Name: enhanced viability for ex vivo 3d hydrogel cultures of patient-derived xenografts in a perfused microfluidic platform
Uploaded: 2020-12-05T13:00:00
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Diese Arbeit wurde von national Institutes of Health National Cancer Institute SBIR Phase I (HHSN26120700015C) und P01CA098912 unterstützt.

Tumorgewebe wurde mit Zustimmung des Patienten und gemäß einem genehmigten Institutional Review Board (IRB) Protokoll erhalten. Xenografts wurden gemäß einem akzeptierten Protokoll des Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) implantiert, angebaut und geerntet.
HINWEIS: Alle Arbeiten sind in einem sterilen biologischen Sicherheitsschrank durchzuführen, um die Sterilität aufrechtzuerhalten. Alle Schritte sollten bei Raumtemperatur durchgeführt werden, sofern nicht anders angeg...

<ol>
	<li>Jung, J., Seol, H. S., Chang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Generation+and+Application+of+Patient-Derived+Xenograft+Model+for+Cancer+Research.">The Generation and Application of Patient-Derived Xenograft Model for Cancer Research.</a> Cancer Research and Treatment: Official Journal of Korean Cancer Association. 50 (1), 1-10 (2018).</li><li>Malaney, P., Nicosia, S. V., Dave, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One+mouse,+one+patient+paradigm:+New+avatars+of+personalized+cancer+therapy.">One mouse, one patient paradigm: New avatars of personalized cancer therapy.</a> Cancer Letters. 344 (1), 1-12 (2014).</li><li>Meehan, T. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PDX-MI:+Minimal+Information+for+Patient-Derived+Tumor+Xenograft+Models.">PDX-MI: Minimal Information for Patient-Derived Tumor Xenograft Models.</a> Cancer Research. 77 (21), 62-66 (2017).</li><li>Fong, E. L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogel-Based+3D+Model+of+Patient-Derived+Prostate+Xenograft+Tumors+Suitable+for+Drug+Screening.">Hydrogel-Based 3D Model of Patient-Derived Prostate Xenograft Tumors Suitable for Drug Screening.</a> Molecular Pharmaceutics. 11 (7), 2040-2050 (2014).</li><li>Fong, E. L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+3D+in+vitro+model+of+patient-derived+prostate+cancer+xenograft+for+controlled+interrogation+of+in+vivo+tumor-stromal+interactions.">A 3D in vitro model of patient-derived prostate cancer xenograft for controlled interrogation of in vivo tumor-stromal interactions.</a> Biomaterials. 77, 164-172 (2016).</li><li>Engel, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyaluronic+Acid-Based+Hydrogel+Formulations+Suitable+for+Automated+3D+High+Throughput+Drug+Screening+of+Cancer-Stromal+Cell+Cocultures.">Hyaluronic Acid-Based Hydrogel Formulations Suitable for Automated 3D High Throughput Drug Screening of Cancer-Stromal Cell Cocultures.</a> Advanced Healthcare Materials. 4 (11), 1664-1674 (2015).</li><li>Lanz, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapy+response+testing+of+breast+cancer+in+a+3D+high-throughput+perfused+microfluidic+platform.">Therapy response testing of breast cancer in a 3D high-throughput perfused microfluidic platform.</a> BMC Cancer. 17 (1), 709 (2017).</li><li>Wevers, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+compound+evaluation+on+3D+networks+of+neurons+and+glia+in+a+microfluidic+platform.">High-throughput compound evaluation on 3D networks of neurons and glia in a microfluidic platform.</a> Scientific Reports. 6, 38856 (2016).</li><li>Vulto, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phaseguides:+a+paradigm+shift+in+microfluidic+priming+and+emptying.">Phaseguides: a paradigm shift in microfluidic priming and emptying.</a> Lab on a Chip. 11 (9), 1596-1602 (2011).</li><li>Patru, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD133,+CD15/SSEA-1,+CD34+or+side+populations+do+not+resume+tumor-initiating+properties+of+long-term+cultured+cancer+stem+cells+from+human+malignant+glio-neuronal+tumors.">CD133, CD15/SSEA-1, CD34 or side populations do not resume tumor-initiating properties of long-term cultured cancer stem cells from human malignant glio-neuronal tumors.</a> BMC Cancer. 10, 66 (2010).</li><li>Harma, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+panel+of+three-dimensional+models+for+studies+of+prostate+cancer+growth,+invasion+and+drug+responses.">A comprehensive panel of three-dimensional models for studies of prostate cancer growth, invasion and drug responses.</a> PLoS One. 5 (5), 10431 (2010).</li></ol>

