer vi 3D-kulturer i mikrofluidiske plader, som giver mulighed for medieperfusion under kulturen. Efter at have vurderet de resulterende kulturer ved hjælp af en fluorescerende billedbaseret levedygtighedsanalyse af renset versus ikke-rensede celler, viser vores resultater, at dette yderligere adskillelsestrin reducerede antallet af ikke-levedygtige celler fra vores kulturer betydeligt.

En programmerbar perfusion rocker blev udarbejdet i en standard vand-jacked celle kultur inkubator, og to-sporet mikrofluidic plader blev udarbejdet i en standard biosikkerhed kabinet til lastning (Figur 1). En MDA-PCA-118b PDX tumor blev udvidet in vivo, høstet, når den havde nået en maksimal størrelse, og dissocieret som beskrevet i protokol afsnit 2 for at skabe en gylle suspension af celler, på ca en enkelt celle tilstand (Figur 2A). Gyllen blev udskrev...

Watch this Scientific Journal Video about Enhanced Viability for Ex vivo 3D Hydrogel Cultures of Patient-Derived Xenografts in a Perfused Microfluidic Platform at JoVE.com

Enhanced Viability for Ex vivo 3D Hydrogel Cultures of Patient-Derived Xenografts in a Perfused Microfluidic Platform

Denne protokol demonstrerer metoder til at muliggøre udvidet in vitro-kultur af patientafledte xenografts (PDX). Et skridt øger den samlede levedygtighed af flercellede klyngekulturer i 3D-hydrogels ved simpel fjernelse af ikke-levedygtige enkeltceller. Et sekundært trin demonstrerer bedste praksis for PDX-kultur i en perfunderet mikrofluidisk platform.

Forbedret levedygtighed for Ex vivo 3D Hydrogel Kulturer af patient-afledte Xenografts i en perfunderet microfluidic platform

Patient-derived xenografts (PDX), generated when resected patient tumor tissue is engrafted directly into immunocompromised mice, remain biologically ...

