Name: enhanced viability for ex vivo 3d hydrogel cultures of patient-derived xenografts in a perfused microfluidic platform
Uploaded: 2020-12-05T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Enhanced Viability for Ex vivo 3D Hydrogel Cultures of Patient-Derived Xenografts in a Perfused Microfluidic Platform at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות המכון הלאומי לסרטן SBIR שלב I (HHSN26120700015C) ו P01CA098912.

רקמת הגידול הושגה בהסכמת המטופל ועל פי פרוטוקול ועדת הביקורת המוסדית (IRB) שאושרה. Xenografts הושתלו, גדלו, ונקצרו על פי פרוטוקול מקובל לטיפול בבעלי חיים ושימוש (IACUC).
הערה: כל העבודה תבוצע בקבינט בטיחות ביולוגי סטרילי כדי לשמור על עקרות. יש לבצע את כל השלבים בטמפרטורת החדר אלא אם צו?...

<ol>
	<li>Jung, J., Seol, H. S., Chang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Generation+and+Application+of+Patient-Derived+Xenograft+Model+for+Cancer+Research.">The Generation and Application of Patient-Derived Xenograft Model for Cancer Research.</a> Cancer Research and Treatment: Official Journal of Korean Cancer Association. 50 (1), 1-10 (2018).</li><li>Malaney, P., Nicosia, S. V., Dave, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One+mouse,+one+patient+paradigm:+New+avatars+of+personalized+cancer+therapy.">One mouse, one patient paradigm: New avatars of personalized cancer therapy.</a> Cancer Letters. 344 (1), 1-12 (2014).</li><li>Meehan, T. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PDX-MI:+Minimal+Information+for+Patient-Derived+Tumor+Xenograft+Models.">PDX-MI: Minimal Information for Patient-Derived Tumor Xenograft Models.</a> Cancer Research. 77 (21), 62-66 (2017).</li><li>Fong, E. L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogel-Based+3D+Model+of+Patient-Derived+Prostate+Xenograft+Tumors+Suitable+for+Drug+Screening.">Hydrogel-Based 3D Model of Patient-Derived Prostate Xenograft Tumors Suitable for Drug Screening.</a> Molecular Pharmaceutics. 11 (7), 2040-2050 (2014).</li><li>Fong, E. L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+3D+in+vitro+model+of+patient-derived+prostate+cancer+xenograft+for+controlled+interrogation+of+in+vivo+tumor-stromal+interactions.">A 3D in vitro model of patient-derived prostate cancer xenograft for controlled interrogation of in vivo tumor-stromal interactions.</a> Biomaterials. 77, 164-172 (2016).</li><li>Engel, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyaluronic+Acid-Based+Hydrogel+Formulations+Suitable+for+Automated+3D+High+Throughput+Drug+Screening+of+Cancer-Stromal+Cell+Cocultures.">Hyaluronic Acid-Based Hydrogel Formulations Suitable for Automated 3D High Throughput Drug Screening of Cancer-Stromal Cell Cocultures.</a> Advanced Healthcare Materials. 4 (11), 1664-1674 (2015).</li><li>Lanz, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapy+response+testing+of+breast+cancer+in+a+3D+high-throughput+perfused+microfluidic+platform.">Therapy response testing of breast cancer in a 3D high-throughput perfused microfluidic platform.</a> BMC Cancer. 17 (1), 709 (2017).</li><li>Wevers, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+compound+evaluation+on+3D+networks+of+neurons+and+glia+in+a+microfluidic+platform.">High-throughput compound evaluation on 3D networks of neurons and glia in a microfluidic platform.</a> Scientific Reports. 6, 38856 (2016).</li><li>Vulto, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phaseguides:+a+paradigm+shift+in+microfluidic+priming+and+emptying.">Phaseguides: a paradigm shift in microfluidic priming and emptying.</a> Lab on a Chip. 11 (9), 1596-1602 (2011).</li><li>Patru, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD133,+CD15/SSEA-1,+CD34+or+side+populations+do+not+resume+tumor-initiating+properties+of+long-term+cultured+cancer+stem+cells+from+human+malignant+glio-neuronal+tumors.">CD133, CD15/SSEA-1, CD34 or side populations do not resume tumor-initiating properties of long-term cultured cancer stem cells from human malignant glio-neuronal tumors.</a> BMC Cancer. 10, 66 (2010).</li><li>Harma, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+panel+of+three-dimensional+models+for+studies+of+prostate+cancer+growth,+invasion+and+drug+responses.">A comprehensive panel of three-dimensional models for studies of prostate cancer growth, invasion and drug responses.</a> PLoS One. 5 (5), 10431 (2010).</li></ol>

כאן אנו מתארים שיטה לעיבוד ולתחכות תאים סרטניים הנגזרים מ-PDX בתפוקה גבוהה, מערכת תרבות תלת-מית-מיומת. בעוד פרוטוקול זה מנצל רקמת PCa PDX, זה יעיל באותה מידה עבור גידולים אחרים נגזר אפיתל. מאפייני הגידול משתנים בין קווי PDX בודדים גם בתוך אותה רקמה של מקור (ערמונית, שד, וכו '). קווי PDX מסוימים PCa הם פי...

