Name: enhanced viability for ex vivo 3d hydrogel cultures of patient-derived xenografts in a perfused microfluidic platform
Uploaded: 2020-12-05T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Enhanced Viability for Ex vivo 3D Hydrogel Cultures of Patient-Derived Xenografts in a Perfused Microfluidic Platform at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado pelos Institutos Nacionais de Saúde National Cancer Institute Fase I (HHSN26120700015C) e P01CA098912.

O tecido tumoral foi obtido com o consentimento do paciente e de acordo com um protocolo aprovado do Conselho de Revisão Institucional (IRB). Os xenoenxertos foram implantados, cultivados e colhidos de acordo com um protocolo aceito do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC).
NOTA: Todo o trabalho deve ser realizado em um armário de segurança biológica estéril para manter a esterilidade. Todas as etapas devem ser conduzidas à temperatura ambiente, a menos que seja espe...

<ol>
	<li>Jung, J., Seol, H. S., Chang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Generation+and+Application+of+Patient-Derived+Xenograft+Model+for+Cancer+Research.">The Generation and Application of Patient-Derived Xenograft Model for Cancer Research.</a> Cancer Research and Treatment: Official Journal of Korean Cancer Association. 50 (1), 1-10 (2018).</li><li>Malaney, P., Nicosia, S. V., Dave, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One+mouse,+one+patient+paradigm:+New+avatars+of+personalized+cancer+therapy.">One mouse, one patient paradigm: New avatars of personalized cancer therapy.</a> Cancer Letters. 344 (1), 1-12 (2014).</li><li>Meehan, T. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PDX-MI:+Minimal+Information+for+Patient-Derived+Tumor+Xenograft+Models.">PDX-MI: Minimal Information for Patient-Derived Tumor Xenograft Models.</a> Cancer Research. 77 (21), 62-66 (2017).</li><li>Fong, E. L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogel-Based+3D+Model+of+Patient-Derived+Prostate+Xenograft+Tumors+Suitable+for+Drug+Screening.">Hydrogel-Based 3D Model of Patient-Derived Prostate Xenograft Tumors Suitable for Drug Screening.</a> Molecular Pharmaceutics. 11 (7), 2040-2050 (2014).</li><li>Fong, E. L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+3D+in+vitro+model+of+patient-derived+prostate+cancer+xenograft+for+controlled+interrogation+of+in+vivo+tumor-stromal+interactions.">A 3D in vitro model of patient-derived prostate cancer xenograft for controlled interrogation of in vivo tumor-stromal interactions.</a> Biomaterials. 77, 164-172 (2016).</li><li>Engel, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyaluronic+Acid-Based+Hydrogel+Formulations+Suitable+for+Automated+3D+High+Throughput+Drug+Screening+of+Cancer-Stromal+Cell+Cocultures.">Hyaluronic Acid-Based Hydrogel Formulations Suitable for Automated 3D High Throughput Drug Screening of Cancer-Stromal Cell Cocultures.</a> Advanced Healthcare Materials. 4 (11), 1664-1674 (2015).</li><li>Lanz, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapy+response+testing+of+breast+cancer+in+a+3D+high-throughput+perfused+microfluidic+platform.">Therapy response testing of breast cancer in a 3D high-throughput perfused microfluidic platform.</a> BMC Cancer. 17 (1), 709 (2017).</li><li>Wevers, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+compound+evaluation+on+3D+networks+of+neurons+and+glia+in+a+microfluidic+platform.">High-throughput compound evaluation on 3D networks of neurons and glia in a microfluidic platform.</a> Scientific Reports. 6, 38856 (2016).</li><li>Vulto, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phaseguides:+a+paradigm+shift+in+microfluidic+priming+and+emptying.">Phaseguides: a paradigm shift in microfluidic priming and emptying.</a> Lab on a Chip. 11 (9), 1596-1602 (2011).</li><li>Patru, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD133,+CD15/SSEA-1,+CD34+or+side+populations+do+not+resume+tumor-initiating+properties+of+long-term+cultured+cancer+stem+cells+from+human+malignant+glio-neuronal+tumors.">CD133, CD15/SSEA-1, CD34 or side populations do not resume tumor-initiating properties of long-term cultured cancer stem cells from human malignant glio-neuronal tumors.</a> BMC Cancer. 10, 66 (2010).</li><li>Harma, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+panel+of+three-dimensional+models+for+studies+of+prostate+cancer+growth,+invasion+and+drug+responses.">A comprehensive panel of three-dimensional models for studies of prostate cancer growth, invasion and drug responses.</a> PLoS One. 5 (5), 10431 (2010).</li></ol>

