Name: enhanced viability for ex vivo 3d hydrogel cultures of patient-derived xenografts in a perfused microfluidic platform
Uploaded: 2020-12-05T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Enhanced Viability for Ex vivo 3D Hydrogel Cultures of Patient-Derived Xenografts in a Perfused Microfluidic Platform at JoVE.com

Эта работа была поддержана Национальными институтами здравоохранения Национального института рака SBIR Фаза I (HHSN26120700015C) и P01CA098912.

Опухолевая ткань была получена с согласия пациента и в соответствии с утвержденным протоколом Институционального совета по обзору (IRB). Ксенотрансплантаты были имплантированы, выращены и собраны в соответствии с принятым институциональным комитетом по уходу за животными и использова...

<ol>
	<li>Jung, J., Seol, H. S., Chang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Generation+and+Application+of+Patient-Derived+Xenograft+Model+for+Cancer+Research.">The Generation and Application of Patient-Derived Xenograft Model for Cancer Research.</a> Cancer Research and Treatment: Official Journal of Korean Cancer Association. 50 (1), 1-10 (2018).</li><li>Malaney, P., Nicosia, S. V., Dave, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One+mouse,+one+patient+paradigm:+New+avatars+of+personalized+cancer+therapy.">One mouse, one patient paradigm: New avatars of personalized cancer therapy.</a> Cancer Letters. 344 (1), 1-12 (2014).</li><li>Meehan, T. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PDX-MI:+Minimal+Information+for+Patient-Derived+Tumor+Xenograft+Models.">PDX-MI: Minimal Information for Patient-Derived Tumor Xenograft Models.</a> Cancer Research. 77 (21), 62-66 (2017).</li><li>Fong, E. L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogel-Based+3D+Model+of+Patient-Derived+Prostate+Xenograft+Tumors+Suitable+for+Drug+Screening.">Hydrogel-Based 3D Model of Patient-Derived Prostate Xenograft Tumors Suitable for Drug Screening.</a> Molecular Pharmaceutics. 11 (7), 2040-2050 (2014).</li><li>Fong, E. L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+3D+in+vitro+model+of+patient-derived+prostate+cancer+xenograft+for+controlled+interrogation+of+in+vivo+tumor-stromal+interactions.">A 3D in vitro model of patient-derived prostate cancer xenograft for controlled interrogation of in vivo tumor-stromal interactions.</a> Biomaterials. 77, 164-172 (2016).</li><li>Engel, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyaluronic+Acid-Based+Hydrogel+Formulations+Suitable+for+Automated+3D+High+Throughput+Drug+Screening+of+Cancer-Stromal+Cell+Cocultures.">Hyaluronic Acid-Based Hydrogel Formulations Suitable for Automated 3D High Throughput Drug Screening of Cancer-Stromal Cell Cocultures.</a> Advanced Healthcare Materials. 4 (11), 1664-1674 (2015).</li><li>Lanz, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapy+response+testing+of+breast+cancer+in+a+3D+high-throughput+perfused+microfluidic+platform.">Therapy response testing of breast cancer in a 3D high-throughput perfused microfluidic platform.</a> BMC Cancer. 17 (1), 709 (2017).</li><li>Wevers, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+compound+evaluation+on+3D+networks+of+neurons+and+glia+in+a+microfluidic+platform.">High-throughput compound evaluation on 3D networks of neurons and glia in a microfluidic platform.</a> Scientific Reports. 6, 38856 (2016).</li><li>Vulto, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phaseguides:+a+paradigm+shift+in+microfluidic+priming+and+emptying.">Phaseguides: a paradigm shift in microfluidic priming and emptying.</a> Lab on a Chip. 11 (9), 1596-1602 (2011).</li><li>Patru, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD133,+CD15/SSEA-1,+CD34+or+side+populations+do+not+resume+tumor-initiating+properties+of+long-term+cultured+cancer+stem+cells+from+human+malignant+glio-neuronal+tumors.">CD133, CD15/SSEA-1, CD34 or side populations do not resume tumor-initiating properties of long-term cultured cancer stem cells from human malignant glio-neuronal tumors.</a> BMC Cancer. 10, 66 (2010).</li><li>Harma, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+panel+of+three-dimensional+models+for+studies+of+prostate+cancer+growth,+invasion+and+drug+responses.">A comprehensive panel of three-dimensional models for studies of prostate cancer growth, invasion and drug responses.</a> PLoS One. 5 (5), 10431 (2010).</li></ol>

