Name: enhanced viability for ex vivo 3d hydrogel cultures of patient-derived xenografts in a perfused microfluidic platform
Uploaded: 2020-12-05T13:00:00
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この研究は、国立衛生研究所SBIRフェーズI(HHSN26120700015C)およびP01CACA098912によって支援されました。

腫瘍組織は患者の同意を得て、承認された機関審査委員会(IRB)プロトコルに従って得られた。異種移植片は、受け入れられた制度的動物管理使用委員会(IACUC)プロトコルに従って移植、成長、収穫された。
注:すべての作業は、無菌性を維持するために無菌生物学的安全キャビネットで行われることです。特に指定がない限り、すべてのステップは室温で行う必要がありま?...

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	<li>Jung, J., Seol, H. S., Chang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Generation+and+Application+of+Patient-Derived+Xenograft+Model+for+Cancer+Research.">The Generation and Application of Patient-Derived Xenograft Model for Cancer Research.</a> Cancer Research and Treatment: Official Journal of Korean Cancer Association. 50 (1), 1-10 (2018).</li><li>Malaney, P., Nicosia, S. V., Dave, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One+mouse,+one+patient+paradigm:+New+avatars+of+personalized+cancer+therapy.">One mouse, one patient paradigm: New avatars of personalized cancer therapy.</a> Cancer Letters. 344 (1), 1-12 (2014).</li><li>Meehan, T. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PDX-MI:+Minimal+Information+for+Patient-Derived+Tumor+Xenograft+Models.">PDX-MI: Minimal Information for Patient-Derived Tumor Xenograft Models.</a> Cancer Research. 77 (21), 62-66 (2017).</li><li>Fong, E. L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogel-Based+3D+Model+of+Patient-Derived+Prostate+Xenograft+Tumors+Suitable+for+Drug+Screening.">Hydrogel-Based 3D Model of Patient-Derived Prostate Xenograft Tumors Suitable for Drug Screening.</a> Molecular Pharmaceutics. 11 (7), 2040-2050 (2014).</li><li>Fong, E. L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+3D+in+vitro+model+of+patient-derived+prostate+cancer+xenograft+for+controlled+interrogation+of+in+vivo+tumor-stromal+interactions.">A 3D in vitro model of patient-derived prostate cancer xenograft for controlled interrogation of in vivo tumor-stromal interactions.</a> Biomaterials. 77, 164-172 (2016).</li><li>Engel, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyaluronic+Acid-Based+Hydrogel+Formulations+Suitable+for+Automated+3D+High+Throughput+Drug+Screening+of+Cancer-Stromal+Cell+Cocultures.">Hyaluronic Acid-Based Hydrogel Formulations Suitable for Automated 3D High Throughput Drug Screening of Cancer-Stromal Cell Cocultures.</a> Advanced Healthcare Materials. 4 (11), 1664-1674 (2015).</li><li>Lanz, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapy+response+testing+of+breast+cancer+in+a+3D+high-throughput+perfused+microfluidic+platform.">Therapy response testing of breast cancer in a 3D high-throughput perfused microfluidic platform.</a> BMC Cancer. 17 (1), 709 (2017).</li><li>Wevers, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+compound+evaluation+on+3D+networks+of+neurons+and+glia+in+a+microfluidic+platform.">High-throughput compound evaluation on 3D networks of neurons and glia in a microfluidic platform.</a> Scientific Reports. 6, 38856 (2016).</li><li>Vulto, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phaseguides:+a+paradigm+shift+in+microfluidic+priming+and+emptying.">Phaseguides: a paradigm shift in microfluidic priming and emptying.</a> Lab on a Chip. 11 (9), 1596-1602 (2011).</li><li>Patru, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD133,+CD15/SSEA-1,+CD34+or+side+populations+do+not+resume+tumor-initiating+properties+of+long-term+cultured+cancer+stem+cells+from+human+malignant+glio-neuronal+tumors.">CD133, CD15/SSEA-1, CD34 or side populations do not resume tumor-initiating properties of long-term cultured cancer stem cells from human malignant glio-neuronal tumors.</a> BMC Cancer. 10, 66 (2010).</li><li>Harma, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+panel+of+three-dimensional+models+for+studies+of+prostate+cancer+growth,+invasion+and+drug+responses.">A comprehensive panel of three-dimensional models for studies of prostate cancer growth, invasion and drug responses.</a> PLoS One. 5 (5), 10431 (2010).</li></ol>