Hier beschreiben wir eine Methode zur Verarbeitung und Kultivierung lebensfähiger PDX-abgeleiteter Tumorzellen in einem durchdrungenen 3D-Kultursystem mit hohem Durchsatz. Während dieses Protokoll PCa PDX Gewebe verwendet, Es ist ebenso wirksam für andere epitheliale-abgeleitete Tumoren. Die Tumoreigenschaften variieren zwischen den einzelnen PDX-Linien sogar innerhalb desselben Ursprungsgewebes (Prostata, Brust usw.). Einige PCa PDX-Linien sind eher fibrotisch und schwierig, lebensfähige Zellen zu isolieren, währen...

In den letzten zehn Jahren hat der Bereich der Krebsforschung eine erneute Begeisterung für patientenabgeleitete Xenografts (PDXs) als Instrument zur Beurteilung der Abhängigkeit von Krebszellsignalen und der Arzneimittelanfälligkeit1gezeigt. Die gängigsten PDX-Modelle werden durch subkutane oder orthotopische Implantation menschlicher Tumorzellen – ein Tumorfragment, ein Cluster dissoziierter Tumorzellen oder eine Probe isolierter zirkulierender Tumorzellen (CTCs) – in einen Nagetierwirt etabliert. Wenn der Tumor "nehmen" erfolgreich ist, vermehren sich die Xenograft-Zellen, vermehren sich und interagieren auf andere Weise mit dem Wirtsgewebe, um einen Tumor zu erzeugen, der in einer optimalen Größe geerntet, unterteilt und wieder in andere Wirte eingepflanzt werden kann. Unter ihren vielen Vorteilen als Modellsystem behalten PDXs in der Regel einen wesentlichen Teil der Heterogenität der nativen Tumorzellpopulation bei und ermöglichen die Beurteilung von humanspezifischen Bahnen und Zellreaktionen2,3. Der in vivo-Kontext ermöglicht die Tumorinteraktion mit vaskulaturundig und anderen angrenzenden Stroma und rekapituliert Gewebeeigenschaften wie Arzneimitteldiffusionsdynamik, Sauerstoffspannung und extrazelluläre Matrixbeeinflussen, die die Tumorprogression biologisch und mechanisch beeinflussen. Ein negativer Aspekt von PDXs ist ihre Abhängigkeit von einem Nagetier-Wirt, sowohl für die Tumorexpansion als auch letztlich für Hypothesentests. Da sich viele PDX nicht an die traditionelle zweidimensionale (2D) Kultur auf Gewebekultur-Polystyrol anpassen können, ohne viele ihrer wünschenswerten Eigenschaften zu verlieren, gibt es für Forscher einen minimalen Mittelweg zwischen dieser relativ kontrollierten In-vitro-Methode und dem signifikanten Anstieg der Kosten, Einrichtungen und Zeitanforderungen für die In-vivo-PDX-Nutzung.
Wir haben mehrere In-vitro-Modelle beschrieben, die 3D-Zellkultur innerhalb einer unterstützenden Matrix implementieren, und vor kurzem erweitert, dass arbeite, um die Ex-vivo-Kultur von multiplem Prostatakrebs (PCa)-abgeleiteten PDXs zu demonstrieren, sowohl allein als auch in Co-Kultur mit Knochenmark-abgeleiteten Fibroblasten4,5. Hyaluronsäure (HA)-basierte Hydrogelmatrizen bieten anpassbare und biologisch relevante Unterstützung für beide Zelltypen, mit leichter Kontrolle über Hydrogeleigenschaften und optischer Klarheit für die Bildgebung durch die Hydrogeltiefe6.
Reife PDX-Tumorgewebe bestehen aus einer variablen Mischung aus heterogenen menschlichen Krebszellen und Mausstroma (Fibroblasten, Endothelzellen usw.). Um zelltypspezifische Beiträge zur Tumorprogression in vitro zu untersuchen, kann es vorteilhaft sein, Tumore zu dissoziieren, die Zellpopulationen zu trennen und experimentell in organisierter Weise zu integrieren, um Wege der interzellulären Kommunikation zu sezieren. Die gemischten Zellpopulationen in Gewebeverdauungen haben eine Differentialverträglichkeit mit bestimmten Kulturbedingungen. Beispielsweise erfordert die tumorassoziierte Fibroblasten-Lebensfähigkeit entweder die Oberflächenhaftung oder 3D-Matrizen, die mit Integrin-Liganden funktionalisiert sind, während epitheliale abgeleitete PDX-Zellen in der Regel nicht diese Anforderungen haben, sondern Zell-Zell-Wechselwirkungen bevorzugen. Diese Unterschiede können genutzt werden, um eine effektive Trennung von PDX-Zellen von kontaminierenden Mausstromalzellen zu erreichen. Die Rotationskultur von Gewebeverdauten ermöglicht die Anhaftung von Stromalzellen an der Gewebekulturoberfläche, während Zellzellverklebungen PDX-Zellen, die über der rotierenden Kulturoberfläche schweben, dazu bewegen, in 24 bis 48 h mehrzellige Cluster im Überstand zu bilden. Die spezifischen Eigenschaften dieser Cluster variieren mit dem PDX (z. B. große, enge, stark sphärische Cluster oder kleinere, lockerere Aggregate, die Traubentrauben ähneln), sind aber typischerweise biologisch relevant (Durchmesser 50 bis 250 m), ausreichend für die Beurteilung zellulärer Wechselwirkungen, die auf interzellulären Kontakten beruhen.