במהלך העשור האחרון, התחום של מחקר סרטן הפגין התלהבות מחודשת עבור xenografts נגזר החולה (PDXs) ככלי להערכת הסתמכות מסלול תא סרטניורגישות לסמים 1. מודלי PDX הנפוצים ביותר מבוססים על ידי השתלה תת עורית או אורתוטופית של תאים סרטניים אנושיים – שבר גידול, מקבץ של תאים נגזרים גידול תותק, או מדגם של תאים סרטניים מבודדים במחזור (CTCs)- לתוך מארח מכרסם. אם הגידול "לקחת" הוא מוצלח, תאי xenograft יהיה להתרבות, כלי דם, ואחרת אינטראקציה עם רקמת המארח כדי ליצור גידול, אשר ניתן לקצור בגודל אופטימלי, מחולק, מושתל מחדש לתוך מארחים אחרים. בין היתרונות הרבים שלהם כמערכת מודל, PDXs בדרך כלל לשמור על חלק ניכר של הטרוגניות של אוכלוסיית תאי הגידול הילידים ולאפשר את ההערכה של מסלולים ספציפיים לבניאדם ותגובות תא 2,,3. בהקשר vivo מאפשר אינטראקציה גידול עם כלי דם סטרומה סמוכים אחרים ומאפייני רקמות recapitulates כגון דינמיקת דיפוזיה סמים, מתח חמצן, מטריצה חוץ תאית השפעה כי ביולוגית ומכאנית להשפיע על התקדמות הגידול. היבט שלילי של PDXs הוא ההסתמכות שלהם על מארח מכרסמים, הן להרחבת הגידול ובסופו של דבר לבדיקת השערה. מכיוון PDXs רבים לא יכול להסתגל לתרבות דו מימדית מסורתית (2D) על פוליסטירן תרבות רקמות מבלי לאבד רבים מהמאפיינים הרצויים שלהם, יש כבר קרקע ביניים מינימלית עבור חוקרים בין זה מבוקר יחסית בשיטת המבחנה, ואת העלייה המשמעותית בהוצאות, מתקנים, ודרישות זמן לשימוש vivo PDX.
תיארנו מספר מודלים במבחנה המיישמים תרבות תא 3D בתוך מטריצה תומכת, ולאחרונה הרחיבו את העבודה כדי להדגים את תרבות vivo לשעבר של סרטן הערמונית מרובים (PCa)נגזר PDXs, הן לבד והן בתרבות שיתופית עם פיברובלסטים נגזר מחעצם 4,5. מטריצות הידרוג'ל מבוססות חומצה היאלורונית (HA) מספקות תמיכה הניתנת להתאמה אישית ורלוונטית ביולוגית לשני סוגי התאים, עם שליטה שנייה על מאפייני הידרוג'ל ובהירות אופטית להדמיה דרך עומק הידרוג'ל6.
רקמות גידול PDX בוגרות מהוות תערובת משתנה של תאים סרטניים אנושיים הטרוגניים סטרומה העכבר (פיברובלסטים, תאים אנדותל, וכו '). כדי ללמוד את סוג התא תרומות ספציפיות להתקדמות הגידול במבחנה, זה יכול להיות יתרון לנתק גידולים, להפריד את אוכלוסיות התא, ובאופן ניסיוני לשלב אותם באופן מאורגן לנתח מסלולים של תקשורת בין תאית. אוכלוסיות תאים מעורבים בתוך עיכול רקמות יש תאימות דיפרנציאלית עם תנאי תרבות ספציפיים. לדוגמה, הכדאיות פיברובלסט הקשורים לגידול מחייבת דבקות פני השטח או מטריצות תלת-מידור פונקציונליות עם ליגנדים אינטגריים, בעוד תאי PDX נגזר אפיתל אין בדרך כלל דרישות אלה, במקום להעדיף אינטראקציות תא. הבדלים אלה ניתן לנצל כדי להשיג הפרדה יעילה של תאי PDX מתאי סטרומה עכבר מזהמים. תרבות סיבוב של עיכול רקמות מאפשרת דבקות תא סטרומה על פני השטח של תרבות הרקמה בעוד הדבקות תא כונן תאי PDX מרחפים מעל פני השטח של התרבות מסתובבת כדי ליצור אשכולות רב-תאיים supernatant ב 24-48 שעות. המאפיינים הספציפיים של אשכולות אלה משתנים בהתאם ל-PDX (לדוגמה, אשכולות גדולים, הדוקים, כדוריים מאוד או אגרגטים קטנים ורופפים יותר הדומים לאגמים של ענבים), אך הם בדרך כלל בגדלים רלוונטיים ביולוגית (קוטר 50-250 μm), מספיקים להערכת אינטראקציות תאיות המסתמכות על אנשי קשר בין-תאיים.
אחזור גידול ועיבוד באופן בלתי נמנע גורמת במידה מסוימת של מוות בתאים משניים, בין אם בשל נזק לטווח קצר של שיבוש מכני/אנזימטי, או אי-תאימות לטווח ארוך של תת-אוכלוסיות בתנאי התרבות הנבחרים. למרות התועלת של תרבות סיבוב כהפרדה בתפזורת ראשונית, תאים מתים או גוססים מועברים באופן בלתי נמנע עם אשכולות PDX יכול להשפיע על התרבות שנוצרה. תאים מתים אלה הם לעתים קרובות תאי PDX בודדים שלא שולבו באשכול, פיברובלסטים סטרומה עכבר שלא יכול לשרוד בתנאי תרבות נבחרים, או תאים אנדותל שביר במיוחד. תאים גוססים כאלה יכולים להשפיע על תוצאות ניסיוניות של "ניצולים" ויכולים להשפיע באופן משמעותי על כימות, למשל, באמצעות בדיקות ההקרנה מבוססות התדמית של פלורסנט. כדי לשפר את הבחירה של תאי PDX חיים משיטה זו, התאמנו שיטות צנטריפוגציה עם שלבי צפיפות כדי להסיר בקלות תאים מתים/ גוססים בודדים מתערובות PDX ולשמור בעיקר אשכולות רב-תאיים חיים.
כדי לשפר את המחקר של אשכולות נגזר PDX תוצאות בתרבות 3D, השתמשנו בפלטפורמת תרבות פרייז'יה מבוססת מיקרו-נוזלים, OrganoPlate (איור 1), שהיא פלטפורמת איבר-על-שבב בתפוקה גבוהה המאפשרת תרבות בו-זמנית של עד 96 תרבויות בודדות, תלת-מית-מיוד, על בסיס צלחת מיקרוטיטר 384 באר(איור 1A)7,,8. בצלחת מיקרו-נוזלת דו-מסלולית, שבב רקמה יחיד מחובר באמצעות שני ערוצים מיקרופלוידיק(איור 1B,ערוץ ג'ל: אדום, ערוץ זלב: כחול) המשתרעים על פני ארבע בארות ברציפות. שני הערוצים המיקרו-נוזלים מופרדים על ידי רכס פלסטיק קצר הנקרא Phaseguide המונע גלישה של ערוץ אחד לתוך ערוץ השכן הסמוך לו, ובו זמנית מאפשר ממשק ללא קרום בין תכולת הג'ל לערוץהזבר 9. מכיוון שתחתית הלוח המיקרוסקופי מורכבת מזכוכית ברמת מיקרוסקופ, ניתן לצפות בתרבויות בחלון התצפית דרך תחתית הצלחת עם מיקרוסקופ סטנדרטי או אוטומטי. התזתה מבוססת בצלחת microfluidic עם נדנדה לתכנות, באמצעות כוח המשיכה כדי להניע את המדיה דרך הערוצים microfluidic, בין בארות מאגר(איור 1C). זרימת העירוי-לחקות באופן הדוק יותר recapitulates microenvironment הגידול מאשר תרבות סטטית, המאפשר התאגדות של מתח גיזר והפצה משופרת של גזים וחומרים מזינים. היתרונות של שמירה על תרבות תאים סרטניים מנוון בצלחת microfluidic תוארו בעבר כתרביות סרטן השד חדורים הפגינו קיימות אופטימלית לעומת תרבות 3D סטטי של אותם תאים7.
הדו"ח הנוכחי מתאר שיטת צנטריפוגציה הדרגתית מותאמת של צפיפות לבידוד אשכולות PDX רב-תאיים חיים ומדגים את כלי הפעולה שלה בהקמת תרבויות PDX תלת-מימדיות בתוך לוחות מיקרו-נוזלים חד-תכליתיים. מכיוון שמספר גדל והולך של מעבדות מחקר מחפשות שיטות להקל על השימוש ב-PDX, אנו צופים כי הפרוטוקולים המוצגים כאן יהיו של תועלת מיידית.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:812px;" width="812">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">1N NaOH</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td style="width:224px;">any suitable tissue culture grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">60 mm round tissue culture dishes</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td>any suitable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">6-well tissue culture plates</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td>any suitable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">70 &#181;m cell strainers</td>
