Name: enhanced viability for ex vivo 3d hydrogel cultures of patient-derived xenografts in a perfused microfluidic platform
Uploaded: 2020-12-05T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Enhanced Viability for Ex vivo 3D Hydrogel Cultures of Patient-Derived Xenografts in a Perfused Microfluidic Platform at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door National Institutes of Health National Cancer Institute SBIR Fase I (HHSN26120700015C) en P01CA098912.

Tumorweefsel werd verkregen met toestemming van de patiënt en volgens een goedgekeurd Institutional Review Board (IRB) protocol. Xenografts werden geïmplanteerd, geteeld en geoogst volgens een geaccepteerd Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) protocol.
OPMERKING: Alle werkzaamheden moeten worden uitgevoerd in een steriele biologische veiligheidskast om de steriliteit te behouden. Alle stappen moeten worden uitgevoerd bij kamertemperatuur, tenzij anders bepaald.
<p class="j...

<ol>
	<li>Jung, J., Seol, H. S., Chang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Generation+and+Application+of+Patient-Derived+Xenograft+Model+for+Cancer+Research.">The Generation and Application of Patient-Derived Xenograft Model for Cancer Research.</a> Cancer Research and Treatment: Official Journal of Korean Cancer Association. 50 (1), 1-10 (2018).</li><li>Malaney, P., Nicosia, S. V., Dave, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One+mouse,+one+patient+paradigm:+New+avatars+of+personalized+cancer+therapy.">One mouse, one patient paradigm: New avatars of personalized cancer therapy.</a> Cancer Letters. 344 (1), 1-12 (2014).</li><li>Meehan, T. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PDX-MI:+Minimal+Information+for+Patient-Derived+Tumor+Xenograft+Models.">PDX-MI: Minimal Information for Patient-Derived Tumor Xenograft Models.</a> Cancer Research. 77 (21), 62-66 (2017).</li><li>Fong, E. L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogel-Based+3D+Model+of+Patient-Derived+Prostate+Xenograft+Tumors+Suitable+for+Drug+Screening.">Hydrogel-Based 3D Model of Patient-Derived Prostate Xenograft Tumors Suitable for Drug Screening.</a> Molecular Pharmaceutics. 11 (7), 2040-2050 (2014).</li><li>Fong, E. L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+3D+in+vitro+model+of+patient-derived+prostate+cancer+xenograft+for+controlled+interrogation+of+in+vivo+tumor-stromal+interactions.">A 3D in vitro model of patient-derived prostate cancer xenograft for controlled interrogation of in vivo tumor-stromal interactions.</a> Biomaterials. 77, 164-172 (2016).</li><li>Engel, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyaluronic+Acid-Based+Hydrogel+Formulations+Suitable+for+Automated+3D+High+Throughput+Drug+Screening+of+Cancer-Stromal+Cell+Cocultures.">Hyaluronic Acid-Based Hydrogel Formulations Suitable for Automated 3D High Throughput Drug Screening of Cancer-Stromal Cell Cocultures.</a> Advanced Healthcare Materials. 4 (11), 1664-1674 (2015).</li><li>Lanz, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapy+response+testing+of+breast+cancer+in+a+3D+high-throughput+perfused+microfluidic+platform.">Therapy response testing of breast cancer in a 3D high-throughput perfused microfluidic platform.</a> BMC Cancer. 17 (1), 709 (2017).</li><li>Wevers, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+compound+evaluation+on+3D+networks+of+neurons+and+glia+in+a+microfluidic+platform.">High-throughput compound evaluation on 3D networks of neurons and glia in a microfluidic platform.</a> Scientific Reports. 6, 38856 (2016).</li><li>Vulto, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phaseguides:+a+paradigm+shift+in+microfluidic+priming+and+emptying.">Phaseguides: a paradigm shift in microfluidic priming and emptying.</a> Lab on a Chip. 11 (9), 1596-1602 (2011).</li><li>Patru, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD133,+CD15/SSEA-1,+CD34+or+side+populations+do+not+resume+tumor-initiating+properties+of+long-term+cultured+cancer+stem+cells+from+human+malignant+glio-neuronal+tumors.">CD133, CD15/SSEA-1, CD34 or side populations do not resume tumor-initiating properties of long-term cultured cancer stem cells from human malignant glio-neuronal tumors.</a> BMC Cancer. 10, 66 (2010).</li><li>Harma, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+panel+of+three-dimensional+models+for+studies+of+prostate+cancer+growth,+invasion+and+drug+responses.">A comprehensive panel of three-dimensional models for studies of prostate cancer growth, invasion and drug responses.</a> PLoS One. 5 (5), 10431 (2010).</li></ol>

