Name: enhanced viability for ex vivo 3d hydrogel cultures of patient-derived xenografts in a perfused microfluidic platform
Uploaded: 2020-12-05T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Enhanced Viability for Ex vivo 3D Hydrogel Cultures of Patient-Derived Xenografts in a Perfused Microfluidic Platform at JoVE.com

Ces travaux ont été soutenus par les National Institutes of Health National Cancer Institute SBIR Phase I (HHSN26120700015C) et P01CA098912.

Le tissu tumoral a été obtenu avec le consentement du patient et selon un protocole approuvé de la Commission d’examen institutionnel (CISR). Les xénogreffes ont été implantées, cultivées et récoltées selon un protocole accepté du Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC).
REMARQUE : Tous les travaux doivent être effectués dans un cabinet de sécurité biologique stérile pour maintenir la stérilité. Toutes les étapes doivent être effectuées à ...

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	<li>Jung, J., Seol, H. S., Chang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Generation+and+Application+of+Patient-Derived+Xenograft+Model+for+Cancer+Research.">The Generation and Application of Patient-Derived Xenograft Model for Cancer Research.</a> Cancer Research and Treatment: Official Journal of Korean Cancer Association. 50 (1), 1-10 (2018).</li><li>Malaney, P., Nicosia, S. V., Dave, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One+mouse,+one+patient+paradigm:+New+avatars+of+personalized+cancer+therapy.">One mouse, one patient paradigm: New avatars of personalized cancer therapy.</a> Cancer Letters. 344 (1), 1-12 (2014).</li><li>Meehan, T. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PDX-MI:+Minimal+Information+for+Patient-Derived+Tumor+Xenograft+Models.">PDX-MI: Minimal Information for Patient-Derived Tumor Xenograft Models.</a> Cancer Research. 77 (21), 62-66 (2017).</li><li>Fong, E. L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogel-Based+3D+Model+of+Patient-Derived+Prostate+Xenograft+Tumors+Suitable+for+Drug+Screening.">Hydrogel-Based 3D Model of Patient-Derived Prostate Xenograft Tumors Suitable for Drug Screening.</a> Molecular Pharmaceutics. 11 (7), 2040-2050 (2014).</li><li>Fong, E. L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+3D+in+vitro+model+of+patient-derived+prostate+cancer+xenograft+for+controlled+interrogation+of+in+vivo+tumor-stromal+interactions.">A 3D in vitro model of patient-derived prostate cancer xenograft for controlled interrogation of in vivo tumor-stromal interactions.</a> Biomaterials. 77, 164-172 (2016).</li><li>Engel, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyaluronic+Acid-Based+Hydrogel+Formulations+Suitable+for+Automated+3D+High+Throughput+Drug+Screening+of+Cancer-Stromal+Cell+Cocultures.">Hyaluronic Acid-Based Hydrogel Formulations Suitable for Automated 3D High Throughput Drug Screening of Cancer-Stromal Cell Cocultures.</a> Advanced Healthcare Materials. 4 (11), 1664-1674 (2015).</li><li>Lanz, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapy+response+testing+of+breast+cancer+in+a+3D+high-throughput+perfused+microfluidic+platform.">Therapy response testing of breast cancer in a 3D high-throughput perfused microfluidic platform.</a> BMC Cancer. 17 (1), 709 (2017).</li><li>Wevers, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+compound+evaluation+on+3D+networks+of+neurons+and+glia+in+a+microfluidic+platform.">High-throughput compound evaluation on 3D networks of neurons and glia in a microfluidic platform.</a> Scientific Reports. 6, 38856 (2016).</li><li>Vulto, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phaseguides:+a+paradigm+shift+in+microfluidic+priming+and+emptying.">Phaseguides: a paradigm shift in microfluidic priming and emptying.</a> Lab on a Chip. 11 (9), 1596-1602 (2011).</li><li>Patru, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD133,+CD15/SSEA-1,+CD34+or+side+populations+do+not+resume+tumor-initiating+properties+of+long-term+cultured+cancer+stem+cells+from+human+malignant+glio-neuronal+tumors.">CD133, CD15/SSEA-1, CD34 or side populations do not resume tumor-initiating properties of long-term cultured cancer stem cells from human malignant glio-neuronal tumors.</a> BMC Cancer. 10, 66 (2010).</li><li>Harma, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+panel+of+three-dimensional+models+for+studies+of+prostate+cancer+growth,+invasion+and+drug+responses.">A comprehensive panel of three-dimensional models for studies of prostate cancer growth, invasion and drug responses.</a> PLoS One. 5 (5), 10431 (2010).</li></ol>