Здесь мы описываем метод обработки и культивирования жизнеспособных опухолевых клеток, полученных PDX, в высокой пропускной способности, пролитой 3D-культуре. Хотя этот протокол использует PCa PDX ткани, он одинаково эффективен для других эпителиальных полученных опухолей. Характеристики ...

За последнее десятилетие, область исследований рака продемонстрировала новый энтузиазм для пациентов, полученных ксенотрансплантатов (PDXs) в качестве инструмента для оценки рака клеток пути опоры и лекарственнойвосприимчивости 1. Наиболее распространенные модели PDX устанавливаются подкожной или ортопедической имплантацией опухолевых клеток человека – фрагментом опухоли, скоплением диссоциированных опухолевых клеток или образцом изолированных циркулирующих опухолевых клеток (КТК) — в хозяина грызунов. Если опухоль "взять" успешно, ксенотрансплантат клетки будут размножаться, васкуляризации, и в противном случае взаимодействовать с принимающей ткани для создания опухоли, которые могут быть собраны при оптимальном размере, подразделяется, и повторно имплантированы в других хозяев. Среди их многочисленных преимуществ в качестве модели системы, PDXs обычно сохраняют значительную часть неоднородности популяции опухолевых клеток и позволяют оценить человека конкретных путей и клеточныхреакций 2,3. Контекст in vivo позволяет взаимодействие опухоли с сосудами и другими смежными стромами и резюмирует характеристики тканей, такие как динамика диффузии наркотиков, кислородное напряжение и внеклеточное матричное влияние, которое биологически и механически влияет на прогрессирование опухоли. Негативным аспектом PDX является их зависимость от грызунов хозяина, как для расширения опухоли и в конечном итоге для тестирования гипотез. Поскольку многие PDX не могут адаптироваться к традиционной двумерной (2D) культуре тканей полистирола, не теряя при этом многих из своих желательных характеристик, существует минимальная середина для исследователей между этим относительно контролируемым методом in vitro, и значительным увеличением расходов, средств и требований времени для использования in vivo PDX.
Мы описали несколько моделей in vitro, которые реализуют культуру 3D клеток в рамках поддерживающей матрицы, а недавно расширили эту работу, чтобы продемонстрировать культуру ex vivo множественного рака простаты (PCa) полученных PDXs, как в одиночку, так и в совместной культуре с костным мозгом полученныхфибробластов 4,5. Гиалуроновая кислота (HA) на основе гидрогеля матрицы обеспечивают настраиваемую и биологически релевантную поддержку для обоих типов клеток, с поверхностным контролем над характеристиками гидрогеля и оптической ясности для визуализации через гидрогельглубины 6.
Зрелые опухолевые ткани PDX состоят из переменной смеси неоднородных раковых клеток человека и стромы мыши (фибробласты, эндотелиальные клетки и т.д.). Для изучения клеточного типа конкретных вкладов в прогрессирование опухоли в пробирке, это может быть выгодно, чтобы отделить опухоли, отделить популяции клеток, и экспериментально включить их в организованном порядке, чтобы вскрыть пути межклеточной связи. Смешанные популяции клеток в тканях дигестатов имеют дифференциальную совместимость с конкретными культурными условиями. Например, связанная с опухолью фибробластная жизнеспособность требует либо поверхностного присоединения, либо 3D матриц, функционируют с лигандами интегрина, в то время как эпителиальные клетки PDX обычно не имеют этих требований, вместо этого отдающих предпочтение взаимодействиям клеток и клеток. Эти различия могут быть использованы для достижения эффективного отделения клеток PDX от загрязняющих мыши стромальных клеток. Культура вращения тканей дигеста позволяет стромальной клеточной приверженности поверхности культуры тканей в то время как клеточные спайки диск PDX клетки, плавающие над вращающейся поверхностью культуры, чтобы сформировать многоклеточные кластеры в супернатант в 24-48 ч. Специфические характеристики этих скоплений варьируются в зависимости от PDX (например, большие, плотные, высокосферические кластеры или меньшие, более свободные агрегаты, напоминающие гроздь винограда), но, как правило, имеют биологически релевантные размеры (диаметр 50–250 мкм), достаточные для оценки клеточных взаимодействий, которые опираются на межклеточные контакты.
