Name: enhanced viability for ex vivo 3d hydrogel cultures of patient-derived xenografts in a perfused microfluidic platform
Uploaded: 2020-12-05T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Enhanced Viability for Ex vivo 3D Hydrogel Cultures of Patient-Derived Xenografts in a Perfused Microfluidic Platform at JoVE.com

Questo lavoro è stato supportato dal National Institutes of Health National Cancer Institute SBIR Phase I (HHSN26120700015C) e P01CA098912.

Il tessuto tumorale è stato ottenuto con il consenso del paziente e secondo un protocollo approvato dell'Institutional Review Board (IRB). Gli xenografti sono stati impiantati, coltivati e raccolti secondo un protocollo accettato institutional animal care and use committee (IACUC).
NOTA: Tutto il lavoro deve essere eseguito in un armadio di sicurezza biologico sterile per mantenere la sterilità. Tutti i passaggi devono essere condotti a temperatura ambiente, salvo diversa indicazione.
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	<li>Jung, J., Seol, H. S., Chang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Generation+and+Application+of+Patient-Derived+Xenograft+Model+for+Cancer+Research.">The Generation and Application of Patient-Derived Xenograft Model for Cancer Research.</a> Cancer Research and Treatment: Official Journal of Korean Cancer Association. 50 (1), 1-10 (2018).</li><li>Malaney, P., Nicosia, S. V., Dave, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One+mouse,+one+patient+paradigm:+New+avatars+of+personalized+cancer+therapy.">One mouse, one patient paradigm: New avatars of personalized cancer therapy.</a> Cancer Letters. 344 (1), 1-12 (2014).</li><li>Meehan, T. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PDX-MI:+Minimal+Information+for+Patient-Derived+Tumor+Xenograft+Models.">PDX-MI: Minimal Information for Patient-Derived Tumor Xenograft Models.</a> Cancer Research. 77 (21), 62-66 (2017).</li><li>Fong, E. L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogel-Based+3D+Model+of+Patient-Derived+Prostate+Xenograft+Tumors+Suitable+for+Drug+Screening.">Hydrogel-Based 3D Model of Patient-Derived Prostate Xenograft Tumors Suitable for Drug Screening.</a> Molecular Pharmaceutics. 11 (7), 2040-2050 (2014).</li><li>Fong, E. L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+3D+in+vitro+model+of+patient-derived+prostate+cancer+xenograft+for+controlled+interrogation+of+in+vivo+tumor-stromal+interactions.">A 3D in vitro model of patient-derived prostate cancer xenograft for controlled interrogation of in vivo tumor-stromal interactions.</a> Biomaterials. 77, 164-172 (2016).</li><li>Engel, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyaluronic+Acid-Based+Hydrogel+Formulations+Suitable+for+Automated+3D+High+Throughput+Drug+Screening+of+Cancer-Stromal+Cell+Cocultures.">Hyaluronic Acid-Based Hydrogel Formulations Suitable for Automated 3D High Throughput Drug Screening of Cancer-Stromal Cell Cocultures.</a> Advanced Healthcare Materials. 4 (11), 1664-1674 (2015).</li><li>Lanz, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapy+response+testing+of+breast+cancer+in+a+3D+high-throughput+perfused+microfluidic+platform.">Therapy response testing of breast cancer in a 3D high-throughput perfused microfluidic platform.</a> BMC Cancer. 17 (1), 709 (2017).</li><li>Wevers, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+compound+evaluation+on+3D+networks+of+neurons+and+glia+in+a+microfluidic+platform.">High-throughput compound evaluation on 3D networks of neurons and glia in a microfluidic platform.</a> Scientific Reports. 6, 38856 (2016).</li><li>Vulto, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phaseguides:+a+paradigm+shift+in+microfluidic+priming+and+emptying.">Phaseguides: a paradigm shift in microfluidic priming and emptying.</a> Lab on a Chip. 11 (9), 1596-1602 (2011).</li><li>Patru, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD133,+CD15/SSEA-1,+CD34+or+side+populations+do+not+resume+tumor-initiating+properties+of+long-term+cultured+cancer+stem+cells+from+human+malignant+glio-neuronal+tumors.">CD133, CD15/SSEA-1, CD34 or side populations do not resume tumor-initiating properties of long-term cultured cancer stem cells from human malignant glio-neuronal tumors.</a> BMC Cancer. 10, 66 (2010).</li><li>Harma, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+panel+of+three-dimensional+models+for+studies+of+prostate+cancer+growth,+invasion+and+drug+responses.">A comprehensive panel of three-dimensional models for studies of prostate cancer growth, invasion and drug responses.</a> PLoS One. 5 (5), 10431 (2010).</li></ol>