Ici nous décrivons une méthode pour traiter et cultururing les cellules viables de tumeur PDX-dérivées dans un système de culture 3D perfusé à haut débit. Tandis que ce protocole utilise le tissu de PCa PDX, il est également efficace pour d’autres tumeurs épithéliales-dérivées. Les caractéristiques tumorales varient d’une lignée PDX à l’autre, même dans le même tissu d’origine (prostate, sein, etc.). Certaines lignées PCa PDX sont plus fibrotiques et difficiles à isoler les cellules viables de...

Au cours de la dernière décennie, le domaine de la recherche sur le cancer a démontré un regain d’enthousiasme pour les xénogreffes dérivées du patient (PDX) comme outil d’évaluation de la dépendance aux voies cancéreuses et de la susceptibilitéaux médicaments 1. Les modèles PDX les plus courants sont établis par implantation sous-cutanée ou orthotopique de cellules tumorales humaines — un fragment tumoral, un groupe de cellules dérivées de tumeurs dissociées ou un échantillon de cellules tumorales circulantes isolées (CTC) — dans un hôte de rongeurs. Si la tumeur « prendre » est un succès, les cellules xénogreffe proliférera, vasculariser, et autrement interagir avec le tissu hôte pour créer une tumeur, qui peut être récolté à une taille optimale, subdivisé, et ré-implanté dans d’autres hôtes. Parmi leurs nombreux avantages en tant que système modèle, les PDX conservent généralement une partie substantielle de l’hétérogénéité de la population de cellules tumorales indigènes et permettent l’évaluation des voies et des réponses cellulaires spécifiques àl’homme 2,3. Le contexte in vivo permet l’interaction de tumeur avec la vascularisation et d’autres stroma adjacents et récapitule des caractéristiques de tissu telles que la dynamique de diffusion de drogue, la tension d’oxygène, et l’influence extracellulaire de matrice qui influencent biologiquement et mécaniquement la progression de tumeur. Un aspect négatif des PDXs est leur dépendance sur un hôte de rongeur, à la fois pour l’expansion de tumeur et finalement pour l’essai d’hypothèse. Étant donné que de nombreux PDX ne peuvent pas s’adapter à la culture bidimensionnelle traditionnelle (2D) sur le polystyrène de culture tissulaire sans perdre bon nombre de leurs caractéristiques souhaitables, il y a eu un juste milieu minimal pour les chercheurs entre cette méthode in vitro relativement contrôlée et l’augmentation significative des dépenses, des installations et des besoins en temps pour l’utilisation in vivo PDX.
Nous avons décrit plusieurs modèles in vitro qui mettent en œuvre la culture cellulaire 3D au sein d’une matrice de soutien, et avons récemment élargi ce travail pour démontrer la culture ex vivo des PDX dérivés du cancer de la prostate multiple (PCa), seuls et en co-culture avec des fibroblastes dérivés de lamoelle osseuse 4,5. Les matrices hydrogel à base d’acide hyaluronique (HA) fournissent un soutien personnalisable et biologiquement pertinent pour les deux types de cellules, avec un contrôle facile sur les caractéristiques hydrogel et la clarté optique pour l’imagerie à travers la profondeur hydrogel6.
Les tissus tumoraux PDX matures comprennent un mélange variable de cellules cancéreuses humaines hétérogènes et de stroma de souris (fibroblastes, cellules endothéliales, etc.). Pour étudier les contributions spécifiques de type cellulaire à la progression tumorale in vitro, il peut être avantageux de dissocier les tumeurs, de séparer les populations cellulaires et de les incorporer expérimentalement de manière organisée pour disséquer les voies de communication intercellulaire. Les populations mixtes de cellules dans les digestates tissulaires ont une compatibilité différentielle avec des conditions de culture spécifiques. Par exemple, la viabilité fibroblaste associée à la tumeur nécessite soit une adhérence de surface, soit des matrices 3D fonctionnalisées avec des ligands d’intégrine, tandis que les cellules PDX épithéliales n’ont généralement pas ces exigences, favorisant plutôt les interactions cellule-cellule. Ces différences peuvent être exploitées pour assurer une séparation efficace des cellules PDX des cellules stromales de la souris contaminantes. La culture de rotation des digestates tissulaires permet l’adhérence des cellules stromales à la surface de la culture tissulaire tandis que les adhérences cellule-cellule conduisent les cellules PDX flottant au-dessus de la surface de culture rotative pour former des grappes multicellulaires dans le supernatant à 24−48 h. Les caractéristiques spécifiques de ces grappes varient selon le PDX (p. ex., de grandes grappes serrées, hautement sphériques ou des agrégats plus petits et plus lâches ressemblant à des grappes de raisin), mais sont généralement de tailles biologiquement pertinentes (50−250 μm de diamètre), suffisantes pour évaluer les interactions cellulaires qui reposent sur des contacts intercellulaires.
La récupération et le traitement des tumeurs entraîne inévitablement un certain degré de mort collatérale des cellules, soit en raison de dommages à court terme causés par des perturbations mécaniques/enzymatiques, soit d’une incompatibilité à long terme des sous-populations avec les conditions de culture choisies. Malgré l’utilité de la culture de rotation comme séparation initiale en vrac, les cellules mortes ou mourantes sont inévitablement transférées avec les clusters PDX et peuvent influencer la culture qui en résulte. Ces cellules mortes sont souvent des cellules PDX individuelles qui n’ont pas été intégrées dans un cluster, des fibroblastes stromaux de souris qui ne peuvent survivre dans des conditions de culture sélectionnées, ou des cellules endothéliales particulièrement fragiles. Ces cellules mourantes peuvent influencer les résultats expérimentaux des « survivants » et avoir un impact important sur la quantification, par exemple par le biais d’analyses de dépistage de la viabilité basées sur l’image fluorescente. Pour améliorer la sélection des cellules PDX vivantes de cette méthode, nous avons adapté les méthodes de centrifugation avec des étapes de densité pour éliminer facilement les cellules mortes/mourantes individuelles des mélanges PDX et conserver principalement des clusters multicellulaires vivants.