ここでは、高スループットの3D培養システムにおける生き生きとPDX由来腫瘍細胞の処理および培養方法について説明する。このプロトコルはPCa PDX組織を利用するが、他の上皮由来腫瘍にも同様に有効である。腫瘍の特徴は、同じ起源の組織(前立腺、乳房など)内であっても、個々のPDXライン間で変化する。いくつかの PCa PDX ラインは、より繊維性および他の細胞がより細胞性である間から生?...

過去10年間、がん研究の分野は、がん細胞経路の依存性および薬物感受性を評価するためのツールとして、患者由来の異種移植片(PDXs)に対する新たな熱意を示してきた。最も一般的なPDXモデルは、ヒト腫瘍細胞の皮下または異形移植(腫瘍断片、解離された腫瘍由来細胞のクラスター、または単離循環腫瘍細胞(CTC)のサンプル)によってげっ歯類宿主に確立される。腫瘍の「テイク」が成功した場合、異種移植細胞は増殖し、血管化し、そうでなければ宿主組織と相互作用して腫瘍を作り出し、最適なサイズで収穫し、細分化し、他の宿主に再移植することができる。モデルシステムとしてのそれらの多くの利点の中で、PDXsは典型的には、天然腫瘍細胞集団の不均一性のかなりの部分を保持し、ヒト特異的経路および細胞応答の評価を可能にする22、3。3in vivoコンテキストは、血管系および他の隣接する間質との腫瘍相互作用を可能にし、薬物拡散ダイナミクス、酸素張力、および生物学的および機械的に腫瘍の進行に影響を与える細胞外マトリックスの影響などの組織特性を再現する。PDXの否定的な側面は、腫瘍の拡大と最終的には仮説検査の両方に対するげっ歯類宿主への依存である。多くのPDXは、望ましい特性の多くを失うことなく、組織培養ポリスチレンの伝統的な2次元(2D)培養に適応できないため、この比較的制御されたインビトロ法と、生体内PDX使用の費用、施設、および時間要件の大幅な増加の間に研究者のための最小限の中間地点がありました。
我々は、支持的なマトリックス内で3D細胞培養を実施する複数のインビトロモデルを説明し、最近、骨髄由来線維芽細胞44,55と共培養する単独で、また骨髄由来のPDXと共培養して、複数の前立腺癌(PCa)由来PDXのエクスビボ培養を実証する作業を拡大した。ヒアルロン酸(HA)ベースのヒドロゲルマトリックスは、ヒドロゲル深度6を介したイメージングのためのヒドロゲル特性および光学的明瞭性を簡単に制御して、両方の細胞タイプにカスタマイズ可能かつ生物学的に関連するサポートを提供する。
成熟したPDX腫瘍組織は、異種ヒト癌細胞とマウス間質(線維芽細胞、内皮細胞など)の可変混合物を含む。インビトロで腫瘍進行に対する細胞型特異的な寄与を研究するために、腫瘍を解離し、細胞集団を分離し、それらを組織的に組み込んで細胞間コミュニケーションの経路を解剖することが有利である。組織のデジエステート内の混合細胞集団は、特定の培養条件との相性が異なる。例えば、腫瘍関連線維芽細胞の生存率は、インテグリンリガンドで機能する表面付着または3Dマトリックスのいずれかを必要とし、上皮由来PDX細胞は通常これらの要件を有せず、代わりに細胞細胞相互作用を好む。これらの違いは、PDX細胞を汚染するマウス間質細胞からの効果的な分離を達成するために利用することができる。組織デジエステートの回転培養により、細胞細胞の接着が組織培養表面に付着し、細胞-細胞接着は回転培養表面の上に浮遊するPDX細胞を駆動し、上清中に24〜48時間で多細胞クラスターを形成する。これらのクラスターの特定の特性は、PDX(例えば、大きく、タイトで、球状の高いクラスターまたはブドウの束に似たより緩い凝集体)によって異なりますが、通常は生物学的に関連するサイズ(50-250 μm直径)であり、細胞間接触に依存する細胞相互作用を評価するのに十分です。
腫瘍の検索と処理は、機械的/酵素的破壊による短期的な損傷、または選択された培養条件との亜集団の長期的な不適合性のいずれかによる、ある程度の担保細胞死をもたらす。初期のバルク分離としての回転培養の有用性にもかかわらず、死細胞または死死細胞は必然的にPDXクラスターと共に移され、結果として生じる培養に影響を与える可能性がある。これらの死細胞は、クラスターに統合されなかった個々のPDX細胞、選択した培養条件で生き残ることができないマウス間質線維芽細胞、または特に脆弱な内皮細胞である。このような死細胞は、「生存者」からの実験結果に影響を及ぼし、例えば蛍光画像ベースの生存率スクリーニングアッセイを介して定量に実質的に影響を与える可能性がある。この方法から生きたPDX細胞の選択を改善するために、我々は容易にPDX混合物から個々の死滅/死細胞を除去し、主に生きている多細胞クラスターを保持するために密度ステップを有する遠心分離法を適応した。
3D培養における結果として得られるPDX由来クラスターの研究を強化するために、我々はマイクロ流体ベースの灌流培養プラットフォームであるOrganoPlate(図1)を利用し、384マイクロウェルチタープレートベース上で最大96個のパーフュード3D培養を同時培養できる高スループットのオルガン・オン・チップ・プラットフォームである(図1A)77.82レーンマイクロ流体プレートでは、1つの組織チップが2つのマイクロ流体チャネル(図1B、ゲルチャネル:赤、灌流チャネル:青)によって接続され、4つのウェルが連続して広がります。2つのマイクロ流体チャネルは、隣接する隣接チャネルへの1つのチャネルのオーバーフローを防止するフェーズガイドと呼ばれる短いプラスチック製の尾根によって分離され、同時にゲルの内容物と灌流チャネル9との間の膜のない界面を可能にする。マイクロ流体プレートの底部は顕微鏡グレードのガラスで構成されているため、標準的な顕微鏡または自動顕微鏡でプレートの底を通して観察窓で培養を見ることができます。灌流は、マイクロ流体チャネルを介して媒体を駆動するために重力を使用して、貯蔵井戸の間に、プログラム可能なロッカーとマイクロ流体プレートに確立される(図1C)。灌流フロー模倣は、静的培養よりも腫瘍微小環境をより密接に再現し、せん断応力の取り込みとガスおよび栄養素の分布の強化を可能にする。マイクロ流体プレートにおけるパーフューズド癌細胞培養を維持する利点は、同じ細胞の静的3D培養と比較して最適な生存率を示したパーフューズド乳癌培養物として以前に記載されている7。