Qui descriviamo un metodo per elaborare e coltivare cellule tumorali vitali derivate da PDX in un sistema di coltura 3D ad alta produttività e perfuso. Mentre questo protocollo utilizza tessuto PCa PDX, è ugualmente efficace per altri tumori derivati epiteliali. Le caratteristiche tumorali variano tra le singole linee PDX anche all'interno dello stesso tessuto di origine (prostata, seno, ecc.). Alcune linee PCa PDX sono più fibrotiche e difficili da isolare le cellule vitali mentre altre sono più cellulari. La dimens...

Nell'ultimo decennio, il campo della ricerca sul cancro ha dimostrato un rinnovato entusiasmo per gli xenoinnesti derivati dal paziente (PDX) come strumento per valutare la dipendenza dal percorso delle cellule tumorali e la suscettibilità ai farmaci1. I modelli PDX più comuni sono stabiliti dall'impianto sottocutaneo o ortotopico delle cellule tumorali umane - un frammento tumorale, un ammasso di cellule dissociate derivate dal tumore o un campione di cellule tumorali circolanti isolate (CTC) - in un ospite di roditori. Se il tumore "take" ha successo, le cellule xenograft proliferano, vascolarizzano e altrimenti interagiscono con il tessuto ospite per creare un tumore, che può essere raccolto a una dimensione ottimale, suddiviso e reimpiantato in altri ospiti. Tra i loro numerosi vantaggi come sistema modello, i PDX in genere mantengono una parte sostanziale dell'eterogeneità della popolazione di cellule tumorali native e consentono la valutazione delle vie specifiche dell'uomo e delle rispostecellulari 2,,3. Il contesto in vivo consente l'interazione tumorale con la vascuola e altri stroma adiacenti e ricapitola caratteristiche tissutali come la dinamica di diffusione del farmaco, la tensione dell'ossigeno e l'influenza della matrice extracellulare che influenzano biologicamente e meccanicamente la progressione tumorale. Un aspetto negativo dei PDX è la loro dipendenza da un ospite di roditori, sia per l'espansione del tumore che, in ultima analisi, per il test delle ipotesi. Poiché molti PDX non possono adattarsi alla tradizionale coltura bidimensionale (2D) sul polistirolo di coltura tissutale senza perdere molte delle loro caratteristiche desiderabili, c'è stata una minima via di mezzo per i ricercatori tra questo metodo in vitro relativamente controllato e il significativo aumento delle spese, delle strutture e dei requisiti di tempo per l'uso in vivo di PDX.
Abbiamo descritto più modelli in vitro che implementano la coltura cellulare 3D all'interno di una matrice di supporto, e recentemente ampliato quel lavoro per dimostrare la coltura ex vivo di PDX derivati dal cancro alla prostata multipla (PCa), sia da soli che in co-coltura con fibroblasti derivati dal midolloosseo 4,,5. Le matrici idrogel a base di acido ialuronico (HA) forniscono un supporto personalizzabile e biologicamente rilevante per entrambi i tipi di cellule, con facile controllo sulle caratteristiche dell'idrogel e chiarezza ottica per l'imaging attraverso la profondità dell'idrogel6.
I tessuti tumorali PDX maturi comprendono una miscela variabile di cellule tumorali umane eterogenee e stroma del topo (fibroblasti, cellule endoteliali, ecc.). Per studiare i contributi specifici di tipo cellulare alla progressione tumorale in vitro, può essere vantaggioso dissociare i tumori, separare le popolazioni cellulari e incorporarle sperimentalmente in modo organizzato per sezionare percorsi di comunicazione intercellulare. Le popolazioni di cellule miste all'interno dei digestati tissutali hanno compatibilità differenziale con specifiche condizioni di coltura. Ad esempio, la vitalità dei fibroblasti associati al tumore richiede aderenza alla superficie o matrici 3D funzionalizzate con ligandi integrini, mentre le cellule PDX derivate dall'epiteliale in genere non hanno questi requisiti, favorendo invece le interazioni cellula-cellula. Queste differenze possono essere sfruttate per ottenere un'efficace separazione delle cellule PDX dalla contaminazione delle cellule stromali del topo. La coltura di rotazione dei digestati tissutali consente l'aderenza delle cellule stromali alla superficie di coltura tissutale mentre le aderenze cellulare-cellulari guidano le cellule PDX che galleggiano sopra la superficie di coltura rotante per formare ammassi multicellulari nel supernatante in 24−48 h. Le caratteristiche specifiche di questi ammassi variano con il PDX (ad esempio, ammassi grandi, stretti, altamente sferici o aggregati più piccoli e più sciolti simili a grappoli d'uva), ma sono tipicamente di dimensioni biologicamente rilevanti (50−250 μm di diametro), sufficienti per valutare le interazioni cellulari che si basano su contatti intercellulari.
Il recupero e l'elaborazione del tumore si trae inevitabilmente da un certo grado di morte cellulare collaterale, a causa di danni a breve termine dovuti a interruzioni meccaniche / enzimatiche o incompatibilità a lungo termine delle sottopopolazioni con le condizioni di coltura scelte. Nonostante l'utilità della coltura di rotazione come separazione iniziale di massa, le cellule morte o morenti vengono inevitabilmente trasferite con i cluster PDX e possono influenzare la coltura risultante. Queste cellule morte sono spesso singole cellule PDX che non sono state integrate in un ammasso, fibroblasti stromali del topo che non possono sopravvivere in condizioni di coltura selezionate, o cellule endoteliali particolarmente fragili. Tali cellule morenti possono influenzare i risultati sperimentali dei "sopravvissuti" e possono avere un impatto sostanziale sulla quantificazione, ad esempio attraverso test di screening di fattibilità fluorescenti basati su immagini. Per migliorare la selezione di cellule PDX vive da questo metodo, abbiamo adattato i metodi di centrifugazione con passaggi di densità per rimuovere facilmente singole cellule morte / morenti dalle miscele PDX e trattenere prevalentemente cluster multicellulari vivi.
Per migliorare lo studio dei cluster derivati da PDX risultanti in coltura 3D, abbiamo utilizzato una piattaforma di coltura perfusione basata sulla microfluidica, organoplate (Figura 1), che è una piattaforma organ-on-a-chip ad alta produttività che consente una coltura simultanea fino a 96 singole colture 3D perfuse su una base di piastre a microtitro a 384 pozzi(Figura 1A)7,8. Nella piastra microfluidica a 2 corsie, un singolo chip tissutale è collegato da due canali microfluidici(Figura 1B,canale gel: rosso, canale di perfusione: blu) che si estendono su quattro pozzi di fila. I due canali microfluidici sono separati da una breve cresta di plastica chiamata Phaseguide che impedisce l'overflow di un canale nel suo canale adiacente vicino, e allo stesso tempo consente un'interfaccia priva di membrana tra il contenuto del gel e il canale di perfusione9. Poiché il fondo della piastra microfluidico è composto da vetro di grado microscopio, le colture possono essere visualizzate nella finestra di osservazione attraverso il fondo della piastra con un microscopio standard o automatizzato. La perfusione è stabilita nella piastra microfluidica con un rocker programmabile, utilizzando la gravità per guidare i mezzi attraverso i canali microfluidici, tra i pozzi del serbatoio (Figura 1C). Il flusso di perfusione imita più da vicino il microambiente tumorale rispetto alla coltura statica, consentendo l'incorporazione dello stress da taglio e una maggiore distribuzione di gas e sostanze nutritive. I benefici del mantenimento di una coltura cellulare tumorale perfusa nella piastra microfluidica sono stati precedentemente descritti come colture perfuse di cancro al seno che mostravano una vitalità ottimale rispetto a una coltura 3D statica delle stessecellule 7.