Afin d’améliorer l’étude des grappes dérivées de PDX en culture 3D, nous avons utilisé une plate-forme de culture de perfusion basée sur les microfluidiques, l’OrganoPlate (Figure 1), qui est une plate-forme de culture de perfusion à haut débit qui permet une culture simultanée de jusqu’à 96 cultures individuelles perfusées et 3D sur une base de plaques de microtiter de 384 puits(figure 1A)7,8. Dans la plaque microfluidique à deux voies, une seule puce tissulaire est reliée par deux canaux microfluidiques(figure 1B,canal gel : rouge, canal de perfusion : bleu) qui s’étendent sur quatre puits d’affilée. Les deux canaux microfluidiques sont séparés par une courte crête en plastique appelée Phaseguide qui empêche le débordement d’un canal dans son canal voisin adjacent, et permet simultanément une interface sans membrane entre le contenu du gel et le canal de perfusion9. Parce que le fond de la plaque microfluidique est composé de verre de qualité microscope, les cultures peuvent être visualisées dans la fenêtre d’observation à travers le fond de la plaque avec un microscope standard ou automatisé. La perfusion est établie dans la plaque microfluidique avec un rocker programmable, utilisant la gravité pour conduire les médias à travers les canaux microfluidiques, entre les puits du réservoir (figure 1C). Le flow-mimic de perfusion récapitule plus étroitement le microenvironnement de tumeur que la culture statique, permettant l’incorporation du stress de cisaillement et la distribution accrue des gaz et des éléments nutritifs. Les avantages du maintien d’une culture perfusée de cellules cancéreuses dans la plaque microfluidique ont été précédemment décrits comme cultures perfusées de cancer du sein ont montré la viabilité optimale par rapport à une culture statique de 3D des mêmes cellules7.
Le présent rapport décrit une méthode adaptée de centrifugation du gradient de densité pour isoler les clusters PDX multicellulaires vivants et démontre son utilité dans l’établissement de cultures 3D PDX dans des plaques microfluidiques perfusables. Étant donné qu’un nombre croissant de laboratoires de recherche cherchent des méthodes pour faciliter l’utilisation du PDX, nous prévoyons que les protocoles présentés ici seront d’une utilité immédiate.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:812px;" width="812">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">1N NaOH</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td style="width:224px;">any suitable tissue culture grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">60 mm round tissue culture dishes</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td>any suitable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">6-well tissue culture plates</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td>any suitable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">70 &#181;m cell strainers</td>
			<td style="width:148px;">Corning</td>
			<td style="width:189px;">431751</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:251px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:148px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:189px;">5810R with suitable rotor and buckets for 15/50 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Density gradient centrifugation solution</td>
			<td style="width:148px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:189px;">P1644</td>
			<td>Percoll</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Dimethylsulfoxide</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td>any suitable tissue culture grade</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Dissociation enzyme solution</td>
			<td style="width:148px;">StemCell Technologies</td>
			<td style="width:189px;">07921</td>
			<td style="width:224px;">ACCUMAX</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">DMEM-F12</td>
			<td style="width:148px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:189px;">11039021</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Forceps</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td>any suitable</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">HA hydrogel kit</td>
			<td style="width:148px;">ESI BIO</td>
			<td style="width:189px;">GS311</td>
			<td style="width:224px;">HyStem (Hyaluronic acid-SH and PEGDA)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Hanks Balanced Salt Solution</td>
			<td style="width:148px;">Lonza</td>
			<td style="width:189px;">10-527F</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Heat-inactivated fetal bovine serum</td>
			<td style="width:148px;">Atlanta Biologicals</td>
			<td style="width:189px;">S11150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Hemocytometer</td>
			<td style="width:148px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:189px;">02-671-51B Hausser BrightLine</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Hoechst 33342</td>
			<td style="width:148px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:189px;">H1398</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Image processing software</td>
			<td style="width:148px;">Oxford Instruments</td>
			<td style="width:189px;">Imaris 9.3</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:251px;">LIVE/DEAD Cell Viability/Cytotoxicity Kit (Calcein-AM/Ethidium Homodimer-1)</td>
			<td style="width:148px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:189px;">L3224</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Microfluidic culture plate</td>
			<td style="width:148px;">Mimetas</td>
			<td style="width:189px;">9603-400-B</td>
			<td>2-lane OrganoPlate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Microscope</td>
			<td style="width:148px;">Nikon</td>
			<td style="width:189px;">A1R</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="68">
			<td height="68" style="height:68px;width:251px;">Multichannel pipette</td>
			<td style="width:148px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:189px;">3125000036</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:251px;">PDX-derived tumor tissue</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td style="width:224px;">obtained under IRB approval for human tissue and IACUC approval for animal host</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Penicillin-streptomycin</td>
			<td style="width:148px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:189px;">15140-122</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Perfusion rocker</td>
			<td style="width:148px;">Mimetas</td>
			<td style="width:189px;">OrganoPlate Perfusion Rocker Mini</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">pH strips (pH 5-9)</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td>any suitable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Phosphate-buffered saline solution</td>
			<td style="width:148px;">Lonza</td>
			<td style="width:189px;">17-516F</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Razor blades</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td>any suitable</td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;width:251px;">Rotating xy-shaker</td>
			<td style="width:148px;">VWR</td>
			<td style="width:189px;">Advanced 3500 Orbital Shaker</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Scalpel handle</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td>any suitable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Single channel repeating pipette</td>
			<td style="width:148px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:189px;">22260201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Sterile, 15mL conical centrifuge tubes</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td>any suitable</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Sterile, 50mL conical centrifuge tubes</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td>any suitable</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

