Name: enhanced viability for ex vivo 3d hydrogel cultures of patient-derived xenografts in a perfused microfluidic platform
Uploaded: 2020-12-05T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Enhanced Viability for Ex vivo 3D Hydrogel Cultures of Patient-Derived Xenografts in a Perfused Microfluidic Platform at JoVE.com

Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional de Salud del Instituto Nacional del Cáncer SBIR Fase I (HHSN26120700015C) y P01CA098912.

El tejido tumoral se obtuvo con el consentimiento del paciente y de acuerdo con un protocolo aprobado de la Junta de Revisión Institucional (IRB). Los xenoinjertos fueron implantados, cultivados y cosechados de acuerdo con un protocolo aceptado del Comité Institucional de Cuidado y Uso animal (IACUC).
NOTA: Todo el trabajo debe realizarse en un armario de seguridad biológica estéril para mantener la esterilidad. Todos los pasos deben llevarse a cabo a temperatura ambiente a menos que se es...

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	<li>Jung, J., Seol, H. S., Chang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Generation+and+Application+of+Patient-Derived+Xenograft+Model+for+Cancer+Research.">The Generation and Application of Patient-Derived Xenograft Model for Cancer Research.</a> Cancer Research and Treatment: Official Journal of Korean Cancer Association. 50 (1), 1-10 (2018).</li><li>Malaney, P., Nicosia, S. V., Dave, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One+mouse,+one+patient+paradigm:+New+avatars+of+personalized+cancer+therapy.">One mouse, one patient paradigm: New avatars of personalized cancer therapy.</a> Cancer Letters. 344 (1), 1-12 (2014).</li><li>Meehan, T. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PDX-MI:+Minimal+Information+for+Patient-Derived+Tumor+Xenograft+Models.">PDX-MI: Minimal Information for Patient-Derived Tumor Xenograft Models.</a> Cancer Research. 77 (21), 62-66 (2017).</li><li>Fong, E. L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogel-Based+3D+Model+of+Patient-Derived+Prostate+Xenograft+Tumors+Suitable+for+Drug+Screening.">Hydrogel-Based 3D Model of Patient-Derived Prostate Xenograft Tumors Suitable for Drug Screening.</a> Molecular Pharmaceutics. 11 (7), 2040-2050 (2014).</li><li>Fong, E. L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+3D+in+vitro+model+of+patient-derived+prostate+cancer+xenograft+for+controlled+interrogation+of+in+vivo+tumor-stromal+interactions.">A 3D in vitro model of patient-derived prostate cancer xenograft for controlled interrogation of in vivo tumor-stromal interactions.</a> Biomaterials. 77, 164-172 (2016).</li><li>Engel, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyaluronic+Acid-Based+Hydrogel+Formulations+Suitable+for+Automated+3D+High+Throughput+Drug+Screening+of+Cancer-Stromal+Cell+Cocultures.">Hyaluronic Acid-Based Hydrogel Formulations Suitable for Automated 3D High Throughput Drug Screening of Cancer-Stromal Cell Cocultures.</a> Advanced Healthcare Materials. 4 (11), 1664-1674 (2015).</li><li>Lanz, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapy+response+testing+of+breast+cancer+in+a+3D+high-throughput+perfused+microfluidic+platform.">Therapy response testing of breast cancer in a 3D high-throughput perfused microfluidic platform.</a> BMC Cancer. 17 (1), 709 (2017).</li><li>Wevers, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+compound+evaluation+on+3D+networks+of+neurons+and+glia+in+a+microfluidic+platform.">High-throughput compound evaluation on 3D networks of neurons and glia in a microfluidic platform.</a> Scientific Reports. 6, 38856 (2016).</li><li>Vulto, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phaseguides:+a+paradigm+shift+in+microfluidic+priming+and+emptying.">Phaseguides: a paradigm shift in microfluidic priming and emptying.</a> Lab on a Chip. 11 (9), 1596-1602 (2011).</li><li>Patru, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD133,+CD15/SSEA-1,+CD34+or+side+populations+do+not+resume+tumor-initiating+properties+of+long-term+cultured+cancer+stem+cells+from+human+malignant+glio-neuronal+tumors.">CD133, CD15/SSEA-1, CD34 or side populations do not resume tumor-initiating properties of long-term cultured cancer stem cells from human malignant glio-neuronal tumors.</a> BMC Cancer. 10, 66 (2010).</li><li>Harma, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+panel+of+three-dimensional+models+for+studies+of+prostate+cancer+growth,+invasion+and+drug+responses.">A comprehensive panel of three-dimensional models for studies of prostate cancer growth, invasion and drug responses.</a> PLoS One. 5 (5), 10431 (2010).</li></ol>

