Name: enhanced viability for ex vivo 3d hydrogel cultures of patient-derived xenografts in a perfused microfluidic platform
Uploaded: 2020-12-05T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Enhanced Viability for Ex vivo 3D Hydrogel Cultures of Patient-Derived Xenografts in a Perfused Microfluidic Platform at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health National Cancer Institute SBIR Phase I (HHSN26120700015C) og P01CA098912.

Tumorvev ble innhentet med pasientens samtykke og i henhold til en godkjent Institutional Review Board (IRB) protokoll. Xenografts ble implantert, dyrket og høstet i henhold til en akseptert Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) protokoll.
MERK: Alt arbeid skal utføres i et sterilt biologisk sikkerhetsskap for å opprettholde steriliteten. Alle trinn bør utføres ved romtemperatur med mindre annet er spesifisert.
1. Utarbeidelse av materialer for PDX-...

<ol>
	<li>Jung, J., Seol, H. S., Chang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Generation+and+Application+of+Patient-Derived+Xenograft+Model+for+Cancer+Research.">The Generation and Application of Patient-Derived Xenograft Model for Cancer Research.</a> Cancer Research and Treatment: Official Journal of Korean Cancer Association. 50 (1), 1-10 (2018).</li><li>Malaney, P., Nicosia, S. V., Dave, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One+mouse,+one+patient+paradigm:+New+avatars+of+personalized+cancer+therapy.">One mouse, one patient paradigm: New avatars of personalized cancer therapy.</a> Cancer Letters. 344 (1), 1-12 (2014).</li><li>Meehan, T. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PDX-MI:+Minimal+Information+for+Patient-Derived+Tumor+Xenograft+Models.">PDX-MI: Minimal Information for Patient-Derived Tumor Xenograft Models.</a> Cancer Research. 77 (21), 62-66 (2017).</li><li>Fong, E. L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogel-Based+3D+Model+of+Patient-Derived+Prostate+Xenograft+Tumors+Suitable+for+Drug+Screening.">Hydrogel-Based 3D Model of Patient-Derived Prostate Xenograft Tumors Suitable for Drug Screening.</a> Molecular Pharmaceutics. 11 (7), 2040-2050 (2014).</li><li>Fong, E. L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+3D+in+vitro+model+of+patient-derived+prostate+cancer+xenograft+for+controlled+interrogation+of+in+vivo+tumor-stromal+interactions.">A 3D in vitro model of patient-derived prostate cancer xenograft for controlled interrogation of in vivo tumor-stromal interactions.</a> Biomaterials. 77, 164-172 (2016).</li><li>Engel, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyaluronic+Acid-Based+Hydrogel+Formulations+Suitable+for+Automated+3D+High+Throughput+Drug+Screening+of+Cancer-Stromal+Cell+Cocultures.">Hyaluronic Acid-Based Hydrogel Formulations Suitable for Automated 3D High Throughput Drug Screening of Cancer-Stromal Cell Cocultures.</a> Advanced Healthcare Materials. 4 (11), 1664-1674 (2015).</li><li>Lanz, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapy+response+testing+of+breast+cancer+in+a+3D+high-throughput+perfused+microfluidic+platform.">Therapy response testing of breast cancer in a 3D high-throughput perfused microfluidic platform.</a> BMC Cancer. 17 (1), 709 (2017).</li><li>Wevers, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+compound+evaluation+on+3D+networks+of+neurons+and+glia+in+a+microfluidic+platform.">High-throughput compound evaluation on 3D networks of neurons and glia in a microfluidic platform.</a> Scientific Reports. 6, 38856 (2016).</li><li>Vulto, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phaseguides:+a+paradigm+shift+in+microfluidic+priming+and+emptying.">Phaseguides: a paradigm shift in microfluidic priming and emptying.</a> Lab on a Chip. 11 (9), 1596-1602 (2011).</li><li>Patru, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD133,+CD15/SSEA-1,+CD34+or+side+populations+do+not+resume+tumor-initiating+properties+of+long-term+cultured+cancer+stem+cells+from+human+malignant+glio-neuronal+tumors.">CD133, CD15/SSEA-1, CD34 or side populations do not resume tumor-initiating properties of long-term cultured cancer stem cells from human malignant glio-neuronal tumors.</a> BMC Cancer. 10, 66 (2010).</li><li>Harma, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+panel+of+three-dimensional+models+for+studies+of+prostate+cancer+growth,+invasion+and+drug+responses.">A comprehensive panel of three-dimensional models for studies of prostate cancer growth, invasion and drug responses.</a> PLoS One. 5 (5), 10431 (2010).</li></ol>