enhanced viability for ex vivo 3d hydrogel cultures of patient-derived xenografts in a perfused microfluidic platform

Les xénogreffes d’origine patiente (PDX), générées lors de la résécation du tissu tumoral du patient, sont greffées directement en souris immunocompromisées, demeurent biologiquement stables, préservant ainsi les caractéristiques moléculaires, génétiques et histologiques, ainsi que l’hétérogénéité de la tumeur originale. Toutefois, l’utilisation de ces modèles pour effectuer une multitude d’expériences, y compris le dépistage des drogues, est prohibitif tant en termes de coût que de temps. Les systèmes de culture tridimensionnels (3D) sont largement considérés comme des plates-formes dans lesquelles les cellules cancéreuses conservent leur intégrité biologique grâce aux interactions biochimiques, à la morphologie et à l’architecture. Notre équipe a une vaste expérience de la culture des cellules PDX in vitro à l’aide de matrices 3D composées d’acide hyaluronique (HA). Afin de séparer les cellules stromal fibroblastes de souris associées aux PDX, nous utilisons la culture de rotation, où les cellules stromal adhèrent à la surface des plaques traitées par culture tissulaire tandis que les cellules tumorales DISSOCIées pdx flottent et s’associent en grappes multicellulaires. Les cellules simples, souvent mortes, qui présentent un défi dans la collecte de clusters PDX viables pour l’encapsulation en aval dans les hydrogels pour la culture cellulaire 3D, flottent également dans le surnatant. Afin de séparer ces cellules simples des grappes cellulaires vivantes, nous avons utilisé la centrifugation de gradient d’étape de densité. Le protocole décrit ici permet l’épuisement des cellules célibataires non viables de la population saine des grappes cellulaires qui seront utilisées pour d’autres expérimentations in vitro. Dans nos études, nous intégrons les cultures 3D dans des plaques microfluidiques qui permettent la perfusion des médias pendant la culture. Après avoir évalué les cultures qui en résultent à l’aide d’un test de viabilité basé sur l’image fluorescente des cellules purifiées par rapport aux cellules non purifiées, nos résultats montrent que cette étape de séparation supplémentaire a considérablement réduit le nombre de cellules non viables de nos cultures.