本報告書は、生きた多細胞PDXクラスターを単離するための適応密度勾配遠心分離法を説明し、透過性マイクロ流体プレート内で3D PDX培養を確立する際にその有用性を示す。PDXの使用を容易にする方法を求めている研究所が増えているため、ここで紹介するプロトコルは即時に役立つと予想しています。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:812px;" width="812">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">1N NaOH</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td style="width:224px;">any suitable tissue culture grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">60 mm round tissue culture dishes</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td>any suitable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">6-well tissue culture plates</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td>any suitable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">70 &#181;m cell strainers</td>
			<td style="width:148px;">Corning</td>
			<td style="width:189px;">431751</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:251px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:148px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:189px;">5810R with suitable rotor and buckets for 15/50 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Density gradient centrifugation solution</td>
			<td style="width:148px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:189px;">P1644</td>
			<td>Percoll</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Dimethylsulfoxide</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td>any suitable tissue culture grade</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Dissociation enzyme solution</td>
			<td style="width:148px;">StemCell Technologies</td>
			<td style="width:189px;">07921</td>
			<td style="width:224px;">ACCUMAX</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">DMEM-F12</td>
			<td style="width:148px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:189px;">11039021</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Forceps</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td>any suitable</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">HA hydrogel kit</td>
			<td style="width:148px;">ESI BIO</td>
			<td style="width:189px;">GS311</td>
			<td style="width:224px;">HyStem (Hyaluronic acid-SH and PEGDA)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Hanks Balanced Salt Solution</td>
			<td style="width:148px;">Lonza</td>
			<td style="width:189px;">10-527F</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Heat-inactivated fetal bovine serum</td>
			<td style="width:148px;">Atlanta Biologicals</td>
			<td style="width:189px;">S11150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Hemocytometer</td>
			<td style="width:148px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:189px;">02-671-51B Hausser BrightLine</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Hoechst 33342</td>
			<td style="width:148px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:189px;">H1398</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Image processing software</td>