Поиск и обработка опухолей неизбежно приводит к определенной степени сопутствующей гибели клеток либо из-за кратковременного повреждения в результате механических/энзиматических нарушений, либо к длительной несовместимости субпопуляций с выбранными культурными условиями. Несмотря на полезность культуры вращения как первоначального массового разделения, мертвые или умирающие клетки неизбежно передаются с кластерами PDX и могут влиять на связанную с этим культуру. Эти мертвые клетки часто являются отдельными клетками PDX, которые не были интегрированы в кластер, мыши стромальные фибробласты, которые не могут выжить в определенных условиях культуры, или особенно хрупкие эндотелиальные клетки. Такие умирающие клетки могут влиять на экспериментальные результаты "выживших" и могут существенно влиять на количественную оценку, например, с помощью анализов флуоресцентного скрининга жизнеспособности на основе изображений. Чтобы улучшить выбор живых клеток PDX из этого метода, мы адаптировали методы центрифугации с шагами плотности, чтобы легко удалить отдельные мертвые/умирающие клетки из смесей PDX и сохранить преимущественно живые многоклеточные кластеры.
Для повышения изучения результатов PDX полученных кластеров в 3D-культуре, мы использовали микрофлюиды основе перфузии культуры платформы, OrganoPlate (Рисунок 1), который является высокой пропускной способностью орган-на-чипе платформы, которая позволяет для одновременной культуры до 96 отдельных проникнуты, 3D культур на 384-ну микротитер пластины базы (,Рисунок 1A)7.8 В 2-полосной микрофлюидной пластине один чип ткани соединен двумя микрофлюидными каналами(рисунок 1B,гель-канал: красный, перфузионый канал: синий), которые охватывают четыре скважины подряд. Два микрофлюидных канала разделены коротким пластиковым хребтом под названием Phaseguide, который предотвращает переполнение одного канала в соседний соседний канал, и одновременно позволяет без мембраны интерфейс между содержимым геля и перфузииканала 9. Поскольку дно микрофлюидной пластины состоит из микроскопического стекла, культуры можно рассматривать в окне наблюдения через дно пластины со стандартным или автоматизированным микроскопом. Перфузия устанавливается в микрофлюидной пластине с программируемой рокер, используя гравитацию для привода средств массовой информации через микрофлюидные каналы, междускважинами резервуара (рисунок 1C). Перфузионный поток-мимикрирует более тесно recapitulates микроокноронности опухоли, чем статическая культура, что позволяет для включения стресса стрижки и расширение распределения газов и питательных веществ. Преимущества поддержания перфлитой культуры раковых клеток в микрофлюидной пластине ранее были описаны как переплетаются культуры рака молочной железы выставлены оптимальной жизнеспособности по сравнению со статической 3D-культуры тех жеклеток 7.
В настоящем докладе описывается адаптированный метод центрифугирования плотности для изоляции живых многоклеточных кластеров PDX и демонстрируется его полезность в создании 3D культур PDX в пределах перфузируемых микрофлюидных пластин. Поскольку все большее число исследовательских лабораторий ищут методы для облегчения использования PDX, мы ожидаем, что представленные здесь протоколы будут иметь непосредственную полезность.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:812px;" width="812">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">1N NaOH</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td style="width:224px;">any suitable tissue culture grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">60 mm round tissue culture dishes</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td>any suitable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">6-well tissue culture plates</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td>any suitable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">70 &#181;m cell strainers</td>
			<td style="width:148px;">Corning</td>
			<td style="width:189px;">431751</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:251px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:148px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:189px;">5810R with suitable rotor and buckets for 15/50 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Density gradient centrifugation solution</td>
			<td style="width:148px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:189px;">P1644</td>