Un rocker de perfusion programmable a été préparé dans un incubateur standard de culture cellulaire à prise d’eau, et des plaques microfluidiques à deux voies ont été préparées dans un coffret de biosécurité standard pour le chargement (figure 1). Une tumeur de PDX de MDA-PCA-118b a été agrandie in vivo, récoltée quand elle avait atteint une taille maximale, et dissociée comme décrit dans la section de protocole 2 pour créer une suspension de boue des cellules, à approx...

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Enhanced Viability for Ex vivo 3D Hydrogel Cultures of Patient-Derived Xenografts in a Perfused Microfluidic Platform

Ce protocole démontre des méthodes pour permettre la culture in vitro étendue des xénogreffes patient-dérivées (PDX). Une étape améliore la viabilité globale des cultures multicellulaires en grappes hydrogels 3D, grâce à l’élimination directe de cellules uniques non viables. Une étape secondaire démontre les meilleures pratiques pour la culture PDX dans une plate-forme microfluidique perfusée.

Viabilité améliorée pour les cultures Hydrogel 3D Ex vivo de xénogreffes dérivées du patient dans une plate-forme microfluidique perfusée

Patient-derived xenografts (PDX), generated when resected patient tumor tissue is engrafted directly into immunocompromised mice, remain biologically ...