			<td style="width:148px;">Oxford Instruments</td>
			<td style="width:189px;">Imaris 9.3</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:251px;">LIVE/DEAD Cell Viability/Cytotoxicity Kit (Calcein-AM/Ethidium Homodimer-1)</td>
			<td style="width:148px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:189px;">L3224</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Microfluidic culture plate</td>
			<td style="width:148px;">Mimetas</td>
			<td style="width:189px;">9603-400-B</td>
			<td>2-lane OrganoPlate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Microscope</td>
			<td style="width:148px;">Nikon</td>
			<td style="width:189px;">A1R</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="68">
			<td height="68" style="height:68px;width:251px;">Multichannel pipette</td>
			<td style="width:148px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:189px;">3125000036</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:251px;">PDX-derived tumor tissue</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td style="width:224px;">obtained under IRB approval for human tissue and IACUC approval for animal host</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Penicillin-streptomycin</td>
			<td style="width:148px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:189px;">15140-122</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Perfusion rocker</td>
			<td style="width:148px;">Mimetas</td>
			<td style="width:189px;">OrganoPlate Perfusion Rocker Mini</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">pH strips (pH 5-9)</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td>any suitable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Phosphate-buffered saline solution</td>
			<td style="width:148px;">Lonza</td>
			<td style="width:189px;">17-516F</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Razor blades</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td>any suitable</td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;width:251px;">Rotating xy-shaker</td>
			<td style="width:148px;">VWR</td>
			<td style="width:189px;">Advanced 3500 Orbital Shaker</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Scalpel handle</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td>any suitable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Single channel repeating pipette</td>
			<td style="width:148px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:189px;">22260201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Sterile, 15mL conical centrifuge tubes</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td>any suitable</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Sterile, 50mL conical centrifuge tubes</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td>any suitable</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