Her beskriver vi en metode for behandling og dyrking av levedyktige PDX-avledede tumorceller i et høyt gjennomstrømmings-, perfundert 3D-kultursystem. Mens denne protokollen benytter PCa PDX vev, det er like effektivt for andre epitel-avledede svulster. Tumoregenskaper varierer mellom individuelle PDX-linjer selv innenfor samme opprinnelsesvev (prostata, bryst, etc.). Noen PCa PDX linjer er mer fibrotiske og vanskelig å isolere levedyktige celler fra mens andre er mer cellulære. Tumorstørrelsen som er nevnt her, kan...

I løpet av det siste tiåret har feltet for kreftforskning vist fornyet entusiasme for pasientavledede xenografts (PDXs) som et verktøy for å vurdere kreftcelleveiavhengighet og legemiddelfølsomhet1. De vanligste PDX-modellene er etablert ved subkutan eller ortopisk implantasjon av menneskelige tumorceller – et tumorfragment, en klynge av dissosierte tumoravledede celler eller en prøve av isolerte sirkulerende tumorceller (CTCer) – til en gnagervert. Hvis svulsten "ta" er vellykket, vil xenograftcellene spre seg, vaskularisere og ellers samhandle med vertsvevet for å skape en svulst, som kan høstes i optimal størrelse, deles og implanteres i andre verter. Blant deres mange fordeler som modellsystem beholder PDXs vanligvis en betydelig del av den innfødte tumorcellepopulasjonens heterogenitet og muliggjør vurdering av menneskespesifikke veierog celleresponser 2,3. In vivo-konteksten muliggjør tumorinteraksjon med vaskulatur og andre tilstøtende stroma og rekafulerer vevsegenskaper som stoffdiffusjonsdynamikk, oksygenspenning og ekstracellulær matrisepåvirkning som biologisk og mekanisk påvirker tumorprogresjonen. Et negativt aspekt ved PDXs er deres avhengighet av en gnagervert, både for tumorutvidelse og til slutt for hypotesetesting. Fordi mange PDX-er ikke kan tilpasse seg tradisjonell todimensjonal (2D) kultur på vevskultur polystyren uten å miste mange av sine ønskelige egenskaper, har det vært minimal middelvei for forskere mellom denne relativt kontrollerte in vitro-metoden, og den betydelige økningen i utgifter, fasiliteter og tidskrav for in vivo PDX-bruk.
Vi har beskrevet flere in vitro-modeller som implementerer 3D-cellekultur i en støttende matrise, og nylig utvidet dette arbeidet med å demonstrere ex vivo-kulturen til flere prostatakreft (PCa)-avledede PDXs, både alene og i co-kultur med benmargsavledet fibroblaster4,,5. Hyaluronsyre (HA)-baserte vanngelmatriser gir tilpassbar og biologisk relevant støtte for begge celletyper, med facile kontroll over hydrogelegenskaper og optisk klarhet for avbildning gjennom hydrogeldybden6.
Modne PDX tumorvev består av en variabel blanding av heterogene humane kreftceller og mus stroma (fibroblaster, endotelceller, etc.). For å studere celle-type spesifikke bidrag til tumorprogresjon in vitro, kan det være en fordel å dissosiere svulster, skille cellepopulasjonene og eksperimentelt innlemme dem på en organisert måte for å dissekere veier for intercellulær kommunikasjon. De blandede cellepopulasjonene i vevsfordøyer har differensialkompatibilitet med spesifikke kulturforhold. For eksempel, tumor-assosiert fibroblast levedyktighet nødvendiggjør enten overflatetilslutning eller 3D matriser funksjonalisert med integrinske ligands, mens epitel-avledede PDX-celler vanligvis ikke har disse kravene, i stedet favoriserer cellecelleinteraksjoner. Disse forskjellene kan utnyttes for å oppnå effektiv separasjon av PDX-celler fra forurensende musstromale celler. Rotasjonskultur av vevsfordøyer gjør at stromal celleoverholdelse av vevskulturoverflaten mens cellecelleadhesjoner driver PDX-celler som flyter over den roterende kulturoverflaten for å danne flercellede klynger i supernatanten i 24-48 timer. De spesifikke egenskapene til disse klyngene varierer med PDX (f.eks. store, stramme, svært sfæriske klynger eller mindre, løsere aggregater som ligner bunter av druer), men er vanligvis av biologisk relevante størrelser (50-250 μm diameter), tilstrekkelig for å vurdere cellulære interaksjoner som er avhengige av intercellulære kontakter.