Aqui descrevemos um método para processar e cultivar células tumorais viáveis derivadas de PDX em um sistema de cultura 3D de alta produtividade e perfundido. Embora este protocolo utilize tecido PDX PCa, é igualmente eficaz para outros tumores derivados da epitelial. As características tumorais variam entre linhas PDX individuais mesmo dentro do mesmo tecido de origem (próstata, mama, etc.). Algumas linhas PDX são mais fibrosas e difíceis de isolar células viáveis, enquanto outras são mais celulares. O tamanh...

Na última década, o campo da pesquisa sobre o câncer demonstrou um entusiasmo renovado pelos xenoenxertos derivados do paciente (PDXs) como uma ferramenta para avaliar a dependência da via celular do câncer e a suscetibilidade de medicamentos1. Os modelos PDX mais comuns são estabelecidos pela implantação subcutânea ou ortotópica de células tumorais humanas — um fragmento de tumor, um conjunto de células derivadas de tumor dissociados ou uma amostra de células tumorais circulantes isoladas (CTCs) — em um hospedeiro de roedores. Se o tumor "tomar" for bem sucedido, as células de xenoenxerto se proliferarão, vascularizarão e interagirão com o tecido hospedeiro para criar um tumor, que pode ser colhido em um tamanho ideal, subdividido e reimplantado em outros hospedeiros. Entre suas muitas vantagens como sistema modelo, os PDXs normalmente retêm uma parcela substancial da heterogeneidade da população de células tumorais nativas e permitem a avaliação de vias específicas humanas e respostas celulares2,,3. O contexto in vivo permite a interação tumoral com vasculatura e outros estroma adjacentes e recapitula características teciduais, como dinâmica de difusão de drogas, tensão de oxigênio e influência de matriz extracelular que impacta biologicamente e mecanicamente a progressão do tumor. Um aspecto negativo dos PDXs é sua dependência de um hospedeiro roedor, tanto para expansão do tumor quanto, em última instância, para testes de hipóteses. Como muitos PDXs não conseguem se adaptar à cultura bidimensional tradicional (2D) no poliestireno da cultura tecidual sem perder muitas de suas características desejáveis, houve um meio termo mínimo para os pesquisadores entre este método in vitro relativamente controlado, e o aumento significativo dos requisitos de despesas, instalações e tempo para o uso in vivo do PDX.
Descrevemos vários modelos in vitro que implementam a cultura celular 3D dentro de uma matriz de apoio, e recentemente expandimos esse trabalho para demonstrar a cultura ex vivo de PDXs derivados de múltiplos câncer de próstata (PDXs) derivados, tanto sozinhos quanto em co-cultura com fibroblastos derivados da medula óssea4,,5. As matrizes de hidrogel baseadas em ácido hialurônico (HA) fornecem suporte personalizável e biologicamente relevante para ambos os tipos de células, com controle fácil sobre características de hidrogel e clareza óptica para imagem através da profundidade do hidrogel6.
Os tecidos tumorais PDX maduros compreendem uma mistura variável de células cancerígenas humanas heterogêneas e estroma de camundongos (fibroblastos, células endoteliais, etc.). Para estudar contribuições específicas do tipo celular para a progressão do tumor in vitro, pode ser vantajoso para dissociar tumores, separar as populações celulares e incorporá-los experimentalmente de forma organizada para dissecar caminhos da comunicação intercelular. As populações de células mistas dentro dos digestados teciduais têm compatibilidade diferencial com condições específicas de cultura. Por exemplo, a viabilidade do fibroblasto associado ao tumor requer a adesão à superfície ou matrizes 3D funcionalizadas com ligantes integrin, enquanto as células PDX derivadas da epitelial não costumam ter esses requisitos, em vez de favorecer interações célula-células. Essas diferenças podem ser exploradas para alcançar a separação efetiva das células PDX da contaminação das células estromais do rato. A cultura de rotação dos digestatos teciduais permite a adesão das células estrois à superfície da cultura tecidual, enquanto as aderências das células celulares impulsionam as células PDX flutuando acima da superfície da cultura rotativa para formar aglomerados multicelulares no supernante em 24-48 h. As características específicas desses clusters variam com o PDX (por exemplo, grandes, apertados, altamente esféricos ou agregados menores e mais soltos que se assemelham a cachos de uvas), mas são tipicamente de tamanhos biologicamente relevantes (50-250 μm de diâmetro), suficientes para avaliar interações celulares que dependem de contatos intercelulares.