enhanced viability for ex vivo 3d hydrogel cultures of patient-derived xenografts in a perfused microfluidic platform

切除された患者の腫瘍組織が免疫不全マウスに直接生じたときに生成される患者由来の異種移植片(PDX)は、生物学的に安定なままであり、それによって、分子、遺伝的、および組織学的特徴、ならびに元の腫瘍の不均一性を維持する。しかし、これらのモデルを使用して薬物スクリーニングを含む多数の実験を行うことは、コストと時間の両方の面で非常に高い。3次元(3D)培養システムは、がん細胞が生化学的相互作用、形態、建築を通じて生物学的完全性を保持するプラットフォームとして広く見られている。当社のチームは、ヒアルロン酸(HA)で構成された3Dマトリックスを用いて、インビトロでPDX細胞を培養した豊富な経験を持っています。PDXに関連するマウス線維芽細胞間質細胞を分離するために、我々は回転細胞が組織培養処理プレートの表面に付着し、PDX腫瘍細胞を浮遊させ、多細胞クラスターに自己関連付ける回転培養を使用する。また、上清に浮遊する単一の死細胞は、3D細胞培養のためのヒドロゲルへの下流カプセル化のための実行可能なPDXクラスターを収集する際に課題を提示する。これらの単一細胞を生細胞クラスターから分離するために、我々は密度ステップ勾配遠心分離を採用した。ここで説明するプロトコルは、さらなるインビトロ実験に使用される細胞クラスターの健全な集団からの非生存可能な単一細胞の枯渇を可能にする。我々の研究では、培養中の培地灌流を可能にするマイクロ流体プレートに3D培養を組み込む。精製細胞と非精製細胞の蛍光画像ベースの生存アッセイを用いて得られた培養物を評価した結果、この追加分離ステップが、我々の培養物からの非生存細胞の数を大幅に減少させたことを示した。

プログラム可能な灌流ロッカーを標準的な水ジャッキ細胞培養器で調製し、2車線のマイクロ流体プレートをローディング用の標準的なバイオセーフティキャビネットに用意した(図1)。MDA-PCA-118b PDX腫瘍は、インビボで拡大し、最大サイズに達したときに収穫し、プロトコルセクション2に記載されているように解離して細胞のスラリー懸濁を作り出し、ほぼ単一細胞状態?...

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Enhanced Viability for Ex vivo 3D Hydrogel Cultures of Patient-Derived Xenografts in a Perfused Microfluidic Platform

本プロトコルは、患者由来異種移植片(PDX)の拡張in vitro培養を可能にする方法を示す。1つのステップは、非生存可能な単一細胞を簡単に除去することで、3Dヒドロゲルにおける多細胞クラスター培養の全体的な生存率を高めます。二次ステップは、パーフューズされたマイクロ流体プラットフォームにおけるPDX培養のベストプラクティスを示します。

浸透マイクロ流体プラットフォームにおける患者由来異種移植片のEx vivo 3Dヒドロゲル培養の生存率の向上

Patient-derived xenografts (PDX), generated when resected patient tumor tissue is engrafted directly into immunocompromised mice, remain biologically ...