Tumorhenting og behandling resulterer uunngåelig i en viss grad av sikkerhet celledød, enten på grunn av kortsiktigskade fra mekanisk / enzymatisk forstyrrelse, eller langsiktig inkompatibilitet av underpopulasjoner med de valgte kulturforholdene. Til tross for nytten av rotasjonskultur som en innledende bulkseparasjon, overføres døde eller døende celler uunngåelig med PDX-klyngene og kan påvirke den resulterende kulturen. Disse døde cellene er ofte individuelle PDX-celler som ikke ble integrert i en klynge, musstrommale fibroblaster som ikke kan overleve under utvalgte kulturforhold, eller spesielt skjøre endotelceller. Slike døende celler kan påvirke eksperimentelle resultater fra "overlevende" og kan i stor grad påvirke kvantifisering, for eksempel via fluorescerende bildebaserte levedyktighetsscreeningsanalyser. For å forbedre utvalget av levende PDX-celler fra denne metoden, tilpasset vi sentrifugeringsmetoder med tetthetstrinn for enkelt å fjerne individuelle døde / døende celler fra PDX-blandinger og beholde hovedsakelig levende flercellede klynger.
For å forbedre studien av resulterende PDX-avledede klynger i 3D-kultur, vi benyttet en mikrofluidisbasert perfusjonskulturplattform, OrganoPlate (Figur 1), som er en høy gjennomstrømningsorgan-on-a-chip plattform som muliggjør samtidig kultur på opptil 96 individuelle perfused, 3D-kulturer på en 384-brønns mikrotiter platebase (figur 1A)7,8. I 2-felts mikrofluidisk plate er en enkelt vevsbrikke forbundet med to mikrofluidiske kanaler (figur 1B, gelkanal: rød, perfusjonskanal: blå) som strekker seg over fire brønner på rad. De to mikrofluidiske kanalene er adskilt av en kort plastrygg kalt en Phaseguide som forhindrer overløp av en kanal inn i sin tilstøtende nabokanal, og samtidig gir mulighet for et membranfritt grensesnitt mellom innholdet i gelen og perfusjonskanal9. Fordi bunnen av mikrofluidplaten består av mikroskop-grade glass, kan kulturene ses i observasjonsvinduet gjennom bunnen av platen med et standard eller automatisert mikroskop. Perfusjon er etablert i mikrofluidisk plate med en programmerbar rocker, ved hjelp av tyngdekraften til å drive media gjennom mikrofluidiske kanaler, mellomreservoarbrønner ( figur 1C). Perfusjonsstrømmen etterligner nærmere tumormikromiljøet enn statisk kultur, noe som åpner for inkorporering av skjærstress og forbedret fordeling av gasser og næringsstoffer. Fordelene med å opprettholde en perfundert kreftcellekultur i mikrofluidisk plate har tidligere blitt beskrevet som perfused brystkreftkulturer som viste optimal levedyktighet sammenlignet med en statisk 3D-kultur av de samme cellene7.
Den nåværende rapporten beskriver en adapted density gradient sentrifugeringsmetode for å isolere levende flercellede PDX-klynger og demonstrerer sitt verktøy for å etablere 3D PDX-kulturer innenfor 1000 mikrofluidiske plater. Fordi et økende antall forskningslaboratorier søker metoder for å lette PDX-bruk, forventer vi at protokollene som presenteres her, vil være til umiddelbar nytte.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:812px;" width="812">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">1N NaOH</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td style="width:224px;">any suitable tissue culture grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">60 mm round tissue culture dishes</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td>any suitable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">6-well tissue culture plates</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td>any suitable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">70 &#181;m cell strainers</td>
			<td style="width:148px;">Corning</td>
			<td style="width:189px;">431751</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:251px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:148px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:189px;">5810R with suitable rotor and buckets for 15/50 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Density gradient centrifugation solution</td>
			<td style="width:148px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:189px;">P1644</td>
			<td>Percoll</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Dimethylsulfoxide</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td>any suitable tissue culture grade</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Dissociation enzyme solution</td>