Hier beschrijven we een methode voor het verwerken en kweken van levensvatbare PDX-afgeleide tumorcellen in een hoge doorvoer, geperfuseerd 3D-kweeksysteem. Hoewel dit protocol pca PDX-weefsel gebruikt, is het even effectief voor andere epitheliale tumoren. Tumorkenmerken variëren tussen individuele PDX-lijnen, zelfs binnen hetzelfde weefsel van oorsprong (prostaat, borst, enz.). Sommige PCa PDX lijnen zijn meer fibrotische en moeilijk te isoleren levensvatbare cellen uit, terwijl anderen zijn meer cellulaire. De tumor ...

In de afgelopen tien jaar heeft het gebied van kankeronderzoek aangetoond hernieuwde enthousiasme voor patiënt-afgeleide xenografts (PDXs) als een instrument voor de beoordeling van kankercel traject afhankelijkheid en drug gevoeligheid1. De meest voorkomende PDX-modellen worden vastgesteld door onderhuidse of orthotopische implantatie van menselijke tumorcellen - een tumorfragment, een cluster van gescheiden tumorcellen of een monster van geïsoleerde circulerende tumorcellen (CTC's) -in een knaagdierhost. Als de tumor "nemen" succesvol is, zullen de xenograft cellen zich vermenigvuldigen, vasculariseren en anderszins interageren met het gastheerweefsel om een tumor te creëren, die kan worden geoogst op een optimale grootte, onderverdeeld en opnieuw geïmplanteerd in andere gastheren. Onder hun vele voordelen als modelsysteem behouden PDX's doorgaans een aanzienlijk deel van de heterogeniteit van de inheemse tumorcelpopulatie en maken het de beoordeling van mensspecifieke trajecten en celreactiesmogelijk 2,3. De in vivo context maakt tumorinteractie met vasculatuur en andere aangrenzende stroma mogelijk en recapituleert weefselkenmerken zoals drugsdiffusiedynamiek, zuurstofspanning en extracellulaire matrix die de progressie van de tumor biologisch en mechanisch beïnvloeden. Een negatief aspect van PDXs is hun afhankelijkheid van een knaagdier gastheer, zowel voor tumor expansie en uiteindelijk voor hypothese testen. Omdat veel PDX's zich niet kunnen aanpassen aan de traditionele tweedimensionale (2D)-cultuur op weefselkweek polystyreen zonder veel van hun wenselijke kenmerken te verliezen, is er een minimale middenweg voor onderzoekers tussen deze relatief gecontroleerde in vitro-methode en de aanzienlijke toename van de kosten, faciliteiten en tijdsvereisten voor in vivo PDX-gebruik.
We hebben meerdere in vitro modellen beschreven die 3D-celcultuur implementeren binnen een ondersteunende matrix, en onlangs uitgebreid dat werk aan te tonen de ex vivo cultuur van meervoudige prostaatkanker (PCa)-afgeleide PDX's, zowel alleen als in co-cultuur met beenmerg-afgeleide fibroblasten4,5. Hyaluronzuur (HA)-gebaseerde hydrogelmatrices bieden aanpasbare en biologisch relevante ondersteuning voor beide celtypen, met facile controle over hydrogelkenmerken en optische helderheid voor beeldvorming door de hydrogeldiepte6.
Volwassen PDX tumorweefsels bestaan uit een variabel mengsel van heterogene menselijke kankercellen en muisstroma (fibroblasten, endotheelcellen, enz.). Om cel-type specifieke bijdragen aan tumorprogressie in vitro te bestuderen, kan het voordelig zijn om tumoren te scheiden, de celpopulaties te scheiden en experimenteel op een georganiseerde manier op te nemen om trajecten van intercellulaire communicatie te ontleden. De gemengde celpopulaties in weefselvertgates hebben differentiële compatibiliteit met specifieke kweekomstandigheden. Bijvoorbeeld, tumor-geassocieerde fibroblast levensvatbaarheid vereist ofwel oppervlak aanhankelijkheid of 3D matrices gefunctionaliseerd met integrin liganden, terwijl epitheel-afgeleide PDX cellen hebben meestal niet deze eisen, in plaats daarvan ten gunste van celcel interacties. Deze verschillen kunnen worden benut om een effectieve scheiding van PDX-cellen van besmettende muisstromalcellen te bereiken. Rotatiecultuur van weefselvert verteert maakt stromale celtrouw aan het weefselkweekoppervlak mogelijk, terwijl celcelverklevingen PDX-cellen drijven die boven het roterende kweekoppervlak zweven om meercellige clusters in het supernatant te vormen in 24−48 uur. De specifieke kenmerken van deze clusters variëren met de PDX (bijvoorbeeld grote, strakke, zeer bolvormige clusters of kleinere, lossere aggregaten die lijken op trossen druiven), maar zijn meestal van biologisch relevante afmetingen (50−250 μm diameter), voldoende voor het beoordelen van cellulaire interacties die afhankelijk zijn van intercellulaire contacten.