A recuperação e o processamento do tumor inevitavelmente resultam em algum grau de morte celular colateral, seja devido a danos a curto prazo causados por interrupção mecânica/enzimática, ou incompatibilidade a longo prazo das subpopulações com as condições de cultura escolhidas. Apesar da utilidade da cultura de rotação como uma separação em massa inicial, células mortas ou moribundas são inevitavelmente transferidas com os clusters PDX e podem influenciar a cultura resultante. Essas células mortas são muitas vezes células PDX individuais que não foram integradas em um aglomerado, fibroblastos estromamais de camundongos que não podem sobreviver em condições de cultura selecionadas, ou células endoteliais particularmente frágeis. Essas células moribundas podem influenciar resultados experimentais de "sobreviventes" e podem impactar substancialmente a quantificação, por exemplo, através de ensaios de triagem de viabilidade fluorescentes baseados em imagem. Para melhorar a seleção de células PDX vivas a partir deste método, adaptamos métodos de centrifugação com passos de densidade para remover facilmente células mortas/moribundas individuais de misturas PDX e reter aglomerados multicelulares predominantemente vivos.
Para aprimorar o estudo de clusters derivados do PDX resultantes na cultura 3D, utilizamos uma plataforma de cultura de perfusão baseada em microfluidos, a OrganoPlate (Figura 1), que é uma plataforma de órgão-sobre-chip de alta produtividade que permite uma cultura simultânea de até 96 culturas 3D perfumadas e individuais em uma base de placas de microtiter de 384 poços(Figura 1A)7,,8. Na placa microfluida de 2 pistas, um único chip de tecido é conectado por dois canais microfluidos (Figura 1B, canal de gel: vermelho, canal de perfusão: azul) que abrangem quatro poços seguidos. Os dois canais microfluidos são separados por uma pequena crista de plástico chamada Phaseguide que impede o transbordamento de um canal em seu canal vizinho adjacente, e simultaneamente permite uma interface livre de membrana entre o conteúdo do gel e do canal de perfusão9. Como a parte inferior da placa microfluiida é composta de vidro de microscópio, as culturas podem ser vistas na janela de observação através da parte inferior da placa com um microscópio padrão ou automatizado. A perfusão é estabelecida na placa microfluida com um roqueiro programável, utilizando gravidade para conduzir a mídia através dos canais microfluidos, entre poços de reservatórios(Figura 1C). A imitação do fluxo de perfusão recapitula mais de perto o microambiente tumoral do que a cultura estática, permitindo a incorporação do estresse da cisalhamento e maior distribuição de gases e nutrientes. Os benefícios da manutenção de uma cultura de células cancerígenas perfumadas na placa microfluida foram descritos anteriormente como culturas de câncer de mama perfundidas apresentaram viabilidade ideal em comparação com uma cultura estática 3D das mesmas células7.
O presente relatório descreve um método de centrifugação de gradiente de densidade adaptada para isolar clusters PDX multicelulares vivos e demonstra sua utilidade no estabelecimento de culturas PDX 3D dentro de placas microfluidas perfusíveis. Como um número crescente de laboratórios de pesquisa está buscando métodos para facilitar o uso do PDX, prevemos que os protocolos aqui apresentados serão de utilidade imediata.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:812px;" width="812">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">1N NaOH</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td style="width:224px;">any suitable tissue culture grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">60 mm round tissue culture dishes</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td>any suitable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">6-well tissue culture plates</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td>any suitable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">70 &#181;m cell strainers</td>
			<td style="width:148px;">Corning</td>
			<td style="width:189px;">431751</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:251px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:148px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:189px;">5810R with suitable rotor and buckets for 15/50 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Density gradient centrifugation solution</td>
			<td style="width:148px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:189px;">P1644</td>