Il presente rapporto descrive un metodo di centrifugazione del gradiente di densità adattato per isolare i cluster PDX multicellulari vivi e dimostra la sua utilità nella creazione di colture PDX 3D all'interno di piastre microfluidiche perfusabili. Poiché un numero crescente di laboratori di ricerca sta cercando metodi per facilitare l'uso del PDX, prevediamo che i protocolli qui presentati saranno di utilità immediata.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:812px;" width="812">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">1N NaOH</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td style="width:224px;">any suitable tissue culture grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">60 mm round tissue culture dishes</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td>any suitable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">6-well tissue culture plates</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td>any suitable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">70 &#181;m cell strainers</td>
			<td style="width:148px;">Corning</td>
			<td style="width:189px;">431751</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:251px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:148px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:189px;">5810R with suitable rotor and buckets for 15/50 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Density gradient centrifugation solution</td>
			<td style="width:148px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:189px;">P1644</td>
			<td>Percoll</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Dimethylsulfoxide</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td>any suitable tissue culture grade</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Dissociation enzyme solution</td>
			<td style="width:148px;">StemCell Technologies</td>
			<td style="width:189px;">07921</td>
			<td style="width:224px;">ACCUMAX</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">DMEM-F12</td>
			<td style="width:148px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:189px;">11039021</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Forceps</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td>any suitable</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">HA hydrogel kit</td>
			<td style="width:148px;">ESI BIO</td>
			<td style="width:189px;">GS311</td>
			<td style="width:224px;">HyStem (Hyaluronic acid-SH and PEGDA)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Hanks Balanced Salt Solution</td>
			<td style="width:148px;">Lonza</td>
			<td style="width:189px;">10-527F</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Heat-inactivated fetal bovine serum</td>
			<td style="width:148px;">Atlanta Biologicals</td>
			<td style="width:189px;">S11150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Hemocytometer</td>
			<td style="width:148px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:189px;">02-671-51B Hausser BrightLine</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Hoechst 33342</td>
			<td style="width:148px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:189px;">H1398</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Image processing software</td>
			<td style="width:148px;">Oxford Instruments</td>
			<td style="width:189px;">Imaris 9.3</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:251px;">LIVE/DEAD Cell Viability/Cytotoxicity Kit (Calcein-AM/Ethidium Homodimer-1)</td>
			<td style="width:148px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:189px;">L3224</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Microfluidic culture plate</td>
			<td style="width:148px;">Mimetas</td>
			<td style="width:189px;">9603-400-B</td>
			<td>2-lane OrganoPlate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Microscope</td>
			<td style="width:148px;">Nikon</td>
			<td style="width:189px;">A1R</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="68">
			<td height="68" style="height:68px;width:251px;">Multichannel pipette</td>
			<td style="width:148px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:189px;">3125000036</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:251px;">PDX-derived tumor tissue</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td style="width:224px;">obtained under IRB approval for human tissue and IACUC approval for animal host</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Penicillin-streptomycin</td>
			<td style="width:148px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:189px;">15140-122</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Perfusion rocker</td>
			<td style="width:148px;">Mimetas</td>
			<td style="width:189px;">OrganoPlate Perfusion Rocker Mini</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">pH strips (pH 5-9)</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td>any suitable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Phosphate-buffered saline solution</td>
			<td style="width:148px;">Lonza</td>
			<td style="width:189px;">17-516F</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Razor blades</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td>any suitable</td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;width:251px;">Rotating xy-shaker</td>
			<td style="width:148px;">VWR</td>
			<td style="width:189px;">Advanced 3500 Orbital Shaker</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Scalpel handle</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td>any suitable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Single channel repeating pipette</td>
			<td style="width:148px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:189px;">22260201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Sterile, 15mL conical centrifuge tubes</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td>any suitable</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Sterile, 50mL conical centrifuge tubes</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td>any suitable</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