Tumor retrieval en verwerking onvermijdelijk resulteert in een zekere mate van collateral cell dood, hetzij als gevolg van schade op korte termijn van mechanische / enzymatische verstoring, of op lange termijn onverenigbaarheid van subpopulaties met de gekozen cultuur voorwaarden. Ondanks het nut van rotatiecultuur als eerste bulkscheiding, worden dode of stervende cellen onvermijdelijk overgebracht met de PDX clusters en kunnen de resulterende cultuur beïnvloeden. Deze dode cellen zijn vaak individuele PDX cellen die niet werden geïntegreerd in een cluster, muis stromale fibroblasten die niet kunnen overleven in geselecteerde cultuuromstandigheden, of bijzonder fragiele endotheelcellen. Dergelijke stervende cellen kunnen experimentele resultaten van "overlevenden" beïnvloeden en kunnen een aanzienlijke invloed hebben op kwantificering, bijvoorbeeld via fluorescerende op beelden gebaseerde screeningtesten op basis van beeld. Om de selectie van levende PDX-cellen uit deze methode te verbeteren, hebben we centrifugatiemethoden aangepast met dichtheidsstappen om individuele dode/stervende cellen gemakkelijk te verwijderen uit PDX-mengsels en overwegend levende meercellige clusters te behouden.
Om de studie van resulterende PDX-afgeleide clusters in de 3D-cultuur te verbeteren, hebben we gebruik gemaakt van een microfluidics-gebaseerde perfusiecultuurplatform, de OrganoPlate (figuur 1), een hoog-doorvoerorgaan-op-een-chip-platform dat simultane cultuur van maximaal 96 individuele perfusie, 3D-culturen op een 384-wellitert microbordbasis (Figuur 1A)7,8. In de 2-baans microfluidic plaat wordt een enkele weefselchip verbonden door twee microfluïde kanalen (Figuur 1B, gelkanaal: rood, perfusiekanaal: blauw) die vier putten op een rij omspannen. De twee microfluidic kanalen worden gescheiden door een korte plastic nok genaamd een Phaseguide die overloop van een kanaal in zijn aangrenzende buurman kanaal voorkomt, en tegelijkertijd zorgt voor een membraan-vrije interface tussen de inhoud van de gel en perfusie kanaal9. Omdat de bodem van de microfluidic plaat bestaat uit microfluïde glas, kunnen de culturen in het observatievenster via de bodem van de plaat worden bekeken met een standaard of geautomatiseerde microscoop. Perfusie is gevestigd in de microfluïde plaat met een programmeerbare rocker, met behulp van de zwaartekracht om media te rijden door de microfluïde kanalen, tussen reservoirputten (Figuur 1C). De perfusie stroom-nabootst meer samenvatten de tumor micromilieu dan statische cultuur, waardoor voor de integratie van schuifspanning en verbeterde distributie van gassen en voedingsstoffen. De voordelen van het behoud van een geperfundeerde kankercelcultuur in de microfluïde plaat zijn eerder beschreven als geperfundeerde borstkankerculturen die een optimale levensvatbaarheid vertoonden in vergelijking met een statische 3D-cultuur van dezelfde cellen7.
Het onderhavige rapport beschrijft een aangepaste dichtheidsgradiëntcentrifugatiemethode voor het isoleren van levende meercellige PDX-clusters en toont zijn nut bij het vestigen van 3D PDX-culturen binnen perfusable microfluïde platen. Omdat een toenemend aantal onderzoekslaboratoria methoden zoekt om het gebruik van PDX te vergemakkelijken, verwachten we dat de hier gepresenteerde protocollen van onmiddellijke nut zullen zijn.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:812px;" width="812">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">1N NaOH</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td style="width:224px;">any suitable tissue culture grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">60 mm round tissue culture dishes</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td>any suitable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">6-well tissue culture plates</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td>any suitable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">70 &#181;m cell strainers</td>
			<td style="width:148px;">Corning</td>
			<td style="width:189px;">431751</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:251px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:148px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:189px;">5810R with suitable rotor and buckets for 15/50 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Density gradient centrifugation solution</td>
			<td style="width:148px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:189px;">P1644</td>