			<td style="width:148px;">Corning</td>
			<td style="width:189px;">431751</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:251px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:148px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:189px;">5810R with suitable rotor and buckets for 15/50 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Density gradient centrifugation solution</td>
			<td style="width:148px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:189px;">P1644</td>
			<td>Percoll</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Dimethylsulfoxide</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td>any suitable tissue culture grade</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Dissociation enzyme solution</td>
			<td style="width:148px;">StemCell Technologies</td>
			<td style="width:189px;">07921</td>
			<td style="width:224px;">ACCUMAX</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">DMEM-F12</td>
			<td style="width:148px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:189px;">11039021</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Forceps</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td>any suitable</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">HA hydrogel kit</td>
			<td style="width:148px;">ESI BIO</td>
			<td style="width:189px;">GS311</td>
			<td style="width:224px;">HyStem (Hyaluronic acid-SH and PEGDA)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Hanks Balanced Salt Solution</td>
			<td style="width:148px;">Lonza</td>
			<td style="width:189px;">10-527F</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Heat-inactivated fetal bovine serum</td>
			<td style="width:148px;">Atlanta Biologicals</td>
			<td style="width:189px;">S11150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Hemocytometer</td>
			<td style="width:148px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:189px;">02-671-51B Hausser BrightLine</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Hoechst 33342</td>
			<td style="width:148px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:189px;">H1398</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Image processing software</td>
			<td style="width:148px;">Oxford Instruments</td>
			<td style="width:189px;">Imaris 9.3</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:251px;">LIVE/DEAD Cell Viability/Cytotoxicity Kit (Calcein-AM/Ethidium Homodimer-1)</td>
			<td style="width:148px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:189px;">L3224</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Microfluidic culture plate</td>
			<td style="width:148px;">Mimetas</td>
			<td style="width:189px;">9603-400-B</td>
			<td>2-lane OrganoPlate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Microscope</td>
			<td style="width:148px;">Nikon</td>
			<td style="width:189px;">A1R</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="68">
			<td height="68" style="height:68px;width:251px;">Multichannel pipette</td>
			<td style="width:148px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:189px;">3125000036</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:251px;">PDX-derived tumor tissue</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td style="width:224px;">obtained under IRB approval for human tissue and IACUC approval for animal host</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Penicillin-streptomycin</td>
			<td style="width:148px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:189px;">15140-122</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Perfusion rocker</td>
			<td style="width:148px;">Mimetas</td>
			<td style="width:189px;">OrganoPlate Perfusion Rocker Mini</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">pH strips (pH 5-9)</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td>any suitable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Phosphate-buffered saline solution</td>
			<td style="width:148px;">Lonza</td>
			<td style="width:189px;">17-516F</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Razor blades</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td>any suitable</td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;width:251px;">Rotating xy-shaker</td>
			<td style="width:148px;">VWR</td>
			<td style="width:189px;">Advanced 3500 Orbital Shaker</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Scalpel handle</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td>any suitable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Single channel repeating pipette</td>
			<td style="width:148px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:189px;">22260201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Sterile, 15mL conical centrifuge tubes</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td>any suitable</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Sterile, 50mL conical centrifuge tubes</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td>any suitable</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