Tumor-Retrieval und -Verarbeitung führt unweigerlich zu einem gewissen Grad an Kollateralzelltod, entweder aufgrund kurzfristiger Schäden durch mechanische/enzymatische Störungen oder aufgrund langfristiger Inkompatibilität von Subpopulationen mit den gewählten Kulturbedingungen. Trotz der Nützlichkeit der Rotationskultur als anfängliche Massentrennung werden tot- oder sterbende Zellen unweigerlich mit den PDX-Clustern übertragen und können die resultierende Kultur beeinflussen. Bei diesen abgestorbenen Zellen handelt es sich oft um einzelne PDX-Zellen, die nicht in einen Cluster integriert waren, mausstromaler Fibroblasten, die unter ausgewählten Kulturbedingungen nicht überleben können, oder besonders fragile Endothelzellen. Solche sterbenden Zellen können experimentelle Ergebnisse von "Überlebenden" beeinflussen und die Quantifizierung wesentlich beeinflussen, z. B. durch fluoreszierende bildbasierte Durchführbarkeits-Screening-Assays. Um die Auswahl lebender PDX-Zellen aus dieser Methode zu verbessern, haben wir Zentrifugationsmethoden mit Dichteschritten angepasst, um einzelne abgestorbene/sterbende Zellen einfach aus PDX-Mischungen zu entfernen und überwiegend lebende mehrzellige Cluster zu behalten.
Um die Untersuchung von resultierenden PDX-abgeleiteten Clustern in der 3D-Kultur zu verbessern, haben wir eine mikrofluidics-basierte Perfusionskulturplattform verwendet, die OrganoPlate (Abbildung 1), die eine Hochdurchsatz-Organ-on-a-Chip-Plattform ist, die eine gleichzeitige Kultur von bis zu 96 einzelnen perfundierten 3D-Kulturen auf einer 384-well Mikrotiter-Plattenbasis ermöglicht (Abbildung 1A)7,8. In der 2-spurigen mikrofluidischen Platte wird ein einzelner Gewebechip durch zwei mikrofluidische Kanäle(Abbildung 1B, Gelkanal: rot, Perfusionskanal: blau) verbunden, die vier Brunnen hintereinander umfassen. Die beiden mikrofluidischen Kanäle sind durch einen kurzen Kunststoffrücken, den sogenannten Phaseguide, getrennt, der das Überlaufen eines Kanals in den angrenzenden Nachbarkanal verhindert und gleichzeitig eine membranfreie Schnittstelle zwischen dem Inhalt des Gels und dem Perfusionskanal9ermöglicht. Da der Boden der mikrofluidischen Platte aus mikroskopischem Glas besteht, können die Kulturen im Beobachtungsfenster durch den Boden der Platte mit einem Standard- oder automatisierten Mikroskop betrachtet werden. Perfusion wird in der mikrofluidischen Platte mit einer programmierbaren Wippe etabliert, mit Schwerkraft, um Medien durch die mikrofluidischen Kanäle zu treiben, zwischen Reservoirbrunnen (Abbildung 1C). Die Perfusions-Flow-Mimik rekapituliert die Tumormikroumgebung genauer als die statische Kultur, was die Einbeziehung von Scherspannung und eine verbesserte Verteilung von Gasen und Nährstoffen ermöglicht. Die Vorteile der Aufrechterhaltung einer durchbluteten Krebszellkultur in der mikrofluidischen Platte wurden zuvor als durchfundierte Brustkrebskulturen beschrieben, die eine optimale Lebensfähigkeit im Vergleich zu einer statischen 3D-Kultur der gleichen Zellen aufwiesen7.
Der vorliegende Bericht beschreibt eine angepasste Methode zur Zentrifugierung des Dichtegradienten zur Isolierung von lebenden mehrzelligen PDX-Clustern und demonstriert deren Nutzen bei der Etablierung von 3D-PDX-Kulturen innerhalb durchdringender mikrofluidischer Platten. Da immer mehr Forschungslaboratorien nach Methoden suchen, um die Verwendung von PDX zu erleichtern, gehen wir davon aus, dass die hier vorgestellten Protokolle sofort von Nutzen sein werden.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:812px;" width="812">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">1N NaOH</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td style="width:224px;">any suitable tissue culture grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">60 mm round tissue culture dishes</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td>any suitable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">6-well tissue culture plates</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td>any suitable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">70 &#181;m cell strainers</td>
			<td style="width:148px;">Corning</td>
			<td style="width:189px;">431751</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:251px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:148px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:189px;">5810R with suitable rotor and buckets for 15/50 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Density gradient centrifugation solution</td>