			<td>Percoll</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Dimethylsulfoxide</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td>any suitable tissue culture grade</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Dissociation enzyme solution</td>
			<td style="width:148px;">StemCell Technologies</td>
			<td style="width:189px;">07921</td>
			<td style="width:224px;">ACCUMAX</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">DMEM-F12</td>
			<td style="width:148px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:189px;">11039021</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Forceps</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td>any suitable</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">HA hydrogel kit</td>
			<td style="width:148px;">ESI BIO</td>
			<td style="width:189px;">GS311</td>
			<td style="width:224px;">HyStem (Hyaluronic acid-SH and PEGDA)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Hanks Balanced Salt Solution</td>
			<td style="width:148px;">Lonza</td>
			<td style="width:189px;">10-527F</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Heat-inactivated fetal bovine serum</td>
			<td style="width:148px;">Atlanta Biologicals</td>
			<td style="width:189px;">S11150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Hemocytometer</td>
			<td style="width:148px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:189px;">02-671-51B Hausser BrightLine</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Hoechst 33342</td>
			<td style="width:148px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:189px;">H1398</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Image processing software</td>
			<td style="width:148px;">Oxford Instruments</td>
			<td style="width:189px;">Imaris 9.3</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:251px;">LIVE/DEAD Cell Viability/Cytotoxicity Kit (Calcein-AM/Ethidium Homodimer-1)</td>
			<td style="width:148px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:189px;">L3224</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Microfluidic culture plate</td>
			<td style="width:148px;">Mimetas</td>
			<td style="width:189px;">9603-400-B</td>
			<td>2-lane OrganoPlate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Microscope</td>
			<td style="width:148px;">Nikon</td>
			<td style="width:189px;">A1R</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="68">
			<td height="68" style="height:68px;width:251px;">Multichannel pipette</td>
			<td style="width:148px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:189px;">3125000036</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:251px;">PDX-derived tumor tissue</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td style="width:224px;">obtained under IRB approval for human tissue and IACUC approval for animal host</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Penicillin-streptomycin</td>
			<td style="width:148px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:189px;">15140-122</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Perfusion rocker</td>
			<td style="width:148px;">Mimetas</td>
			<td style="width:189px;">OrganoPlate Perfusion Rocker Mini</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">pH strips (pH 5-9)</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td>any suitable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Phosphate-buffered saline solution</td>
			<td style="width:148px;">Lonza</td>
			<td style="width:189px;">17-516F</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Razor blades</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td>any suitable</td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;width:251px;">Rotating xy-shaker</td>
			<td style="width:148px;">VWR</td>
			<td style="width:189px;">Advanced 3500 Orbital Shaker</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Scalpel handle</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td>any suitable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Single channel repeating pipette</td>
			<td style="width:148px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:189px;">22260201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Sterile, 15mL conical centrifuge tubes</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td>any suitable</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Sterile, 50mL conical centrifuge tubes</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td>any suitable</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