			<td>Percoll</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Dimethylsulfoxide</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td>any suitable tissue culture grade</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Dissociation enzyme solution</td>
			<td style="width:148px;">StemCell Technologies</td>
			<td style="width:189px;">07921</td>
			<td style="width:224px;">ACCUMAX</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">DMEM-F12</td>
			<td style="width:148px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:189px;">11039021</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Forceps</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td>any suitable</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">HA hydrogel kit</td>
			<td style="width:148px;">ESI BIO</td>
			<td style="width:189px;">GS311</td>
			<td style="width:224px;">HyStem (Hyaluronic acid-SH and PEGDA)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Hanks Balanced Salt Solution</td>
			<td style="width:148px;">Lonza</td>
			<td style="width:189px;">10-527F</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Heat-inactivated fetal bovine serum</td>
			<td style="width:148px;">Atlanta Biologicals</td>
			<td style="width:189px;">S11150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Hemocytometer</td>
			<td style="width:148px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:189px;">02-671-51B Hausser BrightLine</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Hoechst 33342</td>
			<td style="width:148px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:189px;">H1398</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Image processing software</td>
			<td style="width:148px;">Oxford Instruments</td>
			<td style="width:189px;">Imaris 9.3</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:251px;">LIVE/DEAD Cell Viability/Cytotoxicity Kit (Calcein-AM/Ethidium Homodimer-1)</td>
			<td style="width:148px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:189px;">L3224</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Microfluidic culture plate</td>
			<td style="width:148px;">Mimetas</td>
			<td style="width:189px;">9603-400-B</td>
			<td>2-lane OrganoPlate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Microscope</td>
			<td style="width:148px;">Nikon</td>
			<td style="width:189px;">A1R</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="68">
			<td height="68" style="height:68px;width:251px;">Multichannel pipette</td>
			<td style="width:148px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:189px;">3125000036</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:251px;">PDX-derived tumor tissue</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td style="width:224px;">obtained under IRB approval for human tissue and IACUC approval for animal host</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Penicillin-streptomycin</td>
			<td style="width:148px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:189px;">15140-122</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Perfusion rocker</td>
			<td style="width:148px;">Mimetas</td>
			<td style="width:189px;">OrganoPlate Perfusion Rocker Mini</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">pH strips (pH 5-9)</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td>any suitable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Phosphate-buffered saline solution</td>
			<td style="width:148px;">Lonza</td>
			<td style="width:189px;">17-516F</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Razor blades</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td>any suitable</td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;width:251px;">Rotating xy-shaker</td>
			<td style="width:148px;">VWR</td>
			<td style="width:189px;">Advanced 3500 Orbital Shaker</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Scalpel handle</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td>any suitable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Single channel repeating pipette</td>
			<td style="width:148px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:189px;">22260201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Sterile, 15mL conical centrifuge tubes</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td>any suitable</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Sterile, 50mL conical centrifuge tubes</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td>any suitable</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