			<td style="width:148px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:189px;">P1644</td>
			<td>Percoll</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Dimethylsulfoxide</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td>any suitable tissue culture grade</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Dissociation enzyme solution</td>
			<td style="width:148px;">StemCell Technologies</td>
			<td style="width:189px;">07921</td>
			<td style="width:224px;">ACCUMAX</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">DMEM-F12</td>
			<td style="width:148px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:189px;">11039021</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Forceps</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td>any suitable</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">HA hydrogel kit</td>
			<td style="width:148px;">ESI BIO</td>
			<td style="width:189px;">GS311</td>
			<td style="width:224px;">HyStem (Hyaluronic acid-SH and PEGDA)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Hanks Balanced Salt Solution</td>
			<td style="width:148px;">Lonza</td>
			<td style="width:189px;">10-527F</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Heat-inactivated fetal bovine serum</td>
			<td style="width:148px;">Atlanta Biologicals</td>
			<td style="width:189px;">S11150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Hemocytometer</td>
			<td style="width:148px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:189px;">02-671-51B Hausser BrightLine</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Hoechst 33342</td>
			<td style="width:148px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:189px;">H1398</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Image processing software</td>
			<td style="width:148px;">Oxford Instruments</td>
			<td style="width:189px;">Imaris 9.3</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:251px;">LIVE/DEAD Cell Viability/Cytotoxicity Kit (Calcein-AM/Ethidium Homodimer-1)</td>
			<td style="width:148px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:189px;">L3224</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Microfluidic culture plate</td>
			<td style="width:148px;">Mimetas</td>
			<td style="width:189px;">9603-400-B</td>
			<td>2-lane OrganoPlate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Microscope</td>
			<td style="width:148px;">Nikon</td>
			<td style="width:189px;">A1R</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="68">
			<td height="68" style="height:68px;width:251px;">Multichannel pipette</td>
			<td style="width:148px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:189px;">3125000036</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:251px;">PDX-derived tumor tissue</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td style="width:224px;">obtained under IRB approval for human tissue and IACUC approval for animal host</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Penicillin-streptomycin</td>
			<td style="width:148px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:189px;">15140-122</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Perfusion rocker</td>
			<td style="width:148px;">Mimetas</td>
			<td style="width:189px;">OrganoPlate Perfusion Rocker Mini</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">pH strips (pH 5-9)</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td>any suitable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Phosphate-buffered saline solution</td>
			<td style="width:148px;">Lonza</td>
			<td style="width:189px;">17-516F</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Razor blades</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td>any suitable</td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;width:251px;">Rotating xy-shaker</td>
			<td style="width:148px;">VWR</td>
			<td style="width:189px;">Advanced 3500 Orbital Shaker</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Scalpel handle</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td>any suitable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Single channel repeating pipette</td>
			<td style="width:148px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:189px;">22260201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Sterile, 15mL conical centrifuge tubes</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td>any suitable</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Sterile, 50mL conical centrifuge tubes</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td>any suitable</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