患者由来の腫瘍サンプルの培養方法の改善は、従来の細胞株の使用から離れるにつれて非常に重要です。このプロトコルは、生体内癌モデルとは異なり、高スループットおよび高含有スクリーニングに適したプラットフォームにおける患者由来腫瘍細胞のインビトロ培養を可能にする。PDXを組み込んだプラットフォームは、ネイティブ腫瘍を反映するより異質なシステムを評価することを可能にする。これは、薬物のメカニズムへの洞察を得ることができ、より速い薬物スクリーニングを可能にする.この方法は、間質、内皮、および免疫細胞の組み込みによって拡張することができる。これらの共同培養は、ネイティブの腫瘍集団と建築をさらに反映している可能性があります。PDXのようなより貴重な細胞に移行する前に、簡単に拡張された細胞株を持つマイクロ流体プレートをロードする練習。プレート分配中のアライメントは成功に大きな影響を与え、視覚的なデモンストレーションはこの概念を容易に伝えることができます。開始するには、腫瘍組織を前計量された無菌50ミリリットル円錐形チューブに移す。血液および汚染物質を除去するために30ミリリットルの無菌PBSで6回リンスする。できるだけ多くの液体を取り出し、腫瘍組織を秤量する。腫瘍組織を60ミリメートルの丸い組織培養皿に移し、滅菌カミソリの刃またはメスを使用して1ミリメートルの部分にミンチします。PDX処理媒体を5ミリリットル加えて、腫瘍スラリーを採取します。5ミリリットルの解離酵素溶液を加えて、腫瘍スラリーを採取する。別の5ミリリットルの解離酵素溶液で培養皿をリンスします。その後、PDX処理媒体を5ミリリットル加えます。穏やかな揺れで摂氏37度で20分インキュベート。インキュベーション時間の途中で、チューブをそっと旋回します。インキュベーションの後、ピペットを血清ピペットで穏やかに上下にして塊を分解します。新しい無菌50ミリリットルチューブの上に70ミクロンの細胞ストレーナーを置き、細胞をろ過します。次いで遠心分離機を1,200rpmで2分間ペレットし、細胞をペレット化した。上清を取り除き、PDX培地を2~3ミリリットルで再懸濁する。ヘモサイトメーターまたは自動セルカウンターを使用して細胞をカウントします。チップあたりの所望の細胞密度を達成するために必要な PDX 誘導細胞の必要数を推定するには、この表を使用します。6ウェル組織培養板のウェル当たりPDX培養培地の5ミリリットルの6細胞に1〜2回10を1〜2回プレートする。50~55rpmで穏やかな揺れを伴い、摂氏37度、炭酸ガス5%、湿度95%で48時間インキュベートし、クラスター形成を促進します。クラスターが形成されたら、遠心分離に進みます。まず、18ミリリットルの密度勾配遠心分離液を無菌50ミリリットルの円錐管に2ミリリットルの無菌10X HBSSSと完全に混合して20ミリリットルの100%の勾配溶液を調製します。滅菌1X HBSSでこの100%溶液を希釈して、それぞれ10ミリリットルの20%30%40%と55%密度勾配溶液を作ります。15ミリリットルの円錐管の底に55%の密度の勾配の溶液の3ミリリットルを加える。チューブを斜めに保持し、40%密度の勾配溶液の3ミリリットルをチューブの斜め側と55%層の上にゆっくりと分配します。30%の密度勾配解を繰り返します。次に、PDX回転培養物の上清を5ミリリットルの血清ピペットでチューブに集め、プレート表面を穏やかにすすいでください。遠心分離機を1、200rpmで2分間ペレット細胞にする。上清を取り除き、20%密度の勾配溶液の3ミリリットルで細胞ペレットを再懸濁する。慎重に15ミリリットルチューブの勾配の上に細胞と20%の密度の勾配溶液を重ね合う。チューブと遠心分離機をスイングバケツローター遠心分離機に30分、摂氏4度、2,000倍G、ゼロブレークでキャップします。遠心分離後、分数が表示されます。実行可能なPDX細胞培養は、典型的には40〜55%の密度勾配溶液界面に見られる。新鮮な15ミリリットルのチューブに各分率の2〜3ミリリットルを収集します。各分数に3〜4巻の無菌1X HBSSを加え、完全に混ぜ合わせるために反転します。遠心分離機をGを1,000回3分間ペレット化し、細胞をペレット化する。上清を取り除く。PDX処理媒体の1〜2ミリリットルで細胞ペレットを再懸濁する。50~100マイクロリットルの小さなアリコートをチューブに移し、等量の解離酵素溶液を加え、解離液を取り出します。クラスター化セル懸濁液のセル数を評価します。ヘモサイトメーターまたは自動セルカウンターを使用して細胞を数えます。メーカーの指示に従ってヒアルロン酸ヒドロゲル溶液を再構成してください。マルチチャンネルピペットを使用して、2車線のマイクロ流体プレートの観測ウィンドウ列のすべてのウェルに50マイクロリットルのHBSSを加え、培養湿度と最適なイメージング条件を維持します。