			<td>Percoll</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Dimethylsulfoxide</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td>any suitable tissue culture grade</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Dissociation enzyme solution</td>
			<td style="width:148px;">StemCell Technologies</td>
			<td style="width:189px;">07921</td>
			<td style="width:224px;">ACCUMAX</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">DMEM-F12</td>
			<td style="width:148px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:189px;">11039021</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Forceps</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td>any suitable</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">HA hydrogel kit</td>
			<td style="width:148px;">ESI BIO</td>
			<td style="width:189px;">GS311</td>
			<td style="width:224px;">HyStem (Hyaluronic acid-SH and PEGDA)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Hanks Balanced Salt Solution</td>
			<td style="width:148px;">Lonza</td>
			<td style="width:189px;">10-527F</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Heat-inactivated fetal bovine serum</td>
			<td style="width:148px;">Atlanta Biologicals</td>
			<td style="width:189px;">S11150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Hemocytometer</td>
			<td style="width:148px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:189px;">02-671-51B Hausser BrightLine</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Hoechst 33342</td>
			<td style="width:148px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:189px;">H1398</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Image processing software</td>
			<td style="width:148px;">Oxford Instruments</td>
			<td style="width:189px;">Imaris 9.3</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:251px;">LIVE/DEAD Cell Viability/Cytotoxicity Kit (Calcein-AM/Ethidium Homodimer-1)</td>
			<td style="width:148px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:189px;">L3224</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Microfluidic culture plate</td>
			<td style="width:148px;">Mimetas</td>
			<td style="width:189px;">9603-400-B</td>
			<td>2-lane OrganoPlate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Microscope</td>
			<td style="width:148px;">Nikon</td>
			<td style="width:189px;">A1R</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="68">
			<td height="68" style="height:68px;width:251px;">Multichannel pipette</td>
			<td style="width:148px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:189px;">3125000036</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:251px;">PDX-derived tumor tissue</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td style="width:224px;">obtained under IRB approval for human tissue and IACUC approval for animal host</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Penicillin-streptomycin</td>
			<td style="width:148px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:189px;">15140-122</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Perfusion rocker</td>
			<td style="width:148px;">Mimetas</td>
			<td style="width:189px;">OrganoPlate Perfusion Rocker Mini</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">pH strips (pH 5-9)</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td>any suitable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Phosphate-buffered saline solution</td>
			<td style="width:148px;">Lonza</td>
			<td style="width:189px;">17-516F</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Razor blades</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td>any suitable</td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;width:251px;">Rotating xy-shaker</td>
			<td style="width:148px;">VWR</td>
			<td style="width:189px;">Advanced 3500 Orbital Shaker</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Scalpel handle</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td>any suitable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Single channel repeating pipette</td>
			<td style="width:148px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:189px;">22260201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Sterile, 15mL conical centrifuge tubes</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td>any suitable</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Sterile, 50mL conical centrifuge tubes</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td>any suitable</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