enhanced viability for ex vivo 3d hydrogel cultures of patient-derived xenografts in a perfused microfluidic platform

Patienten-abgeleitete Xenografts (PDX), die entstehen, wenn resektiertes Tumorgewebe des Patienten direkt in immungeschwächte Mäuse eingepfropft wird, bleiben biologisch stabil, wodurch molekulare, genetische und histologische Merkmale sowie Heterogenität des ursprünglichen Tumors erhalten bleiben. Die Verwendung dieser Modelle zur Durchführung einer Vielzahl von Experimenten, einschließlich des Drogenscreenings, ist jedoch sowohl in Bezug auf die Kosten als auch auf die Zeit unerschwinglich. Dreidimensionale (3D) Kultursysteme werden weithin als Plattformen betrachtet, in denen Krebszellen ihre biologische Integrität durch biochemische Wechselwirkungen, Morphologie und Architektur behalten. Unser Team verfügt über umfangreiche Erfahrung in der Kultivierung von PDX-Zellen in vitro mit 3D-Matrizen aus Hyaluronsäure (HA). Um mit PDXs assoziierte Maus-Fibroblasten-Stromalzellen zu trennen, verwenden wir Rotationskultur, bei der Stromalzellen an der Oberfläche von gewebekulturbehandelten Platten haften, während dissoziierte PDX-Tumorzellen schweben und sich selbst zu multizellulären Clustern verbinden. Ebenfalls im Überstand schweben einzelne, oft abgestorbene Zellen, die eine Herausforderung darstellen, lebensfähige PDX-Cluster für die nachgeschaltete Verkapselung in Hydrogele für die 3D-Zellkultur zu sammeln. Um diese Einzelzellen von lebenden Zellclustern zu trennen, haben wir die Zentrifuge des Dichteschrittgradienten eingesetzt. Das hier beschriebene Protokoll ermöglicht die Erschöpfung nicht lebensfähiger Einzelzellen aus der gesunden Population von Zellclustern, die für weitere In-vitro-Experimente verwendet werden. In unseren Studien integrieren wir die 3D-Kulturen in mikrofluidische Platten, die eine Mediendurchblutung während der Kultur ermöglichen. Nach der Bewertung der resultierenden Kulturen unter Verwendung eines fluoreszierenden bildbasierten Lebensfähigkeits-Assays von gereinigten versus nicht gereinigten Zellen zeigen unsere Ergebnisse, dass dieser zusätzliche Trennungsschritt die Anzahl der nicht lebensfähigen Zellen aus unseren Kulturen erheblich reduziert hat.

In einem Standard-Inkubator für wassergeknickte Zellkulturen wurde eine programmierbare Perfusionswippe und in einem Standard-Biosicherheitsschrank zweispurige mikrofluidische Platten für die Beladung vorbereitet (Abbildung 1). Ein MDA-PCA-118b PDX-Tumor wurde in vivo erweitert, geerntet, wenn er eine maximale Größe erreicht hatte, und sich wie in Protokollabschnitt 2 beschrieben distanziert, um eine Güllesuspension von Zellen zu erzeugen, in etwa einem einzelzelligen Zustand<strong cla...

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Enhanced Viability for Ex vivo 3D Hydrogel Cultures of Patient-Derived Xenografts in a Perfused Microfluidic Platform

Dieses Protokoll zeigt Methoden, um eine erweiterte In-vitro-Kultur von patientenabgeleiteten Xenografts (PDX) zu ermöglichen. Ein Schritt verbessert die Gesamtlebensfähigkeit von mehrzelligen Clusterkulturen in 3D-Hydrogelen durch die einfache Entfernung nicht lebensfähiger Einzelzellen. Ein sekundärer Schritt veranschaulicht Best Practices für PDX-Kultur in einer durchsetzten mikrofluidischen Plattform.

Verbesserte Lebensfähigkeit für Ex vivo 3D Hydrogelkulturen von patientenabgeleiteten Xenografts in einer perfused Microfluidic Platform

Patient-derived xenografts (PDX), generated when resected patient tumor tissue is engrafted directly into immunocompromised mice, remain biologically ...