enhanced viability for ex vivo 3d hydrogel cultures of patient-derived xenografts in a perfused microfluidic platform

Patiënt-afgeleide xenografts (PDX), gegenereerd wanneer resected patiënt tumorweefsel rechtstreeks wordt geënt in immuungecompromitteerde muizen, blijven biologisch stabiel, waardoor het behoud van moleculaire, genetische en histologische kenmerken, evenals heterogeniteit van de oorspronkelijke tumor. Echter, het gebruik van deze modellen om een veelheid van experimenten uit te voeren, met inbegrip van screening op geneesmiddelen, is onbetaalbaar, zowel in termen van kosten en tijd. Driedimensionale (3D) cultuursystemen worden algemeen gezien als platforms waarin kankercellen hun biologische integriteit behouden door middel van biochemische interacties, morfologie en architectuur. Ons team heeft uitgebreide ervaring met het kweken van PDX cellen in vitro met behulp van 3D matrices bestaande uit hyaluronzuur (HA). Om muisfiblast stromalcellen in verband met PDX's te scheiden, gebruiken we rotatiecultuur, waarbij stromale cellen zich hechten aan het oppervlak van weefselkweekbehandelde platen terwijl gescheiden PDX-tumorcellen zweven en zichzelf associëren in meercellige clusters. Ook drijvend in de supernatant zijn enkele, vaak dode cellen, die een uitdaging vormen bij het verzamelen van levensvatbare PDX-clusters voor downstream inkapseling in hydrogels voor 3D-celcultuur. Om deze enkele cellen te scheiden van levende celclusters, hebben we dichtheidsstapgradiëntcentrifugatie gebruikt. Het hier beschreven protocol zorgt voor de uitputting van niet-levensvatbare enkele cellen uit de gezonde populatie van celclusters die zullen worden gebruikt voor verdere in vitro experimenten. In onze studies nemen we de 3D-culturen op in microfluïde platen die mediaperfusie tijdens de cultuur mogelijk maken. Na de beoordeling van de resulterende culturen met behulp van een fluorescerende image-based levensvatbaarheidstest van gezuiverde versus niet-gezuiverde cellen, tonen onze resultaten aan dat deze extra scheidingsstap het aantal niet-levensvatbare cellen uit onze culturen aanzienlijk verminderde.

Een programmeerbare perfusie rocker werd bereid in een standaard water-jacked cel cultuur incubator, en twee-lane microfluïde platen werden bereid in een standaard biosafety kast voor het laden (Figuur 1). Een MDA-PCA-118b PDX tumor werd uitgebreid in vivo, geoogst wanneer het een maximale grootte had bereikt, en gescheiden zoals beschreven in protocol sectie 2 om een drijfmest suspensie van cellen te creëren, op ongeveer een eencellige toestand (Figuur 2A). D...

Watch this Scientific Journal Video about Enhanced Viability for Ex vivo 3D Hydrogel Cultures of Patient-Derived Xenografts in a Perfused Microfluidic Platform at JoVE.com

Enhanced Viability for Ex vivo 3D Hydrogel Cultures of Patient-Derived Xenografts in a Perfused Microfluidic Platform

Dit protocol toont methoden om een uitgebreide in vitro cultuur van patiënt-afgeleide xenografts (PDX) mogelijk te maken. Een stap verbetert de algehele levensvatbaarheid van meercellige clusterculturen in 3D hydrogels, door eenvoudige verwijdering van niet-levensvatbare enkele cellen. Een secundaire stap toont best practices voor PDX-cultuur in een geperfundeerd microfluïdisch platform.

Verbeterde levensvatbaarheid voor Ex vivo 3D Hydrogel Culturen van patiënt-afgeleide Xenografts in een perfused microfluïdisch platform

Patient-derived xenografts (PDX), generated when resected patient tumor tissue is engrafted directly into immunocompromised mice, remain biologically ...