enhanced viability for ex vivo 3d hydrogel cultures of patient-derived xenografts in a perfused microfluidic platform

Os xenoenxertos derivados do paciente (PDX), gerados quando ressecados do tecido tumoral do paciente são grafados diretamente em camundongos imunocomprometidos, permanecem biologicamente estáveis, preservando características moleculares, genéticas e histológicas, bem como a heterogeneidade do tumor original. No entanto, usar esses modelos para realizar uma infinidade de experimentos, incluindo a triagem de medicamentos, é proibitivo tanto em termos de custo quanto de tempo. Sistemas de cultura tridimensional (3D) são amplamente vistos como plataformas nas quais as células cancerígenas retêm sua integridade biológica através de interações bioquímicas, morfologia e arquitetura. Nossa equipe tem ampla experiência em cultivo de células PDX in vitro usando matrizes 3D compostas de ácido hialurônico (HA). A fim de separar as células estromais do fibroblasto do camundongo associadas aos PDXs, usamos cultura de rotação, onde células estromais aderem à superfície das placas tratadas pela cultura tecidual enquanto células tumorais PDX dissociadas flutuam e se associam a aglomerados multicelulares. Também flutuando no supernante estão células solteiras, muitas vezes mortas, que representam um desafio na coleta de agrupamentos PDX viáveis para encapsulamento a jusante em hidrogéis para cultura celular 3D. Para separar essas células únicas de aglomerados de células vivas, empregamos centrifugação gradiente de passo de densidade. O protocolo aqui descrito permite o esgotamento de células únicas não viáveis da população saudável de aglomerados celulares que serão usados para mais experimentações in vitro. Em nossos estudos, incorporamos as culturas 3D em placas microfluidas que permitem a perfusão da mídia durante a cultura. Depois de avaliar as culturas resultantes usando um ensaio de viabilidade baseado em imagem fluorescente de células purificadas versus não purificadas, nossos resultados mostram que essa etapa de separação adicional reduziu substancialmente o número de células não viáveis de nossas culturas.

Um roqueiro de perfusão programável foi preparado em uma incubadora padrão de cultura celular tomada pela água, e placas microfluídicas de duas pistas foram preparadas em um armário padrão de biossegurança para carregamento(Figura 1). Um tumor PDX MDA-PCA-118b foi expandido in vivo, colhido quando atingiu um tamanho máximo, e dissociado como descrito no protocolo seção 2 para criar uma suspensão de chorume de células, aproximadamente em um estado de célula única<strong class="...

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Enhanced Viability for Ex vivo 3D Hydrogel Cultures of Patient-Derived Xenografts in a Perfused Microfluidic Platform

Este protocolo demonstra métodos para permitir a cultura in vitro estendida de xenoenxertos derivados do paciente (PDX). Um passo aumenta a viabilidade geral das culturas de cluster multicelulares em hidrogéis 3D, através da remoção direta de células únicas não viáveis. Um passo secundário demonstra as melhores práticas para a cultura PDX em uma plataforma microfluida perfumada.

Viabilidade aprimorada para culturas de hidrogel 3D Ex vivo de xenoenxertos derivados do paciente em uma plataforma microfluida perfusada

Patient-derived xenografts (PDX), generated when resected patient tumor tissue is engrafted directly into immunocompromised mice, remain biologically ...