			<td style="width:148px;">StemCell Technologies</td>
			<td style="width:189px;">07921</td>
			<td style="width:224px;">ACCUMAX</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">DMEM-F12</td>
			<td style="width:148px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:189px;">11039021</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Forceps</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td>any suitable</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">HA hydrogel kit</td>
			<td style="width:148px;">ESI BIO</td>
			<td style="width:189px;">GS311</td>
			<td style="width:224px;">HyStem (Hyaluronic acid-SH and PEGDA)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Hanks Balanced Salt Solution</td>
			<td style="width:148px;">Lonza</td>
			<td style="width:189px;">10-527F</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Heat-inactivated fetal bovine serum</td>
			<td style="width:148px;">Atlanta Biologicals</td>
			<td style="width:189px;">S11150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Hemocytometer</td>
			<td style="width:148px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:189px;">02-671-51B Hausser BrightLine</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Hoechst 33342</td>
			<td style="width:148px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:189px;">H1398</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Image processing software</td>
			<td style="width:148px;">Oxford Instruments</td>
			<td style="width:189px;">Imaris 9.3</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:251px;">LIVE/DEAD Cell Viability/Cytotoxicity Kit (Calcein-AM/Ethidium Homodimer-1)</td>
			<td style="width:148px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:189px;">L3224</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Microfluidic culture plate</td>
			<td style="width:148px;">Mimetas</td>
			<td style="width:189px;">9603-400-B</td>
			<td>2-lane OrganoPlate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Microscope</td>
			<td style="width:148px;">Nikon</td>
			<td style="width:189px;">A1R</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="68">
			<td height="68" style="height:68px;width:251px;">Multichannel pipette</td>
			<td style="width:148px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:189px;">3125000036</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:251px;">PDX-derived tumor tissue</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td style="width:224px;">obtained under IRB approval for human tissue and IACUC approval for animal host</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Penicillin-streptomycin</td>
			<td style="width:148px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:189px;">15140-122</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Perfusion rocker</td>
			<td style="width:148px;">Mimetas</td>
			<td style="width:189px;">OrganoPlate Perfusion Rocker Mini</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">pH strips (pH 5-9)</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td>any suitable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Phosphate-buffered saline solution</td>
			<td style="width:148px;">Lonza</td>
			<td style="width:189px;">17-516F</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Razor blades</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td>any suitable</td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;width:251px;">Rotating xy-shaker</td>
			<td style="width:148px;">VWR</td>
			<td style="width:189px;">Advanced 3500 Orbital Shaker</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Scalpel handle</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td>any suitable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Single channel repeating pipette</td>
			<td style="width:148px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:189px;">22260201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Sterile, 15mL conical centrifuge tubes</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td>any suitable</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Sterile, 50mL conical centrifuge tubes</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td>any suitable</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