所望の細胞密度でヒドロゲルの50マイクロリットルに必要な細胞懸濁液の体積を計算します(例えば、マイクロリットル当たり5,000細胞)。1つのマイクロ流体プレートを播種する場合、計算された体積を4つの無菌1.5ミリリットル遠心分離管のそれぞれにアリクォー。HAチオール溶液のpHを、使用直前に1種の水酸化ナトリウムで8個に調整します。40マイクロリットルのHAチオールを10マイクロリットルのPEGdAと混合し、時間をかけてゲル化をモニタリングすることにより、試験ゲル化を行います。次に、細胞懸濁液アリコートを200倍Gで2分間遠心し、室温で細胞をペレット化する。上清を慎重に取り除き、50マイクロリットルの最終体積のために40マイクロリットルのHAチオールで細胞を再懸濁する。HAチオールの細胞の1アリコートに10マイクロリットルのPEGdAを加える。よく混ぜ、マイクロ流体プレートを播種する前に1〜3分待ちます。1.5マイクロリットルを単一チャネル反復ピペットに塗布するためのチップを貼り付け、HAヒドロゲル溶液中の細胞に負荷を加えます。水素アリコートは、細胞の分布を確実にするためによく混合しておくことを忘れないでください。マイクロ流体プレートをシードするには、ピペットチップをブレードに垂直に位置合わせし、先端をゲル入口の中央にそっと配置して接触を確実にしますが、1.5マイクロリットルのヒドロゲル溶液を分配する際に圧力を加えないようにします。プレートの上部、プレートの底面、または顕微鏡で見て、マイクロ流体チャネルの充填状況を観察します。この図をガイドとして使用して、荷重を評価します。ロードの1分後、次のアリコートの準備中にプレートを反転させます。HA溶液中の細胞の残りの3つのアリコートについてマイクロ流体プレートの播種を繰り返します。すべてのチップを充填した後、ゲル化が完了するまで45分間加湿インキュベーターで37°Cでプレートをインキュベートします。その後、提供されたマニュアルを使用して、14度の角度と4分間隔で正しい拡散設定で細胞培養インキュベーターに灌流ロッカーが取り付けられていることを確認してください。PDX細胞培養培地を50マイクロリットルの培地入口に加えます。プレートを表面にそっとタップして、マイクロ流体チャネルを満たす液体を促します。次に、プレートを反転して、チャンネルが正しく塗りつぶされているかどうかを確認します。DMEM/F-12を50マイクロリットルのDMEM/F-12に加えます。もし、空気泡が灌流流に閉じ込められている場合は、表面に対してプレートを穏やかに叩いて取り除きます。顕微鏡とプレートレイアウトフォームを使用して、チップ充填の成功を記録します。不適切に充填されたチップを、さらなる実験的使用から除外する。14度の傾きと4分のサイクルに設定されたチルトロッカーにプレートを置き、灌流を開始します。2日ごとに、PDX培養培地を交換し、最初に入口に50マイクロリットル、次いで出口に50マイクロリットルを入れ替える。本研究では、プログラム可能な灌流ロッカーを標準的な水ジャケット細胞培養インキュベーターに設置し、2車線のマイクロ流体ブレードを装填用の標準的なバイオセーフティキャビネットに用意した。3Dマイクロ流体PDX培養の生存率および形態は、分離されていない及び密度勾配遠心分離条件の両方で評価した。1日目、分離法を経たそれらの培養物は、分離されていない培養物に比べて10倍少ない単死細胞を示した。重要なことに、分離されたクラスターは主に生きた細胞で構成されていました。クラスター サイズ分布に対して統計的に有意な差は確認されませんでした。培養液は、マイクロ流体プレート内で7日間さらに維持された。生細胞の総数は一貫しており、クラスターは培養の寿命にわたって約80%の生存率を保持した。各PDXラインはユニークなので、腫瘍消化の容易さ、クラスターの表向きの大きさと形態、および勾配精製内のクラスターの位置は異なります。この方法を用いて確立されたPDX培養物は、画像またはプレートリーダーベースの生存アッセイ、固定および免疫蛍光標識、または他のプロトコル用の細胞ライセートを収集するために解像してアッセイすることができる。この方法により、研究者は腫瘍細胞の生物学または薬物反応を探求するために、腫瘍微小環境を再現することができます。ユーザーは、人間由来の組織で作業する前に、標準的な人間の被験者のトレーニングと血液媒介病原体のトレーニングを完了する必要があります。適切な個人用保護具を着用する必要があります。

Research

JoVE Journal

Cancer Research

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