enhanced viability for ex vivo 3d hydrogel cultures of patient-derived xenografts in a perfused microfluidic platform

קסנוגרפטים נגזר החולה (PDX), שנוצר כאשר רקמת הגידול המטופל נותח הוא חרט ישירות לתוך עכברים חיסוניים, להישאר יציב ביולוגית, ובכך שמירה על מולקולרי, גנטי, ותכונות היסטולוגיות, כמו גם הטרוגניות של הגידול המקורי. עם זאת, שימוש במודלים אלה כדי לבצע מספר רב של ניסויים, כולל סינון סמים, הוא אסור הן מבחינת עלות וזמן. מערכות תרבות תלת מימדיות (תלת-ממדיות) נתפסות באופן נרחב כפלטפורמות שבהן תאים סרטניים שומרים על שלמותם הביולוגית באמצעות אינטראקציות ביוכימיות, מורפולוגיה וארכיטקטורה. לצוות שלנו ניסיון רב בהתאגיד תאי PDX במבחנה באמצעות מטריצות תלת-מימד המורכבות מחומצה היאלורונית (HA). על מנת להפריד את תאי סטרומה פיברובלסט העכבר הקשורים PDXs, אנו משתמשים בתרבות סיבוב, שבו תאים סטרומה לדבוק על פני השטח של צלחות שטופלו בתרבות רקמות בעוד תאים סרטניים PDX נותק לצוף ולשייך עצמי לתוך אשכולות רב תאיים. גם צפים supernatant הם יחיד, לעתים קרובות תאים מתים, אשר מציגים אתגר באיסוף אשכולות PDX קיימא עבור אנקלוסציה במורד הזרם לתוך הידרוג'לים עבור תרבות תא 3D. על מנת להפריד תאים בודדים אלה מאשכולות תאים חיים, השתמשנו צנטריפוגציה הדרגתית צעד צפיפות. הפרוטוקול המתואר כאן מאפשר דלדול של תאים בודדים שאינם בר קיימא מהאוכלוסייה הבריאה של אשכולות תאים שישמשו לניסויים נוספים במבחנה. במחקרים שלנו, אנו משלבים את תרבויות 3D צלחות microfluidic המאפשרים עירוי מדיה במהלך התרבות. לאחר הערכת התרבויות הנובעות מכך באמצעות התבססות על הכדאיות המבוססת על תמונה פלורסנטית של תאים מטוהרים לעומת תאים לא מטוהרים, התוצאות שלנו מראות כי צעד הפרדה נוסף זה הפחית באופן משמעותי את מספר התאים שאינם מעשיים מהתרבויות שלנו.