enhanced viability for ex vivo 3d hydrogel cultures of patient-derived xenografts in a perfused microfluidic platform

Gli xenoinnesti derivati dal paziente (PDX), generati quando il tessuto tumorale del paziente reinsediato viene innestato direttamente in topi immunocompromessi, rimangono biologicamente stabili, preservando così le caratteristiche molecolari, genetiche e istologiche, nonché l'eterogeneità del tumore originale. Tuttavia, l'uso di questi modelli per eseguire una moltitudine di esperimenti, incluso lo screening farmacologico, è proibitivo sia in termini di costi che di tempo. I sistemi di coltura tridimensionali (3D) sono ampiamente visti come piattaforme in cui le cellule tumorali mantengono la loro integrità biologica attraverso interazioni biochimiche, morfologia e architettura. Il nostro team ha una vasta esperienza nella coltivazione di cellule PDX in vitro utilizzando matrici 3D composte da acido ialuronico (HA). Al fine di separare le cellule stromali dei fibroblasti di topo associate ai PDX, usiamo la coltura di rotazione, dove le cellule stromali aderiscono alla superficie delle placche trattate con coltura tissutale mentre le cellule tumorali PDX dissociate galleggiano e si associano in ammassi multicellulari. Fluttuanti anche nel supernatante sono singole, spesso cellule morte, che presentano una sfida nella raccolta di cluster PDX vitali per l'incapsulamento a valle in idrogel per la coltura cellulare 3D. Per separare queste singole cellule dagli ammassi di cellule vive, abbiamo impiegato la centrifugazione gradiente del passo di densità. Il protocollo qui descritto consente l'esaurimento di singole cellule non vitali dalla popolazione sana di cluster cellulari che saranno utilizzati per ulteriori sperimentazioni in vitro. Nei nostri studi, incorporiamo le colture 3D in piastre microfluidiche che consentono la perfusione dei supporti durante la coltura. Dopo aver valutato le colture risultanti utilizzando un saggio di vitalità fluorescente basato su immagini di cellule purificate rispetto a quelle non purificate, i nostri risultati mostrano che questo ulteriore passaggio di separazione ha ridotto sostanzialmente il numero di cellule non vitali dalle nostre colture.