Aquí describimos un método para procesar y cultivar células tumorales derivadas de PDX viables en un sistema de cultivo 3D perfundido y de alto rendimiento. Mientras que este protocolo utiliza tejido PCa PDX, es igualmente eficaz para otros tumores de origen epitelial. Las características tumorales varían entre las líneas PDX individuales incluso dentro del mismo tejido de origen (próstata, mama, etc.). Algunas líneas PCa PDX son más fibrosas y difíciles de aislar las células viables, mientras que otras son m?...

Durante la última década, el campo de la investigación del cáncer ha demostrado un renovado entusiasmo por los xenoinjertos derivados del paciente (PDX) como una herramienta para evaluar la dependencia de las vías de las células cancerosas y la susceptibilidad a los medicamentos1. Los modelos PDX más comunes se establecen mediante implantación subcutánea u ortotópica de células tumorales humanas (un fragmento tumoral, un grupo de células derivadas de tumores disociadas o una muestra de células tumorales circulantes aisladas (CTC)) en un huésped de roedores. Si la "toma" tumora tiene éxito, las células del xenoinjerto proliferarán, vascularizarán e interactuarán de otra manera con el tejido huésped para crear un tumor, que puede ser cosechado en un tamaño óptimo, subdividido y reim implantado en otros huéspedes. Entre sus muchas ventajas como sistema modelo, los PDX suelen retener una parte sustancial de la heterogeneidad de la población de células tumorales nativas y permiten evaluar las vías específicas del ser humano y las respuestas celulares2,,3. El contexto in vivo permite la interacción tumoral con vasculatura y otros estroma adyacentes y recapitula características tisulares como la dinámica de difusión de fármacos, la tensión de oxígeno y la matriz extracelular influyen en la progresión tumoral biológica y mecánicamente. Un aspecto negativo de los PDX es su dependencia de un huésped de roedores, tanto para la expansión del tumor como, en última instancia, para las pruebas de hipótesis. Debido a que muchos PDX no pueden adaptarse al cultivo bidimensional tradicional (2D) en el poliestireno del cultivo tisular sin perder muchas de sus características deseables, ha habido un mínimo de terreno medio para los investigadores entre este método in vitro relativamente controlado, y el aumento significativo en los requisitos de gasto, instalaciones y tiempo para el uso de PDX in vivo.
Hemos descrito múltiples modelos in vitro que implementan el cultivo celular 3D dentro de una matriz de apoyo, y recientemente ampliamos ese trabajo para demostrar el cultivo ex vivo de los PDX derivados del cáncer de próstata múltiple (PCa), tanto solos como en co-cultivo con fibroblastos derivados de médula ósea4,,5. Las matrices de hidrogel a base de ácido hialurónico (HA) proporcionan un soporte personalizable y biológicamente relevante para ambos tipos de células, con control fácil sobre las características del hidrogel y claridad óptica para la toma de imágenes a través de la profundidad del hidrogel6.
Los tejidos tumorales PDX maduros comprenden una mezcla variable de células cancerosas humanas heterogéneas y estroma de ratón (fibroblastos, células endoteliales, etc.). Para estudiar las contribuciones específicas de tipo celular a la progresión tumoral in vitro, puede ser ventajoso disociar tumores, separar las poblaciones celulares e incorporarlos experimentalmente de manera organizada para diseccionar vías de comunicación intercelular. Las poblaciones de células mixtas dentro de los digestatos de tejido tienen compatibilidad diferencial con condiciones específicas de cultivo. Por ejemplo, la viabilidad de los fibroblastos asociados al tumor requiere adherencia superficial o matrices 3D funcionalizadas con ligandos de integrina, mientras que las células PDX derivadas de la epitelial no suelen tener estos requisitos, sino que favorecen las interacciones entre células células. Estas diferencias se pueden aprovechar para lograr una separación efectiva de las células PDX de contaminar las células estromales del ratón. El cultivo de rotación de digestatos tisulares permite la adherencia de células estromales a la superficie de cultivo del tejido, mientras que las adherencias de células celulares impulsan las células PDX que flotan sobre la superficie de cultivo giratoria para formar cúmulos multicelulares en el sobrenadante en 24-48 h. Las características específicas de estos racimos varían con el PDX (por ejemplo, racimos grandes, apretados, altamente esféricos o agregados más pequeños y más sueltos que se asemejan a racimos de uva), pero suelen tener tamaños biológicamente relevantes (diámetro de 50 a 250 m), suficiente para evaluar las interacciones celulares que se basan en contactos intercelulares.