Verbesserte Kulturmethoden für patientenabgeleitete Tumorproben sind von entscheidender Bedeutung, da sich das Feld von der Verwendung konventioneller Zelllinien entfernt. Dieses Protokoll ermöglicht die In-vitro-Kultur von Patienten-abgeleiteten Tumorzellen in einer Plattform, die im Gegensatz zu in vivo Krebsmodellen einem hohen Durchsatz und einem hohen Gehalt zugänglich ist. Die Plattform mit PDXs ermöglicht es uns, heterogenere Systeme zu bewerten, die native Tumoren reflektieren.Dies kann Einblicke in Arzneimittelmechanismen geben und ein schnelleres Drogenscreening ermöglichen. Die Methode könnte durch die Einbeziehung von Stroma, Endothel und Immunzellen erweitert werden. Diese Kokulturen könnten noch reflektierter über die einheimische Tumorpopulation und Architektur sein.Üben Sie das Beladen der mikrofluidischen Platten mit leicht expandierten Zelllinien, um sehr kompetent zu werden, bevor Sie auf wertvollere Zellen wie PDXs umstellen. Die Ausrichtung während der Plattendosierung wirkt sich stark auf den Erfolg aus, und eine visuelle Demonstration kann dieses Konzept leicht vermitteln. Um zu beginnen, übertragen Tumorgewebe in eine vorgewogene sterile 50-Milliliter konische Röhre.Spülen Sie sechsmal mit 30 Milliliter sterilen PBS, um Blut und Verunreinigungen zu entfernen. Entfernen Sie so viel Flüssigkeit wie möglich, und wiegen Sie das Tumorgewebe. Übertragen Sie das Tumorgewebe in eine 60-Millimeter-Runde Gewebekulturschale und verwenden Sie eine sterile Rasierklinge oder ein Skalpell, um es in Ein-Millimeter-Stücke zu zerkleinern.Fügen Sie fünf Milliliter PDX-Verarbeitungsmedium hinzu, um die Tumorschlämme zu sammeln. Fügen Sie fünf Milliliter Dissoziationsenzymlösung hinzu, um die Tumorschlämme zu sammeln. Spülen Sie das Kulturgericht mit weiteren fünf Millilitern Dissoziationsenzymlösung.Fügen Sie dann fünf Milliliter PDX-Verarbeitungsmedium hinzu. 20 Minuten bei 37 Grad Celsius mit sanftem Schütteln bebrüten. Auf halbem Weg durch die Inkubationszeit, wirbeln Sie das Rohr sanft.Nach der Inkubation Pipette sanft mit einer serologischen Pipette auf und ab, um Klumpen aufzubrechen. Legen Sie ein 70-Mikrometer-Zellsieb über eine neue sterile 50-Milliliter-Röhre und filtern Sie die Zellen. Dann Zentrifuge bei 1, 200 U/min für zwei Minuten, um die Zellen zu pellet.Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie in zwei bis drei Milliliter PDX-Kulturmedium. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer oder einem automatisierten Zellzähler. Verwenden Sie diese Tabelle, um die erforderliche Anzahl der zugeordneten PDX-abgeleiteten Zellen zu schätzen, die erforderlich sind, um die gewünschte Zelldichte pro Chip zu erreichen.Platte ein- bis zweimal 10 bis zu den sechs Zellen in fünf Millilitern PDX-Kulturmedium pro Brunnen einer Sechs-Well-Gewebekulturplatte. 48 Stunden bei 37 Grad Celsius, 5% Kohlendioxid und 95% Luftfeuchtigkeit mit sanftem Schütteln bei 50 bis 55 Umdrehungen pro Minute inkubieren, um die Clusterbildung zu fördern. Nachdem sich die Cluster gebildet haben, fahren Sie mit der Zentrifugierung fort.Bereiten Sie zunächst 20 Milliliter 100%Dichte Gradientenlösung durch gründliches Mischen von 18 Milliliter Dichte Gradient Zentrifugationslösung mit zwei Milliliter sterilen 10X HBSS in einem sterilen 50-Milliliter konischen Rohr. Verdünnen Sie diese 100%-Lösung mit sterilen 1X HBSS, um 10 Milliliter von je 20%30%40% und 55%dichte Gradientenlösungen herzustellen. Fügen Sie drei Milliliter mit einer 55%dichte Gradientenlösung an den Boden eines 15-Milliliter konischen Rohres.Halten Sie das Rohr in einem Winkel, geben Sie langsam drei Milliliter 