Verbeterde kweekmethoden voor door patiënten afgeleide tumormonsters zijn van cruciaal belang omdat het veld zich afbeweet van het gebruik van conventionele cellijnen. Dit protocol maakt de in vitro cultuur van patiënt-afgeleide tumorcellen in een platform dat vatbaar is voor een hoge doorvoer en hoge inhoud screening, in tegenstelling tot in vivo kanker modellen. Het platform met PDXs stelt ons in staat om meer heterogene systemen te beoordelen die reflecteren op inheemse tumoren.Dit kan inzicht geven in medicijnmechanismen en snellere screening van geneesmiddelen mogelijk maken. De methode kan worden uitgebreid door de integratie van stroma, endotheel en immuuncellen. Deze co-culturen kunnen nog meer een afspiegeling zijn van de inheemse tumorpopulatie en architectuur.Oefen het laden van de microfluïde platen met gemakkelijk uitgevouwen cellijnen om zeer bedreven te worden voordat u overstapt op meer kostbare cellen zoals PDXs. Uitlijning tijdens plaatdosering heeft grote gevolgen voor het succes en een visuele demonstratie kan dit concept gemakkelijk overbrengen. Om te beginnen, overdracht tumorweefsel naar een vooraf gewogen steriele 50-milliliter conische buis.Spoel zes keer met 30 milliliter steriele PBS om bloed en verontreinigingen te verwijderen. Verwijder zoveel mogelijk vloeistof, en weeg het tumorweefsel. Breng het tumorweefsel naar een 60-millimeter ronde weefselkweekschotel en gebruik een steriel scheermesje of een scalpel om het in stukken van één millimeter te hakken.Voeg vijf milliliter PDX-verwerkingsmedium toe om de tumordrijfmest te verzamelen. Voeg vijf milliliter dissociatie enzym oplossing om de tumor drijfmest te verzamelen. Spoel de kweekschotel af met nog eens vijf milliliter dissociatieenzymoplossing.Voeg vervolgens vijf milliliter PDX-verwerkingsmedium toe. Incubeer 20 minuten bij 37 graden Celsius met zacht schudden. Halverwege de incubatietijd, draai de buis zachtjes.Na incubatie, pipet op en neer zachtjes met een serologische pipet te breken klonten. Plaats een 70-micron cel zeef over een nieuwe steriele 50-milliliter buis, en filter de cellen. Dan centrifugeren bij 1, 200 rpm gedurende twee minuten om de cellen pellet.Verwijder de supernatant en resuspend in twee tot drie milliliter pdx cultuur medium. Tel de cellen met behulp van een hemocytometer of geautomatiseerde cel teller. Gebruik deze tabel om het vereiste aantal van de bijbehorende PDX-afgeleide cellen te schatten die nodig zijn om de gewenste celdichtheid per chip te bereiken.Plaat een tot twee keer 10 tot de zes cellen in vijf milliliter PDX cultuurmedium per put van een zes-goed weefsel kweekplaat. Incubeer gedurende 48 uur bij 37 graden Celsius, 5% kooldioxide en 95% vochtigheid met zacht schudden bij 50 tot 55 rpm om clustervorming te bevorderen. Nadat de clusters zijn gevormd, ga je over tot centrifugatie.Bereid eerst 20 milliliter van 100% dichtheidgradiëntoplossing voor door grondig 18 milliliter dichtheidsgradiëntecentrifugatieoplossing met twee milliliter steriele 10X HBSS in een steriele conische buis van 50 milliliter te mengen. Verdun deze 100%-oplossing met steriele 1X HBSS om 10 milliliter per stuk 20%30%40% en 55% dichtheidgradiëntoplossingen te maken. Voeg drie milliliter van 55% dichtheid gradiënt oplossing aan de onderkant van een 15-milliliter conische buis.Houd de buis onder een hoek, langzaam afzien van drie milliliter van 40% dichtheid gradiënt oplossing op de schuine kant van de buis en op de top van de 55%-laag. Herhaal dit met de 30%-dichtheidsgradiëntoplossing. Verzamel vervolgens de supernatant van PDX-rotatieculturen met een serologische pipet van vijf milliliter in een buis, waarbij het plaatoppervlak voorzichtig wordt spoelen.Centrifuge bij 1,200 tpm gedurende twee minuten naar pelletcellen. Verwijder de supernatant, en resuspend de cel pellet in drie milliliter van 20% dichtheid gradiënt oplossing. Leg de 20%-dichtheidsgradiëntoplossing voorzichtig met cellen op de bovenkant van het verloop in de buis van 15 milliliter.Dop de buizen en centrifuge in een swing-emmer rotor centrifuge 30 minuten op vier graden Celsius, 2,000 keer G, en nul pauze. Na centrifugatie zijn breuken zichtbaar. Levensvatbare PDX-celculturen worden meestal gevonden op de 40 tot 55% dichtheidsgradiëntoplossingsinterface.Verzamel twee tot drie milliliter van elke fractie in verse buizen van 15 milliliter. Voeg drie tot vier volumes steriele 1X HBSS toe aan elke fractie en om te keren om grondig te mengen. Centrifuge op 1.000 keer G gedurende drie minuten om de cellen te pelleteren.Verwijder de supernatant. Resuspend de cel pellet in een tot twee milliliter van PDX processing medium. Breng een kleine aliquot tussen 50 tot 100 microliter in een buis, en voeg een gelijk volume van dissociatie enzym oplossing voor redissociatie.Beoordeel het celnummer in de geclusterde celsuspensie. Tel de cellen met een hemocytometer of geautomatiseerde celteller. Reconstitute hyaluronzuur hydrogel oplossingen volgens de instructies van de fabrikant.Voeg met behulp van een multi-channel pipet 50 microliters hbss toe aan alle putten in