La recuperación y el procesamiento de tumores inevitablemente dan lugar a algún grado de muerte celular colateral, ya sea debido a daños a corto plazo por perturbación mecánica/enzimática, o incompatibilidad a largo plazo de subpoblaciones con las condiciones de cultivo elegidas. A pesar de la utilidad del cultivo de rotación como separación a granel inicial, las células muertas o moribundas inevitablemente se transfieren con los clústeres PDX y pueden influir en el cultivo resultante. Estas células muertas son a menudo células PDX individuales que no se integraron en un grupo, fibroblastos estromales de ratón que no pueden sobrevivir en condiciones de cultivo seleccionadas, o particularmente células endoteliales frágiles. Estas células moribundas pueden influir en los resultados experimentales de los "supervivientes" y pueden afectar sustancialmente a la cuantificación, por ejemplo, a través de ensayos de cribado de viabilidad basados en imágenes fluorescentes. Para mejorar la selección de células PDX vivas de este método, adaptamos los métodos de centrifugación con pasos de densidad para eliminar fácilmente las células muertas/moribundas individuales de las mezclas PDX y retener predominantemente cúmulos multicelulares vivos.
Para mejorar el estudio de los clusters derivados de PDX resultantes en el cultivo 3D, utilizamos una plataforma de cultivo de perfusión basada en microfluidos, la OrganoPlate (Figura 1), que es una plataforma de órgano en chip de alto rendimiento que permite el cultivo simultáneo de hasta 96 cultivos 3D perfundidos individuales en una base de microtíter de 384 potes(Figura 1A)7,8. En la placa microfluídica de 2 carriles, un solo chip de tejido está conectado por dos canales microfluídicos(Figura 1B,canal de gel: rojo, canal de perfusión: azul) que abarcan cuatro pozos seguidos. Los dos canales microfluídicos están separados por una cresta de plástico corta llamada Phaseguide que evita el desbordamiento de un canal en su canal vecino adyacente, y simultáneamente permite una interfaz libre de membrana entre el contenido del gel y el canal de perfusión9. Debido a que la parte inferior de la placa microfluídica se compone de vidrio de grado microscopio, los cultivos se pueden ver en la ventana de observación a través de la parte inferior de la placa con un microscopio estándar o automatizado. La perfusión se establece en la placa microfluídica con un balancín programable, utilizando la gravedad para conducir medios a través de los canales microfluídicos, entre pozos de depósito (Figura 1C). El flujo de perfusión-imitación más estrechamente recapitula el microambiente tumoral que el cultivo estático, lo que permite la incorporación de estrés de cizallamiento y una mejor distribución de gases y nutrientes. Los beneficios de mantener un cultivo celular de cáncer perfundido en la placa microfluídica se han descrito previamente como cultivos perfundidos de cáncer de mama exhibieron una viabilidad óptima en comparación con un cultivo estático en 3D de las mismas células7.
El presente informe describe un método de centrifugación de gradiente de densidad adaptado para aislar los racimos de PDX multicelulares en vivo y demuestra su utilidad para establecer cultivos 3D PDX dentro de placas microfluídicas perfuibles. Debido a que un número cada vez mayor de laboratorios de investigación están buscando métodos para facilitar el uso de PDX, anticipamos que los protocolos presentados aquí serán de utilidad inmediata.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:812px;" width="812">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">1N NaOH</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td style="width:224px;">any suitable tissue culture grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">60 mm round tissue culture dishes</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td>any suitable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">6-well tissue culture plates</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td>any suitable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">70 &#181;m cell strainers</td>
			<td style="width:148px;">Corning</td>
			<td style="width:189px;">431751</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:251px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:148px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:189px;">5810R with suitable rotor and buckets for 15/50 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Density gradient centrifugation solution</td>