40%Dichte Gradient Lösung auf die abgewinkelte Seite des Rohres und auf der Oberseite der 55%-Schicht. Wiederholen Sie dies mit der 30%dichte Gradientenlösung. Dann sammeln Sie den Überstand der PDX-Rotationskulturen mit einer fünf Milliliter serologischen Pipette in ein Rohr und spülen die Plattenoberfläche sanft.Zentrifugieren Sie bei 1 200 U/min für zwei Minuten, um Zellen zu pellet. Entfernen Sie den Überstand, und setzen Sie das Zellpellet in drei Millilitern mit 20%Dichte Gradientenlösung wieder auf. Schichtung der 20%dichte Gradientenlösung mit Zellen auf der Oberseite des Farbverlaufs in der 15-Milliliter-Röhre.Kappen Sie die Rohre und Zentrifuge in einer Schwenkschaufel-Rotorzentrifuge 30 Minuten bei vier Grad Celsius, 2.000 mal G und Null-Break. Nach der Zentrifugation sind Brüche sichtbar. Lebensfähige PDX-Zellkulturen finden sich in der Regel an der Schnittstelle für Gradientenmitarbeitslösungen mit 40 bis 55 %.Sammeln Sie zwei bis drei Milliliter pro Fraktion in frische 15-Milliliter-Röhren. Fügen Sie drei bis vier Bände sterilen 1X HBSS zu jeder Fraktion hinzu und invertieren Sie gründlich. Zentrifuge bei 1.000 mal G für drei Minuten, um die Zellen zu pellet.Entfernen Sie den Überstand. Setzen Sie das Zellpellet in ein bis zwei Milliliter PDX-Verarbeitungsmedium wieder auf. Übertragen Sie ein kleines Aliquot zwischen 50 bis 100 Mikroliter in eine Röhre, und fügen Sie ein gleiches Volumen der Dissoziationsenzymlösung für die Redissoziation hinzu.Bewerten Sie die Zellennummer in der geclusterten Zellsuspension. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer oder einem automatisierten Zellzähler. Rekonstituieren Sie Hyaluronsäure-Hydrogel-Lösungen gemäß den Anweisungen des Herstellers.Mit einer Mehrkanalpipette 50 Mikroliter HBSS in allen Brunnen in Beobachtungsfenstersäulen einer zweispurigen mikrofluidischen Platte hinzufügen, um die Kulturfeuchtigkeit und optimale Bildbedingungen aufrechtzuerhalten. Berechnen Sie das Volumen der Zellsuspension, das für 50 Mikroliter Hydrogel bei der gewünschten Zelldichte benötigt wird, z. B. 5.000 Zellen pro Mikroliter. Für die Aussaat einer mikrofluidischen Platte wird das berechnete Volumen in jeweils vier sterile 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhren einfließen lassen.Stellen Sie den pH-Wert der HA-Thiol-Lösung unmittelbar vor der Anwendung auf acht mit 1 normalem Natriumhydroxid ein. Führen Sie eine Testgelation durch Mischen von 40 Mikroliter HA Thiol mit 10 Mikroliter PEGdA und Überwachung der Gelation im Laufe der Zeit. Als nächstes zentrifugieren Sie die Zellsuspension für zwei Minuten bei 200 mal G und Raumtemperatur, um die Zellen zu pellet.Entfernen Sie vorsichtig den Überstand und setzen Sie die Zellen in 40 Mikroliter HA-Thiol für ein 50-Mikroliter-Endvolumen wieder aus. Fügen Sie 10 Mikroliter PEGdA zu einem Aliquot der Zellen von HA Thiol hinzu. Gut mischen und ein bis drei Minuten warten, bevor Sie die mikrofluidische Platte säen.Befestigen Sie einen Tipp für die Abgabe von 1,5 Mikrolitern auf eine einkanalige, sich wiederholende Pipette und laden Sie sie mit den Zellen in ha Hydrogellösung. Denken Sie daran, den Wasserstoff aliquot gut gemischt zu halten, um eine gleichmäßige Zellverteilung zu gewährleisten. Um die mikrofluidische Platte auszusäen, richten Sie die Pipettespitze senkrecht zur Klinge aus, während Sie die Spitze vorsichtig in die Mitte des Geleinlasses legen, um kontaktzufinden, aber keinen Druck zu gewährleisten, wenn 1,5 Mikroliter Hydrogellösung dosiert werden.Beobachten Sie den Füllstatus der mikrofluidischen Kanäle, indem Sie von der Oberseite der Platte, der Unterseite der