observatievensterkolommen van een tweebaans microfluïde plaat om de vochtigheid van de cultuur en optimale beeldvormingsomstandigheden te behouden. Bereken het volume van de celsuspensie die nodig is voor 50 microliters hydrogel bij de gewenste celdichtheid, bijvoorbeeld 5.000 cellen per microliter. Voor het zaaien van een microfluïde plaat, aliquot het berekende volume in elk van vier steriele 1,5-milliliter centrifuge buizen.Pas de pH van de HA thiol-oplossing onmiddellijk voor gebruik in op acht met 1 normale natriumhydroxide. Voer een testgelatie uit door 40 microliter ha thiol met 10 microliter PEGdA te mengen en gelatie na verloop van tijd te monitoren. Vervolgens centrifugeren de cel suspensie aliquots gedurende twee minuten op 200 keer G en kamertemperatuur om de cellen pellet.Verwijder voorzichtig de supernatant, en resuspend de cellen in 40 microliter van HA thiol voor een 50-microliter eindvolume. Voeg 10 microliter PEGdA toe aan een aliquot van de cellen van HA thiol. Meng goed, en wacht een tot drie minuten voordat het zaaien van de microfluïde plaat.Breng een tip aan voor het afgeven van 1,5 microliter op een single-channel herhalende pipet en laad met de cellen in HA hydrogel-oplossing. Vergeet niet om de waterstof aliquot goed gemengd te houden om zelfs celdistributie te garanderen. Om de microfluidic plaat te zaaien, lijnt u de pipetpunt loodrecht op het blad uit terwijl u de punt voorzichtig in het midden van de gelinlaat plaatst om contact te garanderen, maar geen druk bij het afgeven van 1,5 microliter hydrogeloplossing.Let op de vulstatus van de microfluïde kanalen door vanaf de bovenkant van de plaat, de onderkant van de plaat of per microscoop te bekijken. Beoordeel de belasting met behulp van dit cijfer als een gids. Het ene moment na het laden, omkeren van de plaat tijdens de voorbereiding voor de volgende aliquot.Herhaal het zaaien van de microfluïde plaat voor de overige drie aliquots van cellen in HA-oplossing. Nadat alle chips zijn gevuld, incubeer de plaat op 37 graden Celsius in een bevochtigde couveuse 45 minuten tot gelatie is voltooid. Zorg er daarna met behulp van de meegeleverde handleiding voor dat de perfusierocker in de celkweek incubator wordt geïnstalleerd met de juiste oversmeerstandinstelling onder een hoek van 14 graden en intervallen van vier minuten.Voeg 50 microliter PDX-celkweekmedium toe aan alle medium inhammen. Tik de plaat voorzichtig tegen een oppervlak om de vloeistof aan te moedigen om de microfluïde kanalen te vullen. Draai vervolgens de plaat om te controleren of de kanalen goed zijn gevuld.Voeg 50 microliter DMEM/F-12 toe voor alle mediakanalen. Als er luchtbellen in het perfusiekanaal zitten, verwijder dan door zachtjes op de plaat tegen een oppervlak te tikken. Met behulp van een microscoop en plaat lay-out vorm, record chip vullen succes.Sluit verkeerd gevulde chips uit voor verder experimenteel gebruik. Plaats de plaat op een kantelende tuimelschakelaar ingesteld op een 14-graden kantelen en een cyclus van vier minuten om perfusie te beginnen. Elke twee dagen, vervang de PDX cultuur medium, eerst 50 microliter in de inhammen, dan 50 microliter in de verkooppunten.In deze studie werd een programmeerbare perfusierocker geïnstalleerd in een standaard celkweek incubator met waterjas, en tweebaans microfluïde bladen werden bereid in een standaard bioveiligheidskast voor het laden. 3D microfluïde PDX cultuur levensvatbaarheid en morfologie werden geëvalueerd in zowel ongescheiden en dichtheid-gradiënt centrifugatie-gescheiden omstandigheden. Op dag één, die culturen die de scheidingsmethode ondergingen tentoonstelden tienvoudige minder enige dode cellen in vergelijking met ongescheiden culturen.Belangrijk is dat de gescheiden clusters voornamelijk bestonden uit levende cellen. Er is geen statistisch significant verschil vastgesteld voor de clustergrootteverdeling. Culturen werden verder gehandhaafd in de microfluïde plaat voor zeven dagen.Het totale aantal levende cellen bleef consistent en clusters behielden ongeveer 80% levensvatbaarheid gedurende het leven van de cultuur. Vergeet niet dat elke PDX-lijn uniek is, dus het gemak van tumorvertering, de fenotypische grootte en morfologie van clusters, en de locatie van het cluster binnen de gradiëntzuivering zal variëren. PDX culturen vastgesteld met behulp van deze methode kan worden getesteerd met beeld-of plaat-reader-gebaseerde levensvatbaarheid testen, vast en immunofluorescently gelabeld, of gescheiden om cel lysates te verzamelen voor andere protocollen.De methode zal onderzoekers in staat stellen om de tumor micro-omgeving samen te vatten om biologie of drug reactie van tumorcellen te verkennen. Gebruikers moeten de standaard training voor menselijke proefpersonen en door bloed overgedragen pathogenen voltooien voordat ze met door mensen afgeleide weefsels worden gevolgd. Er moeten passende persoonlijke beschermingsmiddelen worden gedragen.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Labeling of Breast Cancer Patient-derived Xenografts with Traceable Reporters for Tumor Growth and Metastasis Studies