			<td style="width:148px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:189px;">P1644</td>
			<td>Percoll</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Dimethylsulfoxide</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td>any suitable tissue culture grade</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Dissociation enzyme solution</td>
			<td style="width:148px;">StemCell Technologies</td>
			<td style="width:189px;">07921</td>
			<td style="width:224px;">ACCUMAX</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">DMEM-F12</td>
			<td style="width:148px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:189px;">11039021</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Forceps</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td>any suitable</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">HA hydrogel kit</td>
			<td style="width:148px;">ESI BIO</td>
			<td style="width:189px;">GS311</td>
			<td style="width:224px;">HyStem (Hyaluronic acid-SH and PEGDA)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Hanks Balanced Salt Solution</td>
			<td style="width:148px;">Lonza</td>
			<td style="width:189px;">10-527F</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Heat-inactivated fetal bovine serum</td>
			<td style="width:148px;">Atlanta Biologicals</td>
			<td style="width:189px;">S11150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Hemocytometer</td>
			<td style="width:148px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:189px;">02-671-51B Hausser BrightLine</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Hoechst 33342</td>
			<td style="width:148px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:189px;">H1398</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Image processing software</td>
			<td style="width:148px;">Oxford Instruments</td>
			<td style="width:189px;">Imaris 9.3</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:251px;">LIVE/DEAD Cell Viability/Cytotoxicity Kit (Calcein-AM/Ethidium Homodimer-1)</td>
			<td style="width:148px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:189px;">L3224</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Microfluidic culture plate</td>
			<td style="width:148px;">Mimetas</td>
			<td style="width:189px;">9603-400-B</td>
			<td>2-lane OrganoPlate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Microscope</td>
			<td style="width:148px;">Nikon</td>
			<td style="width:189px;">A1R</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="68">
			<td height="68" style="height:68px;width:251px;">Multichannel pipette</td>
			<td style="width:148px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:189px;">3125000036</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:251px;">PDX-derived tumor tissue</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td style="width:224px;">obtained under IRB approval for human tissue and IACUC approval for animal host</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Penicillin-streptomycin</td>
			<td style="width:148px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:189px;">15140-122</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Perfusion rocker</td>
			<td style="width:148px;">Mimetas</td>
			<td style="width:189px;">OrganoPlate Perfusion Rocker Mini</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">pH strips (pH 5-9)</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td>any suitable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Phosphate-buffered saline solution</td>
			<td style="width:148px;">Lonza</td>
			<td style="width:189px;">17-516F</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Razor blades</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td>any suitable</td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;width:251px;">Rotating xy-shaker</td>
			<td style="width:148px;">VWR</td>
			<td style="width:189px;">Advanced 3500 Orbital Shaker</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Scalpel handle</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td>any suitable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Single channel repeating pipette</td>
			<td style="width:148px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:189px;">22260201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Sterile, 15mL conical centrifuge tubes</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td>any suitable</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Sterile, 50mL conical centrifuge tubes</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td>any suitable</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