enhanced viability for ex vivo 3d hydrogel cultures of patient-derived xenografts in a perfused microfluidic platform

Pasientavledede xenografter (PDX), generert når resected pasient tumorvev er engrafted direkte inn i immunkompromitterte mus, forblir biologisk stabil, og dermed bevare molekylære, genetiske, og histologiske egenskaper, samt heterogenitet av den opprinnelige svulsten. Men å bruke disse modellene til å utføre en rekke eksperimenter, inkludert narkotikascreening, er uoverkommelig både når det gjelder kostnader og tid. Tredimensjonale (3D) kultursystemer er viden sett på som plattformer der kreftceller beholder sin biologiske integritet gjennom biokjemiske interaksjoner, morfologi og arkitektur. Vårt team har lang erfaring med å kultere PDX-celler in vitro ved hjelp av 3D-matriser bestående av hyaluronsyre (HA). For å skille mus fibroblast stromal celler forbundet med PDXs, bruker vi rotasjonskultur, hvor stromale celler holder seg til overflaten av vev kulturbehandlede plater mens dissosierte PDX tumorceller flyter og selv-knyttes til flercellede klynger. Også flytende i supernatant er enkle, ofte døde celler, som presenterer en utfordring i å samle levedyktige PDX klynger for nedstrøms innkapsling i hydrogeler for 3D cellekultur. For å skille disse enkeltcellene fra levende celleklynger, har vi ansatt tetthet trinn gradient sentrifugering. Protokollen som er beskrevet her, gjør det mulig å tømme ikke-levedyktige enkeltceller fra den sunne populasjonen av celleklynger som vil bli brukt til videre in vitro eksperimentering. I våre studier inkorporerer vi 3D-kulturene i mikrofluidiske plater som tillater medieperfusjon under kulturen. Etter å ha vurdert de resulterende kulturene ved hjelp av en fluorescerende bildebasert levedyktighetsanalyse av rensede versus ikke-rensede celler, viser våre resultater at dette ekstra separasjonstrinnet betydelig reduserte antall ikke-levedyktige celler fra våre kulturer.

En programmerbar perfusjonsrocker ble utarbeidet i en standard vann-jacked celle kultur inkubator, og to-lane mikrofluidiske plater ble utarbeidet i en standard biosikkerhet skap for lasting (Figur 1). En MDA-PCA-118b PDX svulst ble utvidet in vivo, høstet når den hadde nådd en maksimal størrelse, og dissosiert som beskrevet i protokoll seksjon 2 for å skape en slurry suspensjon av celler, med omtrent en enkeltcellet tilstand (Figur 2A). Slammet ble dispens...

Watch this Scientific Journal Video about Enhanced Viability for Ex vivo 3D Hydrogel Cultures of Patient-Derived Xenografts in a Perfused Microfluidic Platform at JoVE.com

Enhanced Viability for Ex vivo 3D Hydrogel Cultures of Patient-Derived Xenografts in a Perfused Microfluidic Platform

Denne protokollen demonstrerer metoder for å muliggjøre utvidet in vitro kultur av pasientavledede xenografts (PDX). Ett trinn forbedrer den generelle levedyktigheten til flercellede klyngekulturer i 3D-hydrogeler, gjennom enkel fjerning av ikke-levedyktige enkeltceller. Et sekundært trinn viser beste praksis for PDX-kultur i en perfundert mikrofluidisk plattform.

Forbedret levedyktighet for Ex vivo 3D hydrogelkulturer av pasientavledede Xenografts i en perfused mikrofluidisk plattform

Patient-derived xenografts (PDX), generated when resected patient tumor tissue is engrafted directly into immunocompromised mice, remain biologically ...