נדנדת זלבנית ניתנת לתכנות הוכנה באינקובטור סטנדרטי של תרבות תא עם שתי נתיבים, וצלחות מיקרו-נוזליות דו-מסלוליות הוכנו בארונות אבטחה ביולוגית סטנדרטייםלהעמסה (איור 1). גידול PDX MDA-PCA-118b הורחב vivo, נקטף כאשר הגיע לגודל מרבי, נותקו כמתואר בפרוטוקול סעיף 2 כדי ליצור השעיה slurry של תאי...

Watch this Scientific Journal Video about Enhanced Viability for Ex vivo 3D Hydrogel Cultures of Patient-Derived Xenografts in a Perfused Microfluidic Platform at JoVE.com

Enhanced Viability for Ex vivo 3D Hydrogel Cultures of Patient-Derived Xenografts in a Perfused Microfluidic Platform

פרוטוקול זה מדגים שיטות המאפשרות הרחבה בתרבות המבחנה של xenografts נגזר המטופל (PDX). צעד אחד משפר את הכדאיות הכוללת של תרבויות אשכול רב-תאי בהידרוג'לים תלת-מימדיים, באמצעות הסרה פשוטה של תאים בודדים שאינם ברי קיימא. שלב משני מדגים שיטות עבודה מומלצות לתרבות PDX בפלטפורמה מיקרו-נוזלית מנווטה.

קיימות משופרת עבור תרבויות הידרוג'ל 3D Ex vivo של Xenografts נגזר המטופל בפלטפורמה מיקרופלויד perfused

Patient-derived xenografts (PDX), generated when resected patient tumor tissue is engrafted directly into immunocompromised mice, remain biologically ...