Platte oder durch das Mikroskop betrachten. Bewerten Sie die Belastung anhand dieser Abbildung als Leitfaden. Eine Minute nach dem Laden, invertiert die Platte, während sie sich auf das nächste Aliquot vorbereiten.Wiederholen Sie die Aussaat der mikrofluidischen Platte für die verbleibenden drei Aliquoten von Zellen in HA-Lösung. Nachdem alle Chips gefüllt sind, bebrüten die Platte bei 37 Grad Celsius in einem befeuchteten Inkubator 45 Minuten, bis die Gelation abgeschlossen ist. Danach stellen Sie mithilfe des mitgelieferten Handbuchs sicher, dass die Perfusionswippe im Zellkultur-Inkubator mit der richtigen Profusionseinstellung im 14-Grad-Winkel und vier Minuten-Intervallen installiert ist.Fügen Sie 50 Mikroliter PDX-Zellkulturmedium zu allen mittleren Einlässe hinzu. Tippen Sie vorsichtig auf die Platte an einer Oberfläche, um die Flüssigkeit zu ermutigen, die mikrofluidischen Kanäle zu füllen. Dann kippen Sie die Platte, um zu überprüfen, ob die Kanäle richtig gefüllt sind.Fügen Sie 50 Mikroliter DMEM/F-12 für alle Medien hinzu. Wenn Luftblasen im Perfusionskanal gefangen sind, entfernen Sie durch sanftes Antippen der Platte gegen eine Oberfläche. Mit einem Mikroskop und Plattenlayout Form, Rekord Chip Füllung Erfolg.Nicht ordnungsgemäß gefüllte Chips von der weiteren experimentellen Verwendung ausschließen. Platzieren Sie die Platte auf einer kippbaren Wippe, die auf eine 14-Grad-Neigung und einen Vier-Minuten-Zyklus eingestellt ist, um mit der Perfusion zu beginnen. Ersetzen Sie alle zwei Tage das PDX-Kulturmedium, zuerst 50 Mikroliter in den Einlässen, dann 50 Mikroliter in den Auslässen.In dieser Studie wurde eine programmierbare Perfusionswippe in einem Standard-Inkubator für Wassermantel-Zellkultur installiert und zweispurige mikrofluidische Klingen wurden in einem Standard-Biosicherheitsschrank für die Beladung vorbereitet. Die Lebensfähigkeit und Morphologie der mikrofluidischen PDX-Kultur in 3D wurde sowohl unter ungetrennten als auch unter Dichtegradienten zentrifugationsgetrennten Bedingungen bewertet. Am ersten Tag zeigten jene Kulturen, die der Trennungsmethode unterzogen wurden, zehnmal weniger einzelne tote Zellen als ungetrennte Kulturen.Wichtig ist, dass die getrennten Cluster hauptsächlich aus lebenden Zellen bestanden. Für die Clustergrößenverteilung wurde kein statistisch signifikanter Unterschied festgestellt. Die Kulturen wurden sieben Tage lang in der mikrofluidischen Platte gepflegt.Die Gesamtzahl der lebenden Zellen blieb konsistent, und Cluster behielten während des gesamten Lebenszyklus der Kultur etwa 80 % der Lebensfähigkeit bei. Denken Sie daran, dass jede PDX-Linie einzigartig ist, so dass die Einfache der Tumorverdauung, die phänotypische Größe und Morphologie von Clustern und die Position des Clusters innerhalb der Gradientenreinigung variieren. PDX-Kulturen, die mit dieser Methode hergestellt wurden, können mit bild- oder plattenleserbasierten Lebensfähigkeits-Assays, fixiert und immunfluoreszierend gekennzeichnet oder dissoziiert werden, um Zelllysate für andere Protokolle zu sammeln.Die Methode wird es Forschern ermöglichen, die Tumormikroumgebung zu rekapitulieren, um die Biologie oder die medikamentöse Reaktion von Tumorzellen zu erforschen. Benutzer sollten Standard-Schulung für menschliche Probanden und blutübertragene Krankheitserreger-Training vor der Arbeit mit menschlichen Geweben. Entsprechende persönliche Schutzausrüstung sollte getragen werden.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

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Forschung

Krebsforschung

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