Les méthodes améliorées de culture pour des échantillons de tumeur patients-dérivés sont d’une importance critique pendant que le champ s’éloigne de l’utilisation des lignes cellulaires conventionnelles. Ce protocole permet la culture in vitro des cellules tumorales dérivées du patient dans une plate-forme qui est agréable à haut débit et le dépistage à haute teneur, contrairement aux modèles de cancer in vivo. La plate-forme incorporant des PDX nous permet d’évaluer des systèmes plus hétérogènes reflétant les tumeurs indigènes.Cela peut donner un aperçu des mécanismes médicamentux et permettre un dépistage plus rapide des médicaments. La méthode pourrait être étendue par l’incorporation du stroma, de l’endothélium, et des cellules immunisées. Ces co-cultures pourraient être encore plus représentatives de la population et de l’architecture indigènes de tumeur.Pratiquez le chargement des plaques microfluidiques avec des lignées cellulaires facilement élargies pour devenir très compétents avant de passer à des cellules plus précieuses comme les PDX. L’alignement pendant la distribution des plaques a un impact considérable sur le succès, et une démonstration visuelle peut facilement transmettre ce concept. Pour commencer, transférez le tissu tumoral à un tube conique stérile pré-pesé de 50 millilitres.Rincer six fois avec 30 millilitres de PBS stérile pour éliminer le sang et les contaminants. Enlever autant de liquide que possible, et peser le tissu tumoral. Transférez le tissu tumoral dans un plat rond de culture de tissu de 60 millimètres, et utilisez une lame stérile de rasoir ou un scalpel pour le hacher en morceaux d’un millimètre.Ajouter cinq millilitres de milieu de traitement PDX pour recueillir le lisier tumoral. Ajouter cinq millilitres de solution enzymatique de dissociation pour recueillir le lisier tumoral. Rincer le plat de culture avec un autre cinq millilitres de solution enzymatique de dissociation.Ajouter ensuite cinq millilitres de support de traitement PDX. Incuber 20 minutes à 37 degrés Celsius avec des secousses douces. À mi-chemin du temps d’incubation, faites tourbillonner doucement le tube.Après l’incubation, pipette de haut en bas doucement avec une pipette sérologique pour briser les touffes. Placez une passoire cellulaire de 70 microns sur un nouveau tube stérile de 50 millilitres et filtrez les cellules. Puis centrifugeuse à 1200 rpm pendant deux minutes pour pelleter les cellules.Retirez le supernatant et resuspendez en deux à trois millilitres de milieu de culture PDX. Comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre ou d’un compteur de cellules automatisé. Utilisez ce tableau pour estimer le nombre requis de cellules dérivées pdx associées nécessaires pour atteindre la densité cellulaire désirée par puce.Plaque une à deux fois 10 aux six cellules dans cinq millilitres de milieu de culture PDX par puits d’une plaque de culture tissulaire de six puits. Incuber pendant 48 heures à 37 degrés Celsius, 5% de dioxyde de carbone, et 95% d’humidité avec des secousses douces à 50 à 55 rpm pour favoriser la formation des grappes. Une fois que les grappes se sont formées, procéder à la centrifugation.Préparez d’abord 20 millilitres de solution de gradient de densité de 100 % en mélangeant soigneusement 18 millilitres de solution de centrifugation de gradient de densité avec deux millilitres de HBSS stérile de 10X dans un tube conique stérile de 50 millilitres. Diluer cette solution à 100% avec des solutions stériles de gradient de 1X HBSS pour faire 10 millilitres chacune de 20%30%40% et 55% de gradient de densité. Ajouter trois millilitres de solution de gradient de densité de 55 % au fond d’un tube conique de 15 millilitres.Tenant le tube à un angle, distribuez lentement trois millilitres de solution de gradient de densité de 40% sur le côté incliné du tube et sur le dessus de la couche de 55%. Répétez avec la solution de gradient de densité de 30%. Puis recueillir le surnatant des cultures de rotation PDX avec une pipette sérologique de cinq millilitres dans un tube, rinçant la surface de la plaque doucement.Centrifugeuse à 1200 rpm pendant deux minutes pour pelleter les cellules. Retirez le supernatant et resuspendez la pastille cellulaire en trois millilitres de solution de gradient de densité de 20 %. Superposez soigneusement la solution de gradient de densité de 20 % avec des cellules sur le dessus du gradient dans le tube de 15 millilitres.Capuchon les tubes et la centrifugeuse dans une centrifugeuse rotor swing-bucket 30 minutes à quatre degrés Celsius, 2000 fois G, et zéro pause. Après centrifugation, des fractions sont visibles. Les cultures cellulaires PDX viables se trouvent généralement à l’interface de solution de gradient de densité de 40 à 55 %.Recueillir de deux à trois millilitres de chaque fraction dans des tubes frais de 15 millilitres. Ajouter trois à quatre volumes de 1X HBSS stérile à chaque fraction, et inverser pour bien mélanger. Centrifugeuse à 1000 fois G pendant trois minutes pour pelleter les cellules.Retirer le surnatant. Resuspendez la pastille cellulaire en un à deux millilitres de milieu de traitement PDX. Transférer un petit aliquot entre 50 et 100 microlitres dans un tube, et ajouter un volume égal de solution enzymatique de dissociation pour la redissociation.Évaluer le numéro de cellule dans la suspension cellulaire groupée. Comptez les cellules à l’amiomètre ou au compteur de cellules automatisé. Reconstituer les solutions d’hydrogel acide hyaluronique selon les instructions du fabricant.