Etikettering van borstkanker-Patient afgeleid Xenograften met Traceable Verslaggevers voor tumorgroei en metastase Studies

The use of preclinical models to study tumor biology and response to treatment is central to cancer research. Long-established human cell lines, and many ...

Isolation and Characterization of Tumor-initiating Cells from Sarcoma Patient-derived Xenografts

Isolatie en karakterisering van tumor initiërende cellen uit Sarcoom patiënt-afgeleide xenografts

The existence and importance of tumor-initiating cells (TICs) have been supported by increasing evidence during the past decade. These TICs have been ...

Fluorescence Molecular Tomography for In Vivo Imaging of Glioblastoma Xenografts

Fluorescence Molecular Tomography for In Vivo Imaging of Glioblastoma Xenografts

Fluorescentie moleculaire tomografie voor In Vivo Imaging van Glioblastoma Xenografts

Tumorigenicity is the capability of cancer cells to form a tumor mass. A widely used approach to determine if the cells are tumorigenic is by injecting ...

Patient-derived Heterogeneous Xenograft Model of Pancreatic Cancer Using Zebrafish Larvae as Hosts for Comparative Drug Assessment

Door patiënten afgeleid heterogeen xenograft-model van pancreaskanker met behulp van zebravis larven als gastheer voor vergelijkende geneesmiddelenbeoordeling

Patient-derived tumor xenograft (PDX) and cell-derived tumor xenograft (CDX) are important techniques for preclinical assessment, medication guidance and ...

Physiologic Patient Derived 3D Spheroids for Anti-neoplastic Drug Screening to Target Cancer Stem Cells

Fysiologisch patiënt afgeleide 3D-Spheroids voor anti-neoplastische geneesmiddelen screening om kanker stamcellen te targeten

In this protocol, we outline the procedure for generation of tumor spheroids within 384-well hanging droplets to allow for high-throughput screening of ...

Assessing Cell Viability and Death in 3D Spheroid Cultures of Cancer Cells

Beoordeling van de levensvatbaarheid van cellen en de dood in 3D sferoïde culturen van kankercellen

Three-dimensional spheroids of cancer cells are important tools for both cancer drug screens and for gaining mechanistic insight into cancer cell biology. ...

Establishment of Gastric Cancer Patient-derived Xenograft Models and Primary Cell Lines

Oprichting van maagkanker patiënten afgeleide xenograft modellen en primaire cellijnen

The use of preclinical models to advance our understanding of tumor biology and investigate the efficacy of therapeutic agents is key to cancer research. ...

Testing Targeted Therapies in Cancer using Structural DNA Alteration Analysis and Patient-Derived Xenografts

Testen gerichte therapieën bij kanker met behulp van structurele DNA-wijzigingsanalyse en patiënt-afgeleide Xenografts

We present here an integrative approach for testing efficacy of targeted therapies that combines the next generation sequencing technolo-gies, therapeutic ...

Drug Screening of Primary Patient Derived Tumor Xenografts in Zebrafish

Drug Screening van primaire patiënt afgeleid tumor Xenografts bij zebravissen

Patient derived xenograft models are critical in defining how different cancers respond to drug treatment in an in vivo system. Mouse models are the ...

Patient-Derived Tumor Explants As a "Live" Preclinical Platform for Predicting Drug Resistance in Patients

Patiënt-afgeleide tumor explanteert als een "live" preklinisch platform voor het voorspellen van medicijnresistentie bij patiënten

An understanding of drug resistance and the development of novel strategies to sensitize highly resistant cancers rely on the availability of suitable ...