enhanced viability for ex vivo 3d hydrogel cultures of patient-derived xenografts in a perfused microfluidic platform

Ксенотрансплантаты пациентов (PDX), генерируемые при ресектировании опухолевой ткани пациента, присвякаются непосредственно в иммунокомпромиссных мышей, остаются биологически стабильными, тем самым сохраняя молекулярные, генетические и гистологические особенности, а также неоднородность первоначальной опухоли. Однако использование этих моделей для проведения множества экспериментов, включая скрининг на наркотики, является непомерно высоким как с точки зрения затрат, так и с точки зрения времени. Трехмерные (3D) системы культуры широко рассматриваются как платформы, в которых раковые клетки сохраняют свою биологическую целостность посредством биохимических взаимодействий, морфологии и архитектуры. Наша команда имеет большой опыт культивирования клеток PDX in vitro с использованием 3D матриц, состоящих из гиалуроновой кислоты (HA). Для того, чтобы отделить мышь фибробластов стромальных клеток, связанных с PDXs, мы используем культуру вращения, где стромальные клетки придерживаются поверхности ткани культуры обработанных пластин в то время как диссоциированные клетки опухоли PDX плавать и самостоятельно ассоциировать в многоклеточных кластеров. Кроме того, плавающие в supernatant являются одними, часто мертвые клетки, которые представляют собой проблему в сборе жизнеспособных кластеров PDX для инкапсуляции вниз по течению в гидрогели для 3D-клеточной культуры. Для того, чтобы отделить эти одиночные клетки от живых клеточных кластеров, мы использовали градиентную центрифугирование плотности. Описанный здесь протокол допускает истощение не жизнеспособных одиночных клеток из здоровой популяции клеточных кластеров, которые будут использоваться для дальнейших экспериментов в пробирке. В наших исследованиях мы включаем 3D-культуры в микрофлюидные пластины, которые позволяют перфузии средств массовой информации во время культуры. После оценки результатных культур с использованием флуоресцентного изображения на основе анализа жизнеспособности очищенных по сравнению с неочищенные клетки, наши результаты показывают, что этот дополнительный шаг разделения существенно сократили число нежизнеспособных клеток из наших культур.

Программируемый перфузионый рокер был подготовлен в стандартном инкубаторе культуры клеток с водяным гнездом, а двухполосные микрофлюидные пластины были подготовлены в стандартном кабинете биобезопасности дляпогрузки (рисунок 1). MDA-PCA-118b PDX опухоль была расширена in vivo...

Watch this Scientific Journal Video about Enhanced Viability for Ex vivo 3D Hydrogel Cultures of Patient-Derived Xenografts in a Perfused Microfluidic Platform at JoVE.com

Enhanced Viability for Ex vivo 3D Hydrogel Cultures of Patient-Derived Xenografts in a Perfused Microfluidic Platform

Этот протокол демонстрирует методы, позволяющие расширенную культуру in vitro ксенотрансплантатов пациентов (PDX). Один из шагов повышает общую жизнеспособность многоклеточных кластерных культур в 3D гидрогелях, путем прямого удаления не жизнеспособных одиночных клеток. Вторичный шаг демонстрирует лучшие практики для культуры PDX в перфлитированных микрофлюидных платформ.

Улучшенная жизнеспособность для Ex vivo 3D гидрогелевых культур ксенотрансплантатов, полученных пациентами, в переливной микрофлюидной платформе

Patient-derived xenografts (PDX), generated when resected patient tumor tissue is engrafted directly into immunocompromised mice, remain biologically ...