Forbedrede kulturmetoder for pasientavledede tumorprøver er kritisk viktige når feltet beveger seg bort fra bruk av konvensjonelle cellelinjer. Denne protokollen muliggjør in vitro kultur av pasientavledede tumorceller i en plattform som er mottagelig for høy gjennomstrømning og høyt innhold screening, i motsetning til in vivo kreftmodeller. Plattformen som omfatter PDXs tillater oss å vurdere mer heterogene systemer som reflekterer innfødte svulster.Dette kan gi innsikt i narkotikamekanismer og tillate raskere narkotikascreening. Metoden kan utvides gjennom inkorporering av stroma, endotel og immunceller. Disse co-kulturer kan være enda mer reflekterende av den innfødte tumor befolkningen og arkitektur.Øv på å laste mikrofluidiske platene med lett utvidede cellelinjer for å bli svært dyktige før du skifter til mer dyrebare celler som PDXs. Justering under plateutdeling påvirker suksess, og en visuell demonstrasjon kan enkelt formidle dette konseptet. For å begynne, overføre tumorvev til en pre-veid steril 50-milliliter konisk rør.Skyll seks ganger med 30 milliliter steril PBS for å fjerne blod og forurensninger. Fjern så mye væske som mulig, og veie tumorvevet. Overfør tumorvevet til en 60 millimeter rund vevskulturrett, og bruk et sterilt barberblad eller en skalpell for å hakke det i en millimeter stykker.Tilsett fem milliliter PDX behandlingsmedium for å samle tumorslamen. Tilsett fem milliliter dissosiasjonsenzymløsning for å samle tumorslamen. Skyll kulturfatet med ytterligere fem milliliter dissosiasjonsenzymoppløsning.Deretter legger du til fem milliliter PDX-behandlingsmedium. Inkuber 20 minutter ved 37 grader Celsius med mild risting. Halvveis gjennom inkubasjonstiden, virvle røret forsiktig.Etter inkubasjon, pipette opp og ned forsiktig med en serologisk pipette for å bryte opp klumper. Plasser en 70-mikron cellesil over et nytt sterilt 50-milliliter rør, og filtrer cellene. Deretter sentrifuge på 1, 200 rpm i to minutter for å pellet cellene.Fjern det overnaturlige og gjenbruk i to til tre milliliter pdx kulturmedium. Telle cellene ved hjelp av en hemocytometer eller automatisert celle teller. Bruk denne tabellen til å beregne det nødvendige antallet tilknyttede PDX-avledede celler som trengs for å oppnå ønsket celletetthet per sjetong.Plate en til to ganger 10 til de seks cellene i fem milliliter av PDX kultur medium per brønn av en seks-brønn vev kultur plate. Inkuber i 48 timer ved 37 grader Celsius, 5% karbondioksid og 95% fuktighet med mild risting ved 50 til 55 rpm for å fremme klyngedannelse. Etter at klyngene har dannet seg, fortsett til sentrifugering.Først forberede 20 milliliter av 100% tetthet gradient løsning ved grundig blande 18 milliliter tetthet gradient sentrifugasjon løsning med to milliliter sterile 10X HBSS i en steril 50-milliliter konisk rør. Fortynn denne 100% oppløsningen med sterile 1X HBSS for å lage 10 milliliter hver på 20% 30% 40% og 55% tetthet gradientløsninger. Legg til tre milliliter med 55% tetthet gradient løsning til bunnen av en 15-milliliter konisk rør.Hold røret i en vinkel, sakte dispensere tre milliliter med 40% tetthet gradient løsning på vinklet side av røret og på toppen av 55%laget. Gjenta med 30% tetthet gradient løsning. Samle deretter supernatanten til PDX-rotasjonskulturer med en fem milliliter serologisk pipette i et rør, skyll plateoverflaten forsiktig.Sentrifuge ved 1, 200 rpm i to minutter til pelletceller. Fjern den overnaturlige, og resuspend cellen pellet i tre milliliter av 20% tetthet gradient løsning. Lag forsiktig 20% tetthetsgradientløsning med celler på toppen av gradienten i 15-milliliter røret.Cap rørene og sentrifuge i en swing-bøtte rotor sentrifuge 30 minutter på fire grader Celsius, 2, 000 ganger G, og null pause. Etter sentrifugering er fraksjoner synlige. Levedyktige PDX-cellekulturer finnes vanligvis i løsningsgrensesnittet for 40 til 55 % tetthetsgradient.Samle to til tre milliliter av hver brøkdel i friske 15-milliliter rør. Tilsett tre til fire volumer sterile 1X HBSS til hver brøk, og inverter for å blande grundig. Sentrifuge ved 1000 ganger G i tre minutter for å pellet cellene.Fjern det overnaturlige. Resuspend cellepellet i en til to milliliter pdx behandlingsmedium. Overfør en liten aliquot mellom 50 til 100 mikroliter til et rør, og legg til et likt volum av dissosiasjonsenzymløsning for redissosiasjon.Vurder cellenummeret i den grupperte cellefjæringen. Telle cellene med et hemocytometer eller automatisert celleteller. Rekonstituer hyaluronsyre hydrogel løsninger i henhold til produsentens instruksjoner.Bruk en flerkanals