Métodos de cultura aprimorados para amostras de tumores derivados do paciente são criticamente importantes à medida que o campo se afasta do uso de linhas celulares convencionais. Este protocolo permite a cultura in vitro de células tumorais derivadas do paciente em uma plataforma que é favorável a alta produtividade e rastreamento de alto teor de conteúdo, ao contrário dos modelos de câncer in vivo. A plataforma que incorpora PDXs nos permite avaliar sistemas mais heterogêneos que refletem tumores nativos.Isso pode produzir uma visão dos mecanismos de drogas e permitir uma triagem mais rápida de drogas. O método poderia ser expandido através da incorporação de estroma, endotélio e células imunes. Essas co-culturas poderiam ser ainda mais reflexivas da população e arquitetura de tumores nativos.Pratique carregar as placas microfluidas com linhas celulares facilmente expandidas para se tornar altamente proficiente antes de mudar para células mais preciosas como PDXs. O alinhamento durante a distribuição de placas impacta muito o sucesso, e uma demonstração visual pode facilmente transmitir esse conceito. Para começar, transfira tecido tumoral para um tubo cônico pré-pesado de 50 mililitros.Enxágüe seis vezes com 30 mililitros de PBS estéreis para remover sangue e contaminantes. Remova o máximo de líquido possível e pese o tecido tumoral. Transfira o tecido tumoral para um prato de cultura de tecido redondo de 60 milímetros, e use uma lâmina de barbear estéril ou um bisturi para pica-lo em pedaços de um milímetro.Adicione cinco mililitros de meio de processamento PDX para coletar o chorume tumoral. Adicione cinco mililitros de solução de enzima dissociação para coletar o chorume tumoral. Enxágüe o prato de cultura com mais cinco mililitros de solução de enzima dissociação.Em seguida, adicione cinco mililitros de meio de processamento PDX. Incubar 20 minutos a 37 graus Celsius com agitação suave. No meio do tempo de incubação, gire o tubo suavemente.Após a incubação, pipeta para cima e para baixo suavemente com uma pipeta sorológica para quebrar aglomerados. Coloque um coador de células de 70 mícrons sobre um novo tubo estéril de 50 mililitros e filtre as células. Em seguida, centrífuga a 1.200 rpm por dois minutos para pelotar as células.Remova o supernatante e resuspend em dois a três mililitros de meio de cultura PDX. Conte as células usando um hemócitometro ou contador de células automatizada. Use esta tabela para estimar o número necessário das células derivadas do PDX associadas necessárias para alcançar a densidade celular desejada por chip.Placa de uma a duas vezes 10 para as seis células em cinco mililitros de cultura PDX médio por poço de uma placa de cultura de tecido de seis poços. Incubar por 48 horas a 37 graus Celsius, 5% de dióxido de carbono e 95% de umidade com agitação suave de 50 a 55 rpm para promover a formação de aglomerados. Depois que os clusters se formarem, prossiga para a centrifugação.Primeiro prepare 20 mililitros de solução de gradiente de 100% de densidade misturando completamente 18 mililitros de solução de centrifugação de gradiente de densidade com dois mililitros de HBSS 10X estéril em um tubo cônico estéril de 50 mililitros. Diluir esta solução 100% com HBSS 1X estéril para fazer 10 mililitros cada um de 20%30%40% e 55% de soluções gradientes de densidade. Adicione três mililitros de solução gradiente de densidade de 55% ao fundo de um tubo cônico de 15 mililitros.Segurando o tubo em um ângulo, dispense lentamente três mililitros de solução de gradiente de densidade de 40% para o lado angular do tubo e em cima da camada de 55%. Repita com a solução de gradiente de densidade de 30%. Em seguida, colete o supernatante das culturas de rotação PDX com uma pipeta sorológica de cinco mililitros em um tubo, enxaguando a superfície da placa suavemente.Centrifugar a 1.200 rpm por dois minutos para as células de pelota. Remova o supernasciente e resuspense a pelota da célula em três mililitros de solução gradiente de densidade de 20%. Coloque cuidadosamente a solução gradiente de 20% de densidade com células na parte superior do gradiente no tubo de 15 mililitros.Tampe os tubos e centrífuga em uma centrífuga de rotor de balde de balanço 30 minutos a quatro graus Celsius, 2.000 vezes G, e zero break. Após a centrifugação, frações são visíveis. Culturas viáveis de células PDX são tipicamente encontradas na interface de solução de gradiente de densidade de 40 a 55%.Colete de dois a três mililitros de cada fração em tubos frescos de 15 mililitros. Adicione de três a quatro volumes de HBSS 1X estéreis a cada fração e inverta para misturar bem. Centrifugar a 1.000 vezes G por três minutos para pelotar as células.Remova o supernatante. Resuspenda a pelota de célula em um a dois mililitros de meio de processamento PDX. Transfira uma pequena alíquota entre 50 a 100 microliters em um tubo e adicione um volume igual de solução de enzima dissociação para redissociação.Avalie o número da célula na suspensão da célula agrupada. Conte as células com um hemócitometro ou contador de células automatizada. Reconstituir soluções de hidrogel de ácido hialurônico de acordo com as instruções do fabricante.Usando