Un rocker perfusione programmabile è stato preparato in un incubatore standard di coltura cellulare jackato ad acqua e piastre microfluidiche a due corsie sono state preparate in un armadio standard di biosicurezza per il carico(figura 1). Un tumore PDX MDA-PCA-118b è stato espanso in vivo, raccolto quando aveva raggiunto una dimensione massima e dissociato come descritto nella sezione 2 del protocollo per creare una sospensione liquama delle cellule, a circa uno stato a singola cellula (<...

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Enhanced Viability for Ex vivo 3D Hydrogel Cultures of Patient-Derived Xenografts in a Perfused Microfluidic Platform

Questo protocollo illustra i metodi per consentire una coltura estesa in vitro di xenoinnesti derivati dal paziente (PDX). Un passo migliora la vitalità complessiva delle colture di cluster multicellulari negli idrogel 3D, attraverso la semplice rimozione di singole cellule non vitali. Un passaggio secondario illustra le procedure consigliate per le impostazioni cultura PDX in una piattaforma microfluidica perfusa.

Maggiore vitalità per le colture di idrogel 3D ex vivo di xenoinnesti derivati dal paziente in una piattaforma microfluidica perfusa

Patient-derived xenografts (PDX), generated when resected patient tumor tissue is engrafted directly into immunocompromised mice, remain biologically ...