Улучшенные методы культуры для пациент-полученных образцов тумора критически важны по мере того как поле двигает далеко от пользы обычных линий клетки. Этот протокол позволяет в пробирке культуры пациентов полученных опухолевых клеток в платформе, которая подменяется высокой пропускной способности и высокое содержание скрининга, в отличие от моделей рака in vivo. Платформа, включающая PDX, позволяет нам оценивать более неоднородные системы, отражающие местные опухоли.Это может дать представление о механизмах наркотиков и обеспечить более быстрый скрининг наркотиков. Метод может быть расширен за счет включения стромы, эндотелия и иммунных клеток. Эти совместно культуры могут быть еще более отражающими коренные популяции опухолей и архитектуры.Практика загрузки микрофлюидных пластин с легко расширенными клеточными линиями, чтобы стать очень опытным, прежде чем переходят к более драгоценным клеткам, как PDXs. Выравнивание во время распределения пластины значительно влияет на успех, и визуальная демонстрация может легко передать эту концепцию. Для начала перенесите опухолевую ткань в предварительно взвешенную стерильную 50-миллилитровую коническую трубку.Промыть шесть раз с 30 миллилитров стерильных PBS для удаления крови и загрязняющих веществ. Удалите как можно больше жидкости и взвесит опухолевые ткани. Перенесите опухолевую ткань на 60-миллиметровую круглую ткань культуры блюдо, и использовать стерильные лезвия бритвы или скальпель, чтобы фарш его на один миллиметр штук.Добавьте пять миллилитров среды обработки PDX для сбора опухолевой суспензии. Добавьте пять миллилитров раствора фермента диссоциации для сбора опухолевой суспензии. Промыть блюдо культуры с еще пять миллилитров диссоциации ферментного раствора.Затем добавьте пять миллилитров среды обработки PDX. Инкубировать 20 минут при 37 градусах по Цельсию с нежной тряской. На полпути через инкубацио время, вихрь трубки мягко.После инкубации, пипетка вверх и вниз осторожно с серологической пипетки, чтобы разбить сгустки. Поместите 70-микрон-клеточный ситечко на новую стерильную 50-миллилитровую трубку и процедите клетки. Затем центрифуга при 1200 об/мин в течение двух минут гранулировать клетки.Удалите супернатант и resuspend в два-три миллилитров среды культуры PDX. Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра или автоматизированного счетчика клеток. Используйте эту таблицу для оценки необходимого количества связанных ячеек, полученных PDX, необходимых для достижения желаемой плотности клеток на чип.Плита от одного до двух раз от 10 до шести клеток в пяти миллилитров PDX культуры среды на колодец из шести хорошо пластины культуры ткани. Инкубировать в течение 48 часов при 37 градусах по Цельсию, 5%углекислого газа и 95%влажности с нежной тряской при 50-55 об/мин для содействия образованию кластеров. После формирования кластеров приступайте к центрифугации.Сначала приготовьте 20 миллилитров градиентного раствора 100%-ной плотности, тщательно смешивая 18 миллилитров раствора градиентной центрифугации плотности с двумя миллилитров стерильной 10X HBSS в стерильной 50-миллилитрной конической трубке. Разбавить этот 100%-ный раствор стерильным 1X HBSS, чтобы сделать 10 миллилитров каждый из 20%30%40%и 55%плотность градиентных решений. Добавьте три миллилитров градиентного раствора 55%-й плотности на дно 15-миллилитровой конической трубки.Удерживая трубку под углом, медленно распределять три миллилитров 40%плотности градиентного раствора на угловой стороне трубки и на верхней части 55%слоя. Повторите с градиентом 30%-й плотности. Затем соберите супернатант культур вращения PDX с пятими миллилитровой серологической пипеткой в трубку, мягко опоясыв поверхность пластины.Центрифуга при 1200 об/мин в течение двух минут гранулировать клетки. Удалите супернатант и повторно посовелите клеточные гранулы в три миллилитра градиентного раствора 20%плотности. Тщательно слой 20%density градиентный раствор с клетками на верхней части градиента в 15-миллилитровой трубки.Крышка труб и центрифуг в качели ведро ротор центрифуги 30 минут при четырех градусах по Цельсию, 2000 раз G, и нулевой перерыв. После центрифугации видны фракции. Жизнеспособные культуры клеток PDX обычно находятся на интерфейсе градиентного решения плотности от 40 до 55%.Соберите два-три миллилитров каждой фракции в свежие 15-миллилитровые трубки. Добавить три-четыре тома стерильных 1X HBSS к каждой фракции, и инвертировать тщательно перемешать. Центрифуга при 1000 Г в течение трех минут, чтобы гранулировать клетки.Удалите супернатант. Повторное производство клеточных гранул в один-два миллилитров среды обработки PDX. Перенесите небольшой алицит от 50 до 100 микролитров в трубку и добавьте равный объем раствора фермента диссоциации для редиссоциации.Оцените номер ячейки в кластерной подвеске ячейки. Подсчитайте клетки с гемоцитометром или автоматизированным счетчиком клеток. Восстановить гидрогельные растворы гиалуроновой кислоты в соответствии с инструкциями производителя.