שיטות תרבות משופרות עבור דגימות גידול שמקורן בחולה חשובות ביותר כאשר השדה מתרחק מהשימוש בקווי תאים קונבנציונליים. פרוטוקול זה מאפשר את תרבות ההקדמה של תאים סרטניים שמקורם בחולה בפלטפורמה כי הוא נוח תפוקה גבוהה הקרנת תוכן גבוה, שלא כמו במודלים סרטן vivo. הפלטפורמה המשלבת PDXs מאפשרת לנו להעריך מערכות הטרוגניות יותר המשקפות גידולים מקומיים.זה עשוי להניב תובנה לתוך מנגנוני סמים ולאפשר הקרנת סמים מהירה יותר. ניתן להרחיב את השיטה באמצעות שילוב של סטרומה, אנדותל ותאי חיסון. תרבויות שיתוף אלה יכולות להיות אפילו יותר משקף את האוכלוסייה הגידול הילידי ואת הארכיטקטורה.תרגול טעינת הלוחות microfluidic עם קווי תאים מורחבים בקלות להיות מיומן מאוד לפני המעבר לתאים יקרים יותר כמו PDXs. יישור במהלך חלוקת צלחת משפיע מאוד על ההצלחה, והדגמה חזותית יכולה בקלות להעביר את המושג הזה. כדי להתחיל, להעביר רקמת הגידול לצינור חרוט סטרילי 50 מיליליטר שקל מראש.לשטוף שש פעמים עם 30 מיליליטר של PBS סטרילי כדי להסיר דם ומזהמים. הסר נוזל רב ככל האפשר, ולשקול את רקמת הגידול. מעבירים את רקמת הגידול לצלחת תרבות רקמה עגולה של 60 מ"מ, ולהשתמש בסכין גילוח סטרילי או באזמל כדי לטחון אותו לחתיכות של מילימטר אחד.הוסף חמישה מיליליטר של מדיום עיבוד PDX כדי לאסוף את תרחיף הגידול. הוסף חמישה מיליליטר של פתרון אנזים דיסוציאציה כדי לאסוף את תרחיף הגידול. שטפו את צלחת התרבות עם עוד חמישה מיליליטר של פתרון אנזים דיסוציאציה.לאחר מכן הוסיפו חמישה מיליליטר של מדיום עיבוד PDX. דגירה 20 דקות ב 37 מעלות צלזיוס עם רעידות עדינות. באמצע זמן הדגירה, מערבל את הצינור בעדינות.לאחר הדגירה, פיפטה למעלה ולמטה בעדינות עם פיפטה סרולוגית כדי לשבור גושים. מניחים מסננת תאים של 70 מיקרון מעל צינור סטרילי חדש של 50 מיליליטר, ומסננים את התאים. ואז צנטריפוגה ב 1, 200 סל"ד במשך שתי דקות כדי גלולה את התאים.הסר את העל-טבעי ולחץ מחדש בשניים עד שלושה מיליליטר של מדיום תרבות PDX. לספור את התאים באמצעות מד חמוציט או מונה תאים אוטומטי. השתמש בטבלה זו כדי להעריך את המספר הנדרש של התאים הנגזרים משויכים PDX הדרושים כדי להשיג את צפיפות התאים הרצויה לכל שבב.צלחת אחת עד פעמיים 10 לשישה תאים בחמישה מיליליטר של מדיום תרבות PDX לכל באר של צלחת תרבות רקמה שש בארות. דגירה במשך 48 שעות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% פחמן דו חמצני, ו 95% לחות עם רעידות עדינות ב 50 עד 55 סל"ד כדי לקדם היווצרות אשכול. לאחר שהאשכולות נוצרו, המשך לצנטריפוגה.ראשית להכין 20 מיליליטר של 100% צפיפות שיפוע פתרון על ידי ערבוב יסודי 18 מיליליטר של פתרון צנטריפוגה שיפוע צפיפות עם שני מיליליטר של HBSS סטרילי 10X בצינור חרוט סטרילי 50 מיליליטר. לדלל פתרון זה 100%עם HBSS סטרילי 1X כדי להפוך 10 מיליליטר כל אחד 20%30%40% ו 55% פתרונות הדרגתיים צפיפות. הוסף שלושה מיליליטר של 55% צפיפות שיפוע פתרון לתחתית צינור חרוט 15 מיליליטר.מחזיק את הצינור בזווית, לאט לוותר על שלושה מיליליטר של 40% צפיפות שיפוע פתרון על הצד הזוויתי של הצינור ועל גבי שכבת 55%. חזור על הפעולה עם פתרון מעבר הצבע של 30%density. לאחר מכן לאסוף את העל-טבעי של תרבות סיבוב PDX עם פיפטה סרולוגית חמישה מיליליטר לתוך צינור, לשטוף את פני הלוח בעדינות.צנטריפוגה ב 1, 200 סל"ד במשך שתי דקות לתאי גלולה. הסר את supernatant, ו resuspend גלולת התא בשלושה מיליליטר של 20%צפיפות שיפוע פתרון. בזהירות שכבת פתרון הדרגתי 20%density עם תאים על החלק העליון של המילוי ההדרגתי בצינור 15 מיליליטר.מכסים את הצינורות והצנטריפוגה בצנטריפוגה רוטור דלי נדנדה 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס, 2, 000 פעמים G, ואפס הפסקה. לאחר צנטריפוגה, שברים גלויים. תרבויות תא PDX קיימא נמצאות בדרך כלל בממשק פתרון הדרגתי של 40 עד 55%.density.לאסוף שניים עד שלושה מיליליטר של כל שבר לתוך צינורות טריים 15 מיליליטר. הוסף שלושה עד ארבעה כרכים של HBSS סטרילי 1X לכל שבר, והתהפך כדי לערבב ביסודיות. צנטריפוגה ב 1, 000 פעמים G במשך שלוש דקות כדי גלולה התאים.הסר את העל-טבעי. תן שימוש חוזר לכדור התא באחד עד שני מיליליטר של מדיום עיבוד PDX. מעבירים אליטוט קטן בין 50 ל-100 מיקרוליטרים לצינור, ומוסיפים נפח שווה של תמיסת אנזים דיסוציאציה להקצאה מחדש.הערך את מספר התא בהשעיית התא המקובצים באשכולות. לספור את התאים עם מד חמוציט או מונה תאים אוטומטי. יש לצרף מחדש את פתרונות ההידרוגל של החומצה היאלורונית בהתאם להוראות היצרן.