uma pipeta multicanal, adicione 50 microliters de HBSS a todos os poços em colunas de janelas de observação de uma placa microfluidic de duas pistas para manter a umidade da cultura e condições ideais de imagem. Calcule o volume de suspensão celular necessário para 50 microliters de hidrogel na densidade celular desejada, por exemplo, 5.000 células por microliter. Para semear uma placa microfluida, aliquot o volume calculado em cada um dos quatro tubos de centrífuga de 1,5 mililitros estéreis.Ajuste o pH da solução de thiol HA para oito com 1 hidróxido de sódio normal imediatamente antes de ser usado. Realize uma gelação de teste misturando 40 microliters de ha thiol com 10 microliters de PEGdA e monitorando a gelação ao longo do tempo. Em seguida, centrifugar as alíquotas de suspensão celular por dois minutos a 200 vezes G e temperatura ambiente para pelotar as células.Remova cuidadosamente o supernascer e resuspenja as células em 40 microliters de ha thiol para um volume final de 50 microliteres. Adicione 10 microliters de PEGdA a uma alíquota das células de ha thiol. Misture bem, e espere de um a três minutos antes de semear a placa microfluida.Afixe uma dica para distribuir 1,5 microliters a uma pipeta repetindo um único canal e carregue com as células na solução de hidrogel HA. Lembre-se de manter a alíquota de hidrogênio bem misturada para garantir a distribuição uniforme da célula. Para semear a placa microfluida, alinhe a ponta da pipeta perpendicular à lâmina enquanto coloque suavemente a ponta no centro da entrada de gel para garantir o contato, mas sem pressão ao dispensar 1,5 microliters da solução de hidrogel.Observe o estado de preenchimento dos canais microfluidos visualizando a partir da parte superior da placa, parte inferior da placa ou por microscópio. Avalie o carregamento usando esta figura como guia. Um minuto após o carregamento, inverta a placa enquanto se prepara para a próxima alíquota.Repita a semeadura da placa microfluida para as três alíquotas restantes das células na solução HA. Depois que todos os chips forem preenchidos, incubar a placa a 37 graus Celsius em uma incubadora umidificada 45 minutos até que a gelação esteja completa. Depois disso, utilizando o manual fornecido, certifique-se de que o roqueiro de perfusão esteja instalado na incubadora de cultura celular com a configuração correta de profusão em ângulo de 14 graus e intervalos de quatro minutos.Adicione 50 microliters de cultura celular PDX ao meio de todas as entradas médias. Bata suavemente a placa contra uma superfície para incentivar o líquido a preencher os canais microfluidos. Em seguida, gire a placa para verificar se os canais estão preenchidos corretamente.Adicione 50 microliters de DMEM/F-12 para todos os meios de comunicação. Se alguma bolha de ar estiver presa no canal de perfusão, remova por toques suaves da placa contra uma superfície. Usando um microscópio e um formulário de layout de placa, registo o sucesso do preenchimento do chip.Exclua os chips mal preenchidos de uso experimental posterior. Coloque a placa em um roqueiro inclinado definido para uma inclinação de 14 graus e um ciclo de quatro minutos para começar a perfusão. A cada dois dias, substitua o meio de cultura PDX, primeiro 50 microliters nas entradas, depois 50 microliters nas tomadas.Neste estudo, um roqueiro de perfusão programável foi instalado em uma incubadora padrão de cultura celular com capa d'água, e lâminas microfluídicas de duas pistas foram preparadas em um armário padrão de biossegurança para carregamento. A viabilidade e a morfologia da cultura PDX microfluídica 3D foram avaliadas em condições separadas de centrifugação de centrífugas não paraxidas e gradientes de densidade. No primeiro dia, as culturas submetidas ao método de separação apresentaram dez vezes menos células mortas em comparação com culturas não paradas.É importante ressaltar que os aglomerados separados consistiam principalmente de células vivas. Não foi identificada diferença estatisticamente significativa para a distribuição do tamanho do cluster. As culturas foram mantidas na placa microfluida por sete dias.O número total de células vivas permaneceu consistente, e os clusters mantiveram aproximadamente 80% de viabilidade ao longo da vida da cultura. Lembre-se que cada linha PDX é única, de modo que a facilidade de digestão do tumor, o tamanho fenotípico e a morfologia dos clusters, e a localização do cluster dentro da purificação do gradiente variam. As culturas PDX estabelecidas usando este método podem ser avaliadas com ensaios de viabilidade baseados em imagem ou leitor de placas, rotulados fixos e imunofluorescentamente, ou dissociados para coletar lises celulares para outros protocolos.O método permitirá que os pesquisadores recapitulem o microambiente tumoral, a fim de explorar a biologia ou a resposta medicamentosa das células tumorais. Os usuários devem completar o treinamento padrão de indivíduos humanos e o treinamento de patógenos transmitidos pelo sangue antes de trabalhar com tecidos derivados do homem. Equipamentos de proteção individual apropriados devem ser usados.

Research

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