À l’aide d’une pipette multicanal, ajouter 50 microlitres de HBSS à tous les puits dans des colonnes de fenêtre d’observation d’une plaque microfluidique à deux voies afin de maintenir l’humidité de la culture et des conditions d’imagerie optimales. Calculez le volume de suspension cellulaire né cessaire pour 50 microlitres d’hydrogel à la densité cellulaire désirée, par exemple, 5000 cellules par microlitre. Pour l’ensemencement d’une plaque microfluidique, aliquot le volume calculé dans chacun des quatre tubes stériles centrifugeuse de 1,5 millilitre.Réglez le pH de la solution ha thiol à huit avec 1 hydroxyde de sodium normal immédiatement avant l’utilisation. Effectuez une gelation d’essai en mélangeant 40 microlitres de thiol HA avec 10 microlitres de PEGdA et en surveillant la gelation au fil du temps. Ensuite, centrifuger la suspension cellulaire aliquots pendant deux minutes à 200 fois G et la température ambiante pour pelleter les cellules.Retirez soigneusement le supernatant et réutilisez les cellules dans 40 microlitres de thiol HA pour un volume final de 50 microlitres. Ajouter 10 microlitres de PEGdA à un aliquot des cellules du thiol HA. Bien mélanger et attendre une à trois minutes avant d’ensemencer la plaque microfluidique.Apposer une pointe pour distribuer 1,5 microlitres à une pipette à répétition à canal unique, et charger avec les cellules dans la solution hydrogel HA. N’oubliez pas de garder l’hydrogène aliquot bien mélangé pour assurer une distribution uniforme des cellules. Pour ensemencer la plaque microfluidique, alignez la pointe de la pipette perpendiculairement à la lame tout en plaçant doucement la pointe au centre de l’entrée de gel pour assurer le contact, mais pas de pression lors de la distribution de 1,5 microlitres de solution hydrogel.Observez l’état de remplissage des canaux microfluidiques en regardant du haut de la plaque, du bas de la plaque ou au microscope. Évaluez le chargement à l’aide de ce chiffre comme guide. Une minute après le chargement, inverser la plaque tout en préparant le prochain aliquot.Répétez l’ensemencement de la plaque microfluidique pour les trois aliquots restants des cellules dans la solution HA. Une fois toutes les copeaux remplies, incuber la plaque à 37 degrés Celsius dans un incubateur humidifié 45 minutes jusqu’à ce que la gelation soit terminée. Après cela, en utilisant le manuel fourni, assurez-vous que le rocker de perfusion est installé dans l’incubateur de culture cellulaire avec le réglage de profusion correcte à l’angle de 14 degrés et les intervalles de quatre minutes.Ajouter 50 microlitres de milieu de culture cellulaire PDX à toutes les entrées moyennes. Appuyez doucement sur la plaque contre une surface pour encourager le liquide à remplir les canaux microfluidiques. Ensuite, retournez la plaque pour vérifier si les canaux sont remplis correctement.Ajouter 50 microlitres de DMEM/F-12 pour tous les médias. Si des bulles d’air sont piégées dans le canal de perfusion, retirez-les en tapant doucement la plaque contre une surface. À l’aide d’un formulaire de disposition du microscope et de la plaque, enregistrez le succès du remplissage des copeaux.Exclure les copeaux mal remplis de toute autre utilisation expérimentale. Placez la plaque sur un rocker incliné réglé sur une inclinaison de 14 degrés et un cycle de quatre minutes pour commencer la perfusion. Tous les deux jours, remplacer le milieu de culture PDX, d’abord 50 microlitres dans les entrées, puis 50 microlitres dans les points de vente.Dans cette étude, un rocker de perfusion programmable a été installé dans un incubateur standard de culture cellulaire en veste d’eau, et des lames microfluidiques à deux voies ont été préparées dans un coffret standard de biosécurité pour le chargement. La viabilité et la morphologie microfluidiques de culture de PDX ont été évaluées dans des conditions non séparées et de densité-gradient centrifugation-séparées. Le premier jour, les cultures qui ont subi la méthode de séparation présentaient dix fois moins de cellules mortes individuelles que les cultures non parées.Fait important, les grappes séparées se composaient principalement de cellules vivantes. Aucune différence statistiquement significative n’a été identifiée pour la distribution de la taille du cluster. Les cultures ont été maintenues dans la plaque microfluidique pendant sept jours.Le nombre total de cellules vivantes est demeuré constant, et les grappes ont conservé une viabilité d’environ 80 % au cours de la durée de vie de la culture. Rappelez-vous que chaque ligne PDX est unique, de sorte que la facilité de digestion tumorale, la taille phénotypique et la morphologie des grappes, et l’emplacement de l’amas dans la purification du gradient varie. Les cultures PDX établies à l’aide de cette méthode peuvent être assayées avec des analyses de viabilité basées sur l’image ou le lecteur de plaques, fixées et immunofluorescentes étiquetées, ou dissociées pour recueillir des lysates cellulaires pour d’autres protocoles.La méthode permettra aux chercheurs de récapituler le microenvironnement tumoral afin d’explorer la biologie ou la réponse médicamenteuse des cellules tumorales. Les utilisateurs doivent compléter la formation standard des sujets humains et la formation sur les pathogènes transmissibles par le sang avant de travailler avec des tissus d’origine humaine. L’équipement de protection individuelle approprié doit être porté.

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