באמצעות פיפטה רב ערוצית, להוסיף 50 microliters של HBSS לכל הבארים בעמודי חלון תצפית של צלחת microfluidic שני נתיבים כדי לשמור על לחות תרבותית ותנאי הדמיה אופטימליים. לחשב את נפח ההשעיה התא הדרוש עבור 50 microliters של הידרוג'ל בצפיפות התא הרצויה, למשל, 5, 000 תאים לכל microliter. עבור זריעת צלחת microfluidic אחת, aliquot את הנפח המחושב לתוך כל אחד מארבעה סטרילי 1.5 מיליליטר צינורות צנטריפוגה.להתאים את ה- pH של פתרון תיול HA לשמונה עם 1 הידרוקסיד נתרן נורמלי מיד לפני השימוש. בצע בדיקה gelation על ידי ערבוב 40 microliters של תיול HA עם 10 microliters של PEGdA וניטור gelation לאורך זמן. לאחר מכן, צנטריפוגה עליקוט ההשעיה התא במשך שתי דקות ב 200 פעמים G וטמפרטורת החדר כדי גלולה את התאים.בזהירות להסיר את supernatant, ו resuspend התאים ב 40 microliters של הא thiol עבור נפח סופי 50 מיקרוליטר. הוסף 10 מיקרוליטרים של PEGdA לאליקוט אחד של התאים של הא תיול. מערבבים היטב, ומחכים שעה עד שלוש דקות לפני הזריעה של הצלחת המיקרופלואידית.להדביק טיפ עבור חלוקת 1.5 microliters ל pipette חוזר ערוץ יחיד, ולטעון עם התאים בתמיסת הידרוג'ל HA. זכור לשמור על אליקוט המימן מעורבב היטב כדי להבטיח חלוקת תאים אחידה. כדי לזרוע את הצלחת microfluidic, ליישר את קצה פיפטה בניצב ללהב תוך הצבת בעדינות את הקצה במרכז אינץ 'ג'ל כדי להבטיח מגע אבל אין לחץ בעת חלוקת 1.5 microliters של פתרון הידרוג'ל.שים לב למצב המילוי של הערוצים המיקרופלואידיים על ידי צפייה מהחלק העליון של הצלחת, תחתית הצלחת או על ידי מיקרוסקופ. הערך את הטעינה באמצעות איור זה כמדריך. דקה לאחר ההעמסה, הפוך את הצלחת תוך כדי הכנה לאליקוט הבא.חזור על הזריעה של הלוח microfluidic עבור שלושת aliquots הנותרים של תאים בתתבת HA. לאחר מילוי כל השבבים, הדגירה את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס באינקובטור לח 45 דקות עד ג'לציה הושלמה. לאחר מכן, באמצעות המדריך שסופק, להבטיח את נדנדת חליטה מותקן באינקובטור תרבות התא עם הגדרת שפע הנכון בזווית של 14 מעלות ומרווחים של ארבע דקות.הוסף 50 מיקרוליטרים של תא PDX בינוני לכל ההפניות הבינוניות. הקישו בעדינות על הצלחת על משטח כדי לעודד את הנוזל למלא את הערוצים המיקרופלואידיים. לאחר מכן הפוך את הצלחת כדי לבדוק אם הערוצים מלאים כראוי.הוסף 50 מיקרוליטרים של DMEM/F-12 עבור כל אמצעי התקשורת. אם כל בועות אוויר לכודים בערוץ חליטה, להסיר על ידי הקשה עדינה של הצלחת על פני השטח. באמצעות טופס פריסת מיקרוסקופ וצלחת, הקלט הצלחת מילוי שבבים.אל תכלול שבבים שלא מולאו כראוי בשימוש ניסיוני נוסף. מניחים את הצלחת על נדנדה מוטה להגדיר להטיה של 14 מעלות ומחזור של ארבע דקות כדי להתחיל חליטה. כל יומיים, להחליף את מדיום תרבות PDX, הראשון 50 microliters ב inlets, אז 50 microliters בשקעים.במחקר זה, נדנדת זלול ניתנת לתיכנות הותקנה באינקובטור סטנדרטי לתרבות תאים עם מעיל מים, ולהבים מיקרופלואידיים דו-נתיביים הוכנו בארונות בטיחות ביולוגית סטנדרטיים לטעינה. יכולת הקיום והמורפולוגיה של תרבות PDX מיקרופלואידית תלת-מימדית הוערכו הן בתנאים מופרדים מצנטריפוגה בלתי נפרדים והן בתנאים מופרדים בין צנטריפוגות שיפוע צפיפות. ביום הראשון, אותן תרבויות שעברו את שיטת ההפרדה הציגו פי עשרה פחות תאים מתים בודדים בהשוואה לתרבויות לא נפרדות.חשוב לציין שהאשכולות המופרדים כללו בעיקר תאים חיים. לא זוהה הבדל מובהק סטטיסטית עבור התפלגות גודל האשכול. תרבויות נשמרו עוד יותר בצלחת המיקרופלואידית במשך שבעה ימים.המספר הכולל של תאים חיים נותר עקבי, ואשכולות שמרו על כ-80% כדאיות לאורך חיי התרבות. זכור כי כל קו PDX הוא ייחודי, ולכן הקלות של עיכול הגידול, גודל פנוטיפי ומורפולוגיה של אשכולות, ואת המיקום של האשכול בתוך טיהור הדרגתי ישתנו. ניתן לסמן תרבויות PDX שהוקמו בשיטה זו באמצעות בדיקות כדאיות מבוססות-תמונה או לוח-קורא, תוויות קבועות ואימונופלואורסצנטיות, או ניתוק כדי לאסוף lysates תאים עבור פרוטוקולים אחרים.השיטה תאפשר לחוקרים לכבוש מחדש את המיקרו-וירוס הגידולי על מנת לחקור ביולוגיה או תגובה תרופתית של תאים סרטניים. משתמשים צריכים להשלים אימון נושאים אנושיים סטנדרטיים ואימון פתוגנים המועברים בדם לפני העבודה עם רקמות שמקורן בבני אדם. ציוד מגן אישי מתאים צריך להיות משוחק.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Labeling of Breast Cancer Patient-derived Xenografts with Traceable Reporters for Tumor Growth and Metastasis Studies