pipette til å legge til 50 mikroliter HBSS til alle brønner i observasjonsvinduskolonner på en tofelts mikrofluidplate for å opprettholde kulturfuktighet og optimale bildeforhold. Beregn volumet av cellefjæring som trengs for 50 mikroliter hydrogel ved ønsket celletetthet, for eksempel 5000 celler per mikroliter. For såing av en mikrofluidplate, aliquot det beregnede volumet i hver av fire sterile 1,5-milliliter sentrifuge rør.Juster pH-en til HA-tioloppløsningen til åtte med 1 normal natriumhydroksid umiddelbart før bruk. Utfør en testgelasjon ved å blande 40 mikroliter ha thiol med 10 mikroliter PEGdA og overvåke gelasjon over tid. Deretter sentrifugerer cellesuspensjonen aliquots i to minutter ved 200 ganger G og romtemperatur for å pellet cellene.Fjern forsiktig det overnaturlige, og gjenoppusst cellene i 40 mikroliter av HA thiol for et 50-mikroliter endelig volum. Tilsett 10 mikroliter pegda til en aliquot av cellene i HA thiol. Bland godt, og vent ett til tre minutter før du sår mikrofluidisk plate.Fest et tips for å dispensere 1,5 mikroliter til en enkanals gjentatt pipette, og last med cellene i HA hydrogeloppløsning. Husk å holde hydrogen aliquot godt blandet for å sikre jevn cellefordeling. For å så mikrofluidisk plate, juster pipettespissen vinkelrett på bladet mens du forsiktig plasserer spissen i midten av gelinntaket for å sikre kontakt, men ikke noe trykk når du dispenserer 1,5 mikroliter hydrogeloppløsning.Vær oppmerksom på fyllstatusen til mikrofluidiske kanaler ved å se fra toppen av platen, bunnen av platen eller ved mikroskop. Vurder lasting ved hjelp av dette tallet som en veiledning. Ett minutt etter lasting, inverter platen mens du forbereder deg til neste aliquot.Gjenta såingen av mikrofluidplate for de resterende tre aliquots av celler i HA-løsning. Etter at alle chips er fylt, inkuber platen ved 37 grader Celsius i en fuktet inkubator 45 minutter til gelasjonen er fullført. Deretter, ved hjelp av den medfølgende håndboken, må du sørge for at perfusjonsrockeren er installert i cellekulturinkubatoren med riktig overflodsinnstilling i 14-graders vinkel og fire minutters intervaller.Tilsett 50 mikroliter PDX cellekulturmedium til alle mellomstore viker. Bank platen forsiktig mot en overflate for å oppmuntre væsken til å fylle mikrofluidiske kanaler. Vend deretter platen for å sjekke om kanalene er fylt riktig.Legg til 50 mikroliter DMEM/F-12 for alle medier. Hvis noen luftbobler er fanget i perfusjonskanalen, fjern ved forsiktig tapping av platen mot en overflate. Ved hjelp av et mikroskop og plate layout skjema, registrere chip fylling suksess.Ekskluder feil fylte sjetonger fra videre eksperimentell bruk. Plasser platen på en vippende vippesett til en 14-graders vippe og en fire minutters syklus for å begynne perfusjon. Annenhver dag erstatter du PDX-kulturmediet, de første 50 mikroliterene i viker, deretter 50 mikroliter i utsalgsstedene.I denne studien ble en programmerbar perfusjonsrocker installert i en standard vannjakkecellekulturinkubator, og tofelts mikrofluidiske blader ble utarbeidet i et standard biosikkerhetsskap for lasting. 3D mikrofluidisk PDX-kultur levedyktighet og morfologi ble evaluert i både uforurensede og tetthet-gradient sentrifugasjonsseparerte forhold. På dag én viste de kulturene som gjennomgikk separasjonsmetoden tidoblet færre enslige døde celler sammenlignet med uforberedte kulturer.Viktigere, de separerte klyngene besto hovedsakelig av levende celler. Ingen statistisk signifikant forskjell ble identifisert for klyngestørrelsesfordelingen. Kulturer ble videre opprettholdt i mikrofluidisk plate i syv dager.Det totale antallet levende celler forble konsistente, og klynger beholdt omtrent 80% levedyktighet over kulturens levetid. Husk at hver PDX-linje er unik, så hvor enkelt tumorfordøyelsen, fenotypisk størrelse og morfologi av klynger, og klyngens plassering innenfor gradientrensingen vil variere. PDX-kulturer etablert ved hjelp av denne metoden kan analyseres med bilde- eller plateleserbaserte levedyktighetsanalyser, faste og immunofluorescently merket, eller dissosiert for å samle cellelysater for andre protokoller.Metoden vil tillate forskere å rekapulere tumormikromiljøet for å utforske biologi eller legemiddelrespons av tumorceller. Brukere bør fullføre standard humane trening og blodbårne patogener trening før du arbeider med menneske-avledet vev. Egnet personlig verneutstyr bør brukes.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Labeling of Breast Cancer Patient-derived Xenografts with Traceable Reporters for Tumor Growth and Metastasis Studies