Используя многоканальный пипетку, добавьте 50 микролитров HBSS ко всем скважинам в столбцах окна наблюдения двухполосной микрофлюидной пластины для поддержания влажности культуры и оптимальных условий визуализации. Рассчитайте объем клеточной суспензии, необходимый для 50 микролитров гидрогеля при желаемой плотности клеток, например, 5 000 клеток на микролитер. Для посева одной микрофлюидной пластины, aliquot рассчитанный объем в каждой из четырех стерильных 1,5-миллилитровых центрифуг труб.Отрегулируйте рН раствора HA thiol до восьми с 1 нормальным гидроксидом натрия непосредственно перед использованием. Выполните тест гелеобразования путем смешивания 40 микролитров HA thiol с 10 микролитров PEGdA и мониторинга гелеобразования с течением времени. Далее центрифуга подвесной клетки aliquots в течение двух минут при 200 раз G и комнатной температуры гранулы клеток.Тщательно удалите супернатант и повторно посовелите клетки в 40 микролитров HA thiol для 50-микролитрового конечного объема. Добавьте 10 микролитров PEGdA в одну алициту клеток HA thiol. Хорошо перемешать и подождать от одной до трех минут, прежде чем сеять микрофлюидную пластину.Прикрепите наконечник для дозирования 1,5 микролитров к одноканайной повторяющейся пипетке и загрузите клетки в растворе гидрогеля HA. Не забудьте сохранить водород aliquot хорошо смешанные для обеспечения равномерного распределения клеток. Чтобы посеять микрофлюидную пластину, выровняйте наконечник пипетки перпендикулярно лезвию, аккуратно поместив кончик в центр входного геля, чтобы обеспечить контакт, но без давления при дозирование 1,5 микролитров гидрогеля раствора.Наблюдайте за состоянием заполнения микрофлюидных каналов, просматривая с верхней части пластины, нижней части пластины или с помощью микроскопа. Оцените загрузку, используя эту цифру в качестве руководства. Через минуту после погрузки, инвертировать пластину во время подготовки к следующему aliquot.Повторите посев микрофлюидной пластины для оставшихся трех алицитов клеток в растворе HA. После того, как все микросхемы заполнены, инкубировать пластину при 37 градусах по Цельсию во влажном инкубаторе 45 минут, пока гелеобразование не будет завершено. После этого, используя предоставленное руководство, убедитесь, что перфузионный рокер установлен в инкубаторе культуры клеток с правильным параметром изобилия под углом 14 градусов и четырехминутными интервалами.Добавьте 50 микролитров среды культуры клеток PDX ко всем средним входам. Аккуратно коснитесь пластины о поверхность, чтобы стимулировать жидкость для заполнения микрофлюидных каналов. Затем переверните пластину, чтобы проверить, если каналы заполнены должным образом.Добавьте 50 микролитров DMEM/F-12 для всех средств массовой информации. Если пузырьки воздуха оказались в ловушке в канале перфузии, удалите нежным нажатием пластины на поверхность. Используя форму макета микроскопа и пластины, записыв чип, заполняя успех.Исключите неправильно заполненные чипы из дальнейшего экспериментального использования. Поместите пластину на наклонный рокер, установленный на 14-градусный наклон и четырехминутный цикл, чтобы начать перфузию. Каждые два дня, заменить PDX культуры среды, сначала 50 микролитров в бухтах, а затем 50 микролитров в торговых точках.В этом исследовании в стандартном инкубаторе культуры клеток с водяными куртками был установлен программируемый перфузионные рокеры, а в стандартном кабинете биобезопасности для погрузки были подготовлены двухполосные микрофлюидные лезвия. 3D микрофлюидная культура PDX жизнеспособность и морфология были оценены как в несепарированных и плотности градиента центрифугации разделенных условиях. В первый день те культуры, которые прошли метод разделения, продемонстрировали в десять раз меньше одиночных мертвых клеток по сравнению с неразмещенными культурами.Важно отметить, что разделенные кластеры в основном состояли из живых клеток. Статистически значимой разницы в распределении размеров кластера выявлено не было. Культуры также поддерживались в микрофлюидной пластине в течение семи дней.Общее число живых клеток оставалось неизменным, и кластеры сохраняли примерно 80%-ную жизнеспособность в течение жизни культуры. Помните, что каждая линия PDX уникальна, поэтому легкость пищеварения опухоли, фенотипический размер и морфология кластеров, а также расположение кластера в рамках очистки градиента будет меняться. Культуры PDX, созданные с помощью этого метода, могут быть просасывания с помощью анализа жизнеспособности на основе изображения или считывателя пластин, фиксированной и иммунофлуоресцентной маркировки, или разобщены для сбора лизаторов клеток для других протоколов.Метод позволит исследователям резюмировать микроокноронию опухоли для изучения биологии или лекарственной реакции опухолевых клеток. Пользователи должны пройти стандартную подготовку по человеческим предметам и обучению патогенов, перед работой с тканями, полученными человеком. Следует носить соответствующее средства индивидуальной защиты.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Labeling of Breast Cancer Patient-derived Xenografts with Traceable Reporters for Tumor Growth and Metastasis Studies