enhanced viability for ex vivo 3d hydrogel cultures of patient-derived xenografts in a perfused microfluidic platform

Los xenoinjertos derivados del paciente (PDX), generados cuando el tejido tumoral resecado del paciente se injerta directamente en ratones inmunocomprometidos, permanecen biológicamente estables, preservando así las características moleculares, genéticas e histológicas, así como la heterogeneidad del tumor original. Sin embargo, el uso de estos modelos para realizar una multitud de experimentos, incluyendo la detección de drogas, es prohibitivo tanto en términos de costo como de tiempo. Los sistemas de cultivo tridimensionales (3D) son ampliamente vistos como plataformas en las que las células cancerosas conservan su integridad biológica a través de interacciones bioquímicas, morfología y arquitectura. Nuestro equipo tiene una amplia experiencia en el cultivo de células PDX in vitro utilizando matrices 3D compuestas de ácido hialurónico (HA). Con el fin de separar las células estromales fibroblastas de ratón asociadas con los PDX, utilizamos el cultivo de rotación, donde las células estromales se adhieren a la superficie de las placas tratadas con cultivo de tejidos mientras flotan las células tumorales PDX disociadas y se autoasocien en cúmulos multicelulares. También flotan en el sobrenadante son células simples, a menudo muertas, que presentan un desafío en la recolección de clústeres PDX viables para la encapsulación aguas abajo en hidrogeles para el cultivo celular 3D. Con el fin de separar estas células individuales de los cúmulos de células vivas, hemos empleado centrifugación de gradiente de paso de densidad. El protocolo descrito aquí permite el agotamiento de células individuales no viables de la población sana de grupos celulares que se utilizarán para la experimentación in vitro. En nuestros estudios, incorporamos los cultivos 3D en placas microfluídicas que permiten la perfusión media durante el cultivo. Después de evaluar los cultivos resultantes utilizando un ensayo de viabilidad basado en imágenes fluorescentes de células purificadas frente a no purificadas, nuestros resultados muestran que este paso de separación adicional redujo sustancialmente el número de células no viables de nuestros cultivos.

Se preparó un balancín de perfusión programable en una incubadora de cultivo celular de agua estándar, y se prepararon placas microfluídicas de dos carriles en un gabinete de bioseguridad estándar para la carga (Figura 1). Un tumor MDA-PCA-118b PDX se amplió in vivo, se recolectó cuando había alcanzado un tamaño máximo, y se disociaba como se describe en la sección 2 del protocolo para crear una suspensión de lodos de las células, en aproximadamente un estado de una sola célul...

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Enhanced Viability for Ex vivo 3D Hydrogel Cultures of Patient-Derived Xenografts in a Perfused Microfluidic Platform

Este protocolo demuestra métodos para permitir el cultivo in vitro extendido de xenoinjertos derivados del paciente (PDX). Un paso mejora la viabilidad general de los cultivos de racimos multicelulares en hidrogeles 3D, a través de la eliminación directa de células individuales no viables. Un paso secundario demuestra las mejores prácticas para el cultivo de PDX en una plataforma microfluídica perfundida.

Viabilidad mejorada para cultivos de hidrogel 3D Ex vivo de xenoinjertos derivados del paciente en una plataforma microfluídica perfundida

Patient-derived xenografts (PDX), generated when resected patient tumor tissue is engrafted directly into immunocompromised mice, remain biologically ...

Los métodos de cultivo mejorados para muestras de tumores derivados del paciente son de vital importancia a medida que el campo se aleja del uso de líneas celulares convencionales. Este protocolo permite el cultivo in vitro de células tumorales derivadas del paciente en una plataforma que es susceptible de alto rendimiento y cribado de alto contenido, a diferencia de los modelos de cáncer in vivo. La plataforma que incorpora PDX nos permite evaluar sistemas más heterogéneos que reflejan tumores nativos.Esto puede producir información sobre los mecanismos de drogas y permitir una detección más rápida de los medicamentos. El método podría expandirse mediante la incorporación de estroma, endotelio y células inmunitarias. Estas coculturas podrían ser aún más reflexivas de la población tumoral nativa y la arquitectura.Practique la carga de las placas microfluídicas con líneas celulares fácilmente expandidas para llegar a ser altamente competentes antes de cambiar a celdas más preciosas como PDX. Alineación durante la dosificación de placas afecta en gran medida el éxito, y una demostración visual puede transmitir fácilmente este concepto. Para comenzar, transfiera el tejido tumoral a un tubo cónico estéril prepesado de 50 mililitros.Enjuague seis veces con 30 mililitros de PBS estéril para eliminar