I metodi di coltura migliorati per i campioni di tumore derivati dal paziente sono di fondamentale importanza man mano che il campo si allontana dall'uso di linee cellulari convenzionali. Questo protocollo consente la coltura in vitro di cellule tumorali derivate dal paziente in una piattaforma suscettibile di elevata produttività e screening ad alto contenuto, a differenza dei modelli di cancro in vivo. La piattaforma che incorpora PDX ci consente di valutare sistemi più eterogenei che riflettono i tumori nativi.Ciò può fornire informazioni sui meccanismi del farmaco e consentire uno screening più rapido dei farmaci. Il metodo potrebbe essere espanso attraverso l'incorporazione di stroma, endotelio e cellule immunitarie. Queste co-culture potrebbero essere ancora più riflettenti della popolazione tumorale nativa e dell'architettura.Esercitati a caricare le piastre microfluidiche con linee cellulari facilmente espanse per diventare altamente abili prima di passare a celle più preziose come i PDX. L'allineamento durante l'erogazione delle lastre influisce notevolmente sul successo e una dimostrazione visiva può facilmente trasmettere questo concetto. Per iniziare, trasferire il tessuto tumorale in un tubo conico sterile pre-pesato da 50 millilitri.Risciacquare sei volte con 30 millilitri di PBS sterile per rimuovere sangue e contaminanti. Rimuovere il più liquido possibile e pesare il tessuto tumorale. Trasferire il tessuto tumorale in un piatto rotondo di coltura tissutale di 60 millimetri e utilizzare una lama di rasoio sterile o un bisturi per tritarlo in pezzi di un millimetro.Aggiungere cinque millilitri di mezzo di elaborazione PDX per raccogliere i liquami tumorali. Aggiungere cinque millilitri di soluzione enzimatica di dissociazione per raccogliere i liquami tumorali. Risciacquare il piatto di coltura con altri cinque millilitri di soluzione enzimatica di dissociazione.Quindi aggiungere cinque millilitri di mezzo di elaborazione PDX. Incubare 20 minuti a 37 gradi Celsius con tremori delicati. A metà del tempo di incubazione, ruotare delicatamente il tubo.Dopo l'incubazione, pipettare su e giù delicatamente con una pipetta sierologica per rompere i grumi. Posizionare un filtro cellulare da 70 micron su un nuovo tubo sterile da 50 millilitri e filtrare le cellule. Quindi centrifugare a 1.200 giri/min per due minuti per pellettare le cellule.Rimuovere il supernatante e resuspend in due o tre millilitri di mezzo di coltura PDX. Contare le cellule utilizzando un emocitometro o un contatore di celle automatizzato. Utilizzare questa tabella per stimare il numero richiesto di celle derivate PDX associate necessarie per ottenere la densità di cella desiderata per chip.Placcare da una a due volte 10 alle sei cellule in cinque millilitri di mezzo di coltura PDX per pozzo di una piastra di coltura tissutale a sei pozzi. Incubare per 48 ore a 37 gradi Celsius, 5% di anidride carbonica e umidità del 95% con scuotimenti delicati a 50-55 giri/min per promuovere la formazione di cluster. Dopo che gli ammassi si sono formati, procedere alla centrifugazione.Preparare innanzitutto 20 millilitri di soluzione gradiente di densità al 100% mescolando accuratamente 18 millilitri di soluzione di centrifugazione gradiente di densità con due millilitri di HBSS sterile 10X in un tubo conico sterile da 50 millilitri. Diluire questa soluzione al 100% con HBSS sterile 1X per realizzare 10 millilitri ciascuno di soluzioni gradienti a densità 20%30%40% e 55%.. Aggiungere tre millilitri di soluzione gradiente di densità del 55% sul fondo di un tubo conico da 15 millilitri.Tenendo il tubo ad angolo, erogare lentamente tre millilitri di soluzione gradiente di densità del 40% sul lato angolato del tubo e sopra lo strato del 55%. Ripetere con la soluzione gradiente di densità del 30%. Quindi raccogliere il supernatante delle colture di rotazione PDX con una pipetta sierologica da cinque millilitri in un tubo, risciacquando delicatamente la superficie della piastra.Centrifuga a 1.200 giri/min per due minuti alle celle a pellet. Rimuovere il supernatante e rimescolare il pellet di cella in tre millilitri di soluzione gradiente di densità del 20%. Sovrapporre con cura la soluzione gradiente di densità del 20% con le celle sulla parte superiore del gradiente nel tubo da 15 millilitri.Corona i tubi e la centrifuga in una centrifuga del rotore a benna oscillante 30 minuti a quattro gradi Celsius, 2.000 volte G e zero break. Dopo la centrifugazione, le frazioni sono visibili. Le colture cellulari PDX vitali si trovano in genere nell'interfaccia della soluzione gradiente dal 40 al 55%.Raccogliere da due a tre millilitri di ogni frazione in tubi freschi da 15 millilitri. Aggiungere da tre a quattro volumi di HBSS sterile 1X ad ogni frazione e invertire la miscela accuratamente. Centrifuga a 1.000 volte G per tre minuti per pellettare le cellule.Rimuovere il supernatante. Rimossare il pellet cellulare in uno o due millilitri di mezzo di lavorazione PDX. Trasferire una piccola aliquota tra 50 e 100 microlitri in un tubo e aggiungere un volume uguale di soluzione enzimatica di dissociazione per la riassociazione.Valutare il numero di cella nella sospensione della cella cluster. Contare le cellule con un emocitometro o un contatore di celle automatizzato. Ricostituire soluzioni idrogel di acido ialuronico secondo le istruzioni del produttore.Utilizzando