Маркировку рака молочной железы на пациента получены ксенотрансплантатов с прослеживаемы Репортеров для опухолевого роста и метастазирования исследований

The use of preclinical models to study tumor biology and response to treatment is central to cancer research. Long-established human cell lines, and many ...

Isolation and Characterization of Tumor-initiating Cells from Sarcoma Patient-derived Xenografts

Изоляция и характеристика опухолевых клеток от саркомы пациента полученных Xenografts

The existence and importance of tumor-initiating cells (TICs) have been supported by increasing evidence during the past decade. These TICs have been ...

Fluorescence Molecular Tomography for In Vivo Imaging of Glioblastoma Xenografts

Fluorescence Molecular Tomography for In Vivo Imaging of Glioblastoma Xenografts

Молекулярные томография флуоресценции для изображений в Vivo ксенотрасплантатов глиобластомы

Tumorigenicity is the capability of cancer cells to form a tumor mass. A widely used approach to determine if the cells are tumorigenic is by injecting ...

Patient-derived Heterogeneous Xenograft Model of Pancreatic Cancer Using Zebrafish Larvae as Hosts for Comparative Drug Assessment

Пациент полученных гетерогенных Xenograft Модель рака поджелудочной железы использованием черыщения зебрав в качестве хозяев для сравнительной оценки наркотиков

Patient-derived tumor xenograft (PDX) and cell-derived tumor xenograft (CDX) are important techniques for preclinical assessment, medication guidance and ...

Physiologic Patient Derived 3D Spheroids for Anti-neoplastic Drug Screening to Target Cancer Stem Cells

Физиологические пациент выведенных 3D сфероидов для анти-неопластических наркотиков скрининга целевой рак стволовых клеток

In this protocol, we outline the procedure for generation of tumor spheroids within 384-well hanging droplets to allow for high-throughput screening of ...

Assessing Cell Viability and Death in 3D Spheroid Cultures of Cancer Cells

Оценка жизнеспособности и смерти клеток в 3D сфероидных культурах раковых клеток

Three-dimensional spheroids of cancer cells are important tools for both cancer drug screens and for gaining mechanistic insight into cancer cell biology. ...

Establishment of Gastric Cancer Patient-derived Xenograft Models and Primary Cell Lines

Создание желудка рака пациента полученных Ксенотрансплантат Модели и первичные линии клеток

The use of preclinical models to advance our understanding of tumor biology and investigate the efficacy of therapeutic agents is key to cancer research. ...

Testing Targeted Therapies in Cancer using Structural DNA Alteration Analysis and Patient-Derived Xenografts

Тестирование целевых методов лечения рака с использованием структурных анализа изменения ДНК и пациентов, полученных Xenografts

We present here an integrative approach for testing efficacy of targeted therapies that combines the next generation sequencing technolo-gies, therapeutic ...

Drug Screening of Primary Patient Derived Tumor Xenografts in Zebrafish

Скрининг наркотиков первичного пациента, полученных опухоли Xenografts в зебрафиш

Patient derived xenograft models are critical in defining how different cancers respond to drug treatment in an in vivo system. Mouse models are the ...

Patient-Derived Tumor Explants As a "Live" Preclinical Platform for Predicting Drug Resistance in Patients

Экспланты опухолей, полученные от пациентов, как «живая» доклиническая платформа для прогнозирования лекарственной устойчивости у пациентов

An understanding of drug resistance and the development of novel strategies to sensitize highly resistant cancers rely on the availability of suitable ...