תיוג של xenografts הנגזר חולה סרטן השד עם כתבים לעקיבים עבור צמיחת גידולים וגרורים מחקרים

The use of preclinical models to study tumor biology and response to treatment is central to cancer research. Long-established human cell lines, and many ...

Isolation and Characterization of Tumor-initiating Cells from Sarcoma Patient-derived Xenografts

בידוד ואפיון של הגידול-ליזום תאים מחולה סרקומה-Xenografts נגזרים

The existence and importance of tumor-initiating cells (TICs) have been supported by increasing evidence during the past decade. These TICs have been ...

Fluorescence Molecular Tomography for In Vivo Imaging of Glioblastoma Xenografts

Fluorescence Molecular Tomography for In Vivo Imaging of Glioblastoma Xenografts

קרינה פלואורסצנטית טומוגרפיה מולקולרית עבור הדמיה In Vivo של גליובלסטומה Xenografts

Tumorigenicity is the capability of cancer cells to form a tumor mass. A widely used approach to determine if the cells are tumorigenic is by injecting ...

Patient-derived Heterogeneous Xenograft Model of Pancreatic Cancer Using Zebrafish Larvae as Hosts for Comparative Drug Assessment

מטופל-נגזר הטרוגנית מודל Xenograft של סרטן הלבלב באמצעות הזחלים Zebrafish כפונדקאים עבור הערכת סמים השוואתי

Patient-derived tumor xenograft (PDX) and cell-derived tumor xenograft (CDX) are important techniques for preclinical assessment, medication guidance and ...

Physiologic Patient Derived 3D Spheroids for Anti-neoplastic Drug Screening to Target Cancer Stem Cells

החולה הפיזיולוגי הנגזרות 3D Spheroids עבור הקרנת תרופות אנטי-נאופלסטית כדי למקד את תאי גזע הסרטן

In this protocol, we outline the procedure for generation of tumor spheroids within 384-well hanging droplets to allow for high-throughput screening of ...

Assessing Cell Viability and Death in 3D Spheroid Cultures of Cancer Cells

הערכת הכדאיות תא ומוות ב 3D בתרבויות ספרואיד של תאים סרטניים

Three-dimensional spheroids of cancer cells are important tools for both cancer drug screens and for gaining mechanistic insight into cancer cell biology. ...

Establishment of Gastric Cancer Patient-derived Xenograft Models and Primary Cell Lines

הקמת החולה סרטן קיבה-מודלים נגזרים הנגזרות וקווי התא הראשי

The use of preclinical models to advance our understanding of tumor biology and investigate the efficacy of therapeutic agents is key to cancer research. ...

Testing Targeted Therapies in Cancer using Structural DNA Alteration Analysis and Patient-Derived Xenografts

בדיקת טיפולים ייעודיים בסרטן באמצעות ניתוח שינוי DNA מבנית והמטופל נגזר Xenografts

We present here an integrative approach for testing efficacy of targeted therapies that combines the next generation sequencing technolo-gies, therapeutic ...

Drug Screening of Primary Patient Derived Tumor Xenografts in Zebrafish

הקרנת התרופה של החולה העיקרי הנגזר גידול Xenografts ב Zebrafish

Patient derived xenograft models are critical in defining how different cancers respond to drug treatment in an in vivo system. Mouse models are the ...

Patient-Derived Tumor Explants As a "Live" Preclinical Platform for Predicting Drug Resistance in Patients

גידול שמקורו במטופל explants כפלטפורמה פרה-אקלינית "חיה" לחיזוי עמידות לתרופות בחולים

An understanding of drug resistance and the development of novel strategies to sensitize highly resistant cancers rely on the availability of suitable ...