Merking av brystkreftpasient-avledet xenografter med Spor Reporters for tumorvekst og metastase Studier

The use of preclinical models to study tumor biology and response to treatment is central to cancer research. Long-established human cell lines, and many ...

Isolation and Characterization of Tumor-initiating Cells from Sarcoma Patient-derived Xenografts

Isolering og karakterisering av tumor-initiere celler fra sarkom pasient-avledet Xenotransplantater

The existence and importance of tumor-initiating cells (TICs) have been supported by increasing evidence during the past decade. These TICs have been ...

Fluorescence Molecular Tomography for In Vivo Imaging of Glioblastoma Xenografts

Fluorescence Molecular Tomography for In Vivo Imaging of Glioblastoma Xenografts

Fluorescens molekylær tomografi ved i Vivo avbildning av glioblastom Xenografts

Tumorigenicity is the capability of cancer cells to form a tumor mass. A widely used approach to determine if the cells are tumorigenic is by injecting ...

Patient-derived Heterogeneous Xenograft Model of Pancreatic Cancer Using Zebrafish Larvae as Hosts for Comparative Drug Assessment

Pasient-avledet heterogen Xenograft modell av bukspyttkjertelen Cancer bruke sebrafisk larver som verter for sammenlignende Drug Assessment

Patient-derived tumor xenograft (PDX) and cell-derived tumor xenograft (CDX) are important techniques for preclinical assessment, medication guidance and ...

Physiologic Patient Derived 3D Spheroids for Anti-neoplastic Drug Screening to Target Cancer Stem Cells

Fysiologiske pasient avledet 3D Spheroids for anti-neoplastic Drug screening å målrette Cancer stamceller

In this protocol, we outline the procedure for generation of tumor spheroids within 384-well hanging droplets to allow for high-throughput screening of ...

Assessing Cell Viability and Death in 3D Spheroid Cultures of Cancer Cells

Vurdering Cell levedyktighet og død i 3D spheroid kulturer av kreftceller

Three-dimensional spheroids of cancer cells are important tools for both cancer drug screens and for gaining mechanistic insight into cancer cell biology. ...

Establishment of Gastric Cancer Patient-derived Xenograft Models and Primary Cell Lines

Etablering av magekreft pasient-avledet Xenograft modeller og primær celle Lines

The use of preclinical models to advance our understanding of tumor biology and investigate the efficacy of therapeutic agents is key to cancer research. ...

Testing Targeted Therapies in Cancer using Structural DNA Alteration Analysis and Patient-Derived Xenografts

Testing av målrettede behandlinger mot kreft ved hjelp av strukturell DNA-endringsanalyse og pasientavledede Xenografts

We present here an integrative approach for testing efficacy of targeted therapies that combines the next generation sequencing technolo-gies, therapeutic ...

Drug Screening of Primary Patient Derived Tumor Xenografts in Zebrafish

Narkotikascreening av primær pasient avledet tumor xenografts i sebrafisk

Patient derived xenograft models are critical in defining how different cancers respond to drug treatment in an in vivo system. Mouse models are the ...

Patient-Derived Tumor Explants As a "Live" Preclinical Platform for Predicting Drug Resistance in Patients

Pasientavledede tumor utviser som en "levende" preklinisk plattform for å forutsi legemiddelresistens hos pasienter

An understanding of drug resistance and the development of novel strategies to sensitize highly resistant cancers rely on the availability of suitable ...