una pipetta multicanale, aggiungere 50 microlitri di HBSS a tutti i pozzi nelle colonne della finestra di osservazione di una piastra microfluidale a due corsie per mantenere l'umidità della coltura e le condizioni di imaging ottimali. Calcolare il volume di sospensione cellulare necessario per 50 microlitri di idrogel alla densità cellulare desiderata, ad esempio 5.000 celle per microlitro. Per la semina di una piastra microfluidale, aliquotare il volume calcolato in ciascuno dei quattro tubi sterili di centrifuga da 1,5 millilitri.Regolare il pH della soluzione di tiolo HA a otto con 1 idrossido di sodio normale immediatamente prima dell'uso. Eseguire una gelazione di prova mescolando 40 microlitri di TIOLO HA con 10 microlitri di PEGdA e monitorando la gelazione nel tempo. Quindi, centrifugare le aliquote delle sospensioni cellulari per due minuti a 200 volte G e temperatura ambiente per pellettare le cellule.Rimuovere con cura il supernatante e rimescolare le cellule in 40 microlitri di tiolo HA per un volume finale di 50 microlitri. Aggiungere 10 microlitri di PEGdA a un'aliquota delle cellule di TIOLO. Mescolare bene e attendere da uno a tre minuti prima di seminare il piatto microfluidico.Apporre una punta per l'erogazione di 1,5 microlitri a una pipetta ripetuta a canale singolo e caricare con le celle in soluzione di idrogel HA. Ricordarsi di mantenere l'aliquota dell'idrogeno ben miscelata per garantire una distribuzione uniforme delle cellule. Per seminare la piastra microfluidica, allineare la punta della pipetta perpendicolarmente alla lama posizionando delicatamente la punta al centro dell'ingresso del gel per garantire il contatto ma nessuna pressione quando si erogano 1,5 microlitri di soluzione di idrogel.Osservare lo stato di riempimento dei canali microfluidici visualizzando dalla parte superiore della piastra, dal fondo della piastra o al microscopio. Valutare il caricamento utilizzando questa figura come guida. Un minuto dopo il caricamento, invertire la piastra mentre si prepara per l'aliquota successiva.Ripetere la semina della piastra microfluidico per le restanti tre aliquote di cellule in soluzione DI. Dopo aver riempito tutti i trucioli, incubare la piastra a 37 gradi Celsius in un incubatore umidificato 45 minuti fino al completamento della gelata. Successivamente, utilizzando il manuale fornito, assicurarsi che il rocker perfusione sia installato nell'incubatore di coltura cellulare con la corretta impostazione di profusione ad angolo di 14 gradi e intervalli di quattro minuti.Aggiungere 50 microlitri di mezzo di coltura cellulare PDX a tutte le entrate medie. Toccare delicatamente la piastra contro una superficie per incoraggiare il liquido a riempire i canali microfluidici. Quindi capovolgere la piastra per verificare se i canali sono riempiti correttamente.Aggiungere 50 microlitri di DMEM/F-12 per tutti i supporti. Se nel canale di perfusione sono intrappolate bolle d'aria, rimuovere toccando delicatamente la piastra contro una superficie. Utilizzando un modulo di layout del microscopio e della piastra, registra il successo del riempimento dei chip.Escludere i trucioli riempiti in modo improprio da ulteriori usi sperimentali. Posizionare la piastra su un rocker basculante impostato su un'inclinazione di 14 gradi e un ciclo di quattro minuti per iniziare la perfusione. Ogni due giorni, sostituire il mezzo di coltura PDX, prima 50 microlitri nelle entrate, poi 50 microlitri nelle uscite.In questo studio, un rocker perfusione programmabile è stato installato in un incubatore standard di coltura cellulare con giacca d'acqua e lame microfluidiche a due corsie sono state preparate in un armadio standard di biosicurezza per il carico. La vitalità e la morfologia della coltura PDX microfluidica 3D sono state valutate sia in condizioni non separate che in condizioni separate da centrifugazione gradiente di densità. Il primo giorno, quelle culture che hanno subito il metodo di separazione mostravano dieci volte meno singole cellule morte rispetto alle colture non separate.È importante sottolineare che gli ammassi separati consistevano principalmente in cellule vive. Non è stata individuata alcuna differenza statisticamente significativa per la distribuzione delle dimensioni del cluster. Le colture sono state ulteriormente mantenute nella piastra microfluidico per sette giorni.Il numero totale di cellule vive rimase costante e i cluster mantennero circa l'80% di vitalità per tutta la vita della cultura. Ricorda che ogni linea PDX è unica, quindi la facilità di digestione del tumore, le dimensioni fenotipiche e la morfologia degli ammassi e la posizione dell'ammasso all'interno della purificazione del gradiente varieranno. Le colture PDX stabilite con questo metodo possono essere testate con saggi di vitalità basati su immagini o lettori di lastre, fisse e immunofluorescenti o dissociate per raccogliere lisati cellulari per altri protocolli.Il metodo consentirà ai ricercatori di ricapitolare il microambiente tumorale al fine di esplorare la biologia o la risposta farmacologica delle cellule tumorali. Gli utenti devono completare l'allenamento standard dei soggetti umani e l'allenamento degli agenti patogeni ematici prima di lavorare con tessuti di origine umana. Devono essere indossati adeguati dispositivi di protezione individuale.

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