Forbedrede kultur metoder til patient-afledte tumorprøver er afgørende vigtigt, da feltet bevæger sig væk fra brugen af konventionelle cellelinjer. Denne protokol giver mulighed for in vitro kultur af patient-afledte tumorceller i en platform, der er modtagelig for høj gennemløb og højt indhold screening, i modsætning til in vivo kræft modeller. Platformen indarbejde PDXs giver os mulighed for at vurdere mere heterogene systemer afspejler indfødte tumorer.Dette kan give indsigt i narkotika mekanismer og give mulighed for hurtigere narkotika screening. Metoden kunne udvides gennem inkorporering af stroma, endotel, og immunceller. Disse co-kulturer kunne være endnu mere reflekterende af den indfødte tumor befolkning og arkitektur.Øv dig i at indlæse mikrofluidiske plader med letudbytende cellelinjer for at blive meget dygtige, før du skifter til mere dyrebare celler som PDX'er. Til at begynde, overføre tumorvæv til en forvejet steril 50-milliliter konisk rør.Skyl seks gange med 30 milliliter steril PBS for at fjerne blod og forurenende stoffer. Fjern så meget væske som muligt, og veje tumorvæv. Overfør tumorvævet til en 60-millimeter rund vævskulturskål, og brug et sterilt barberblad eller en skalpel til at hakke det i en millimeter stykker.Tilføj fem milliliter PDX forarbejdning medium til at indsamle tumor gylle. Tilføj fem milliliter dissociation enzymopløsning til at indsamle tumor gylle. Skyl kulturskålen med yderligere fem milliliter dissociationsenzymopløsning.Derefter tilsættes fem milliliter PDX-behandlingsmedium. Inkuber 20 minutter ved 37 grader Celsius med blid omrystning. Halvvejs gennem inkubationstiden hvirvles røret forsigtigt.Efter inkubation, pipette op og ned forsigtigt med en serologisk pipette til at bryde op klumper. Placer en 70-mikron celle si over en ny steril 50-milliliter rør, og filtrere cellerne. Derefter centrifuge ved 1, 200 rpm i to minutter til pellet cellerne.Fjern supernatanten og resuspendret i to til tre milliliter PDX kultur medium. Tæl cellerne ved hjælp af et hæmocytometer eller en automatiseret celletæller. Brug denne tabel til at anslå det nødvendige antal tilknyttede PDX-afledte celler, der er nødvendige for at opnå den ønskede celletæthed pr. chip.Plade en til to gange 10 til de seks celler i fem milliliter PDX kultur medium pr brønd af en seks-godt væv kultur plade. Inkubere i 48 timer ved 37 grader Celsius, 5% kuldioxid, og 95% fugtighed med blid omrystning på 50 til 55 rpm for at fremme klyngedannelse. Når klyngerne er dannet, skal du fortsætte til centrifugering.Der tilberedes først 20 milliliter 100% tæthedsgradientopløsning ved grundigt at blande 18 milliliter densitetsgradientatoriske centrifugeringsopløsning med to milliliter steril 10X HBSS i et sterilt 50 milliliter konisk rør. Denne 100%-opløsning fortyndes med sterile 1X HBSS for at lave 10 milliliter hver af 20%30%40% og 55% tæthedsgradientopløsninger. Der tilsættes tre milliliter 55% tæthedsgradientopløsning til bunden af et 15-milliliter konisk rør.Hold røret i en vinkel, langsomt dispensere tre milliliter af 40% tæthed gradient opløsning på den vinklede side af røret og på toppen af 55%lag. Gentag med forløbsløsningen på 30 %tæthed. Derefter indsamles supernatanten af PDX rotationskulturer med en fem milliliter serologisk pipette i et rør, der skyller pladeoverfladen forsigtigt.Centrifuge ved 1, 200 rpm i to minutter til pellet celler. Fjern supernatanten, og opsplit cellepellet i tre milliliter 20% tæthedsgradientopløsning. Lag omhyggeligt 20%tæthedsgradienten med celler på toppen af gradienten i 15-milliliterrøret.Cap rørene og centrifuge i en swing-spand rotor centrifuge 30 minutter ved fire grader Celsius, 2, 000 gange G, og nul pause. Efter centrifugering er brøker synlige. Levedygtige PDX-cellekulturer findes typisk på grænsefladen 40 til 55 % tæthedsgradient solution.Opsaml to til tre milliliter af hver fraktion i friske 15-milliliterrør. Tilføj tre til fire bind af sterile 1X HBSS til hver fraktion, og invertere til at blande grundigt. Centrifuge ved 1,000 gange G i tre minutter for at pellet cellerne.Fjern supernatanten. Opsplitning af cellepillerne i en til to milliliter PDX-behandlingsmedium. Overfør en lille aliquot mellem 50 til 100 mikroliter i et rør, og tilsæt en tilsvarende volumen af dissociation enzymopløsning til genissociation.Vurder cellenummeret i klyngecellesuspensionen. Tæl cellerne med et hæmocytometer eller en automatiseret celletæller. Rekonstituere hyaluronsyre hydrogel løsninger i henhold til producentens anvisninger.Ved hjælp af en multi-kanal pipette, tilføje 50 mikroliter af HBSS til alle brønde i observation vindue kolonner af en to-sporet microfluidic plade for at opretholde kultur fugtighed og optimale billeddannelse betingelser. Beregn mængden af celleaffjedring, der er nødvendig for 50 mikroliter hydrogel ved den ønskede celletæthed, f.eks. Til såning af en mikrofluidisk plade skal det beregnede volumen anbringes i hver af de fire sterile 1,5 millilitercentrifugerør.HA-thiolopløsningens pH-værdi justeres til otte med 1 normal natriumhydroxid umiddelbart før brug. Udfør en testgelsering ved at blande 40 mikroliter HA thiol med 10 mikroliter PEGdA og overvågning af gelering over tid. Dernæst centrifuge celle suspension aliquots i to minutter ved 200 gange G og stuetemperatur til pellet cellerne.Fjern forsigtigt supernatanten, og opslæm cellerne i 40 mikroliter AF HA thiol for en 50-mikroliter endelige volumen. Tilsæt 10 mikroliter AF PEGdA til en aliquot af cellerne i HA thiol. Bland godt, og vent et til tre minutter, før såning af mikrofluidic plade.Sæt en spids til dispensering af 1,5 mikroliter på en enkeltkanals gentagende pipette, og indlæs med cellerne i HA-hydrogelopløsning. Husk at holde brint aliquot godt blandet for at sikre jævn cellefordeling. For at sætte mikrofluidicpladen justeres pipettens tip vinkelret på klingen, mens spidsen forsigtigt anbringes i midten af gelindgangen for at sikre kontakt, men intet tryk, når der dispenseres 1,5 mikroliter hydrogelopløsning.Overhold fyldstatus for de mikrofluidiske kanaler ved at se fra toppen af pladen, bunden af pladen eller ved mikroskop. Vurder lastningen ved hjælp af dette tal som en vejledning. Det ene minut efter belastningen skal pladen vendes, mens du forbereder den næste prøve.Der gentages såning af mikrofluidpladen for de resterende tre aliquots af celler i HA-opløsning. Når alle chips er fyldt, inkubere pladen ved 37 grader Celsius i en befugtet inkubator 45 minutter, indtil geleringen er færdig. Efter dette, ved hjælp af manualen forudsat, sikre perfusion rocker er installeret i cellekultur inkubator med den korrekte overflod indstilling på 14-graders vinkel og fire minutters intervaller.Tilføj 50 mikroliter PDX cellekultur medium til alle mellemstore indløb. Bank forsigtigt pladen mod en overflade for at tilskynde væsken til at fylde mikrofluiderne. Vend derefter pladen for at kontrollere, om kanalerne er fyldt korrekt.Tilføj 50 mikroliter DMEM/F-12 til alle medier. Hvis der fanges luftbobler i perfusionskanalen, skal du fjerne dem ved at trykke forsigtigt af pladen mod en overflade. Ved hjælp af et mikroskop og plade layout form, optage chip påfyldning succes.Udeluk forkert fyldte chips fra yderligere eksperimentel brug. Placer pladen på en vippende rocker indstillet til en 14-graders hældning og en fire-minutters cyklus for at begynde perfusion. Hver anden dag skal DU udskifte PDX-kulturmediet, først 50 mikroliter i fjordene, derefter 50 mikroliter i stikkontakterne.I denne undersøgelse, en programmerbar perfusion rocker blev installeret i en standard vand-jacketed cellekultur inkubator, og to-sporet mikrofluidiske vinger blev udarbejdet i en standard biosikkerhed kabinet til lastning. 3D microfluidic PDX kultur levedygtighed og morfologi blev evalueret i både unseparated og tæthed-gradient centrifugering-adskilt betingelser. På dag ét udviste de kulturer, der gennemgik separationsmetoden, tigange færre døde celler sammenlignet med uparerede kulturer.Det er vigtigt, at de adskilte klynger primært bestod af levende celler. Der blev ikke identificeret nogen statistisk signifikant forskel for klyngestørrelsesfordelingen. Kulturer blev yderligere opretholdt i mikrofluidic plade i syv dage.Det samlede antal levende celler forblev konsistente, og klynger bevarede ca. 80 % levedygtighed i kulturens levetid. Husk, at hver PDX linje er unik, så den lethed af tumor fordøjelsen, fænotopisk størrelse og morfologi af klynger, og klyngen placering inden for gradient rensning vil variere. PDX kulturer etableret ved hjælp af denne metode kan analyseres med billede-eller plade-læser-baserede levedygtighed assays, faste og immunofluorescerende mærket, eller dissocieret til at indsamle celle lysater for andre protokoller.Metoden vil give forskerne mulighed for at opsummere tumor mikromiljø for at udforske biologi eller lægemiddelreaktion af tumorceller. Brugerne bør gennemføre standarduddannelse af humane forsøgspersoner og blodbårne patogener, inden de arbejder med humant afledt væv. Der skal bæres passende personlige værnemidler.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Labeling of Breast Cancer Patient-derived Xenografts with Traceable Reporters for Tumor Growth and Metastasis Studies

Mærkning af Breast Cancer Patient-afledte Xenografter med Sporbare Journalister for tumorvækst og Metastase Studies

The use of preclinical models to study tumor biology and response to treatment is central to cancer research. Long-established human cell lines, and many ...

Isolation and Characterization of Tumor-initiating Cells from Sarcoma Patient-derived Xenografts

Isolering og karakterisering af tumor initierende celler fra sarkom patient afledte Xenografts

The existence and importance of tumor-initiating cells (TICs) have been supported by increasing evidence during the past decade. These TICs have been ...

Fluorescence Molecular Tomography for In Vivo Imaging of Glioblastoma Xenografts

Fluorescence Molecular Tomography for In Vivo Imaging of Glioblastoma Xenografts

Fluorescens molekylære tomografi for In Vivo billeddannelse af glioblastom Xenografts

Tumorigenicity is the capability of cancer cells to form a tumor mass. A widely used approach to determine if the cells are tumorigenic is by injecting ...

Patient-derived Heterogeneous Xenograft Model of Pancreatic Cancer Using Zebrafish Larvae as Hosts for Comparative Drug Assessment

Patient-afledt heterogene xenograft model af kræft i bugspytkirtlen ved hjælp af Zebrafish larver som værter for sammenlignende Lægemiddelvurdering

Patient-derived tumor xenograft (PDX) and cell-derived tumor xenograft (CDX) are important techniques for preclinical assessment, medication guidance and ...

Physiologic Patient Derived 3D Spheroids for Anti-neoplastic Drug Screening to Target Cancer Stem Cells

Fysiologisk patient afledte 3D Sfæroider til anti-neoplastisk Drug screening for at målrette kræft stamceller

In this protocol, we outline the procedure for generation of tumor spheroids within 384-well hanging droplets to allow for high-throughput screening of ...

Assessing Cell Viability and Death in 3D Spheroid Cultures of Cancer Cells

Vurdering cellelevedygtighed og død i 3D Spheroid kulturer af kræftceller

Three-dimensional spheroids of cancer cells are important tools for both cancer drug screens and for gaining mechanistic insight into cancer cell biology. ...

Establishment of Gastric Cancer Patient-derived Xenograft Models and Primary Cell Lines

Etablering af gastrisk Cancer patient afledte xenograft-modeller og primære cellelinjer

The use of preclinical models to advance our understanding of tumor biology and investigate the efficacy of therapeutic agents is key to cancer research. ...

Testing Targeted Therapies in Cancer using Structural DNA Alteration Analysis and Patient-Derived Xenografts

Test målrettede behandlinger i kræft ved hjælp af strukturel dna ændringsanalyse og patient-afledte Xenografts

We present here an integrative approach for testing efficacy of targeted therapies that combines the next generation sequencing technolo-gies, therapeutic ...

Drug Screening of Primary Patient Derived Tumor Xenografts in Zebrafish

Drug Screening af primære patient afledt tumor xenografts i Zebrafish

Patient derived xenograft models are critical in defining how different cancers respond to drug treatment in an in vivo system. Mouse models are the ...

Patient-Derived Tumor Explants As a "Live" Preclinical Platform for Predicting Drug Resistance in Patients

Patient-afledt tumor explants som en "Live" præklinisk platform til forudsigelse af resistens hos patienter

An understanding of drug resistance and the development of novel strategies to sensitize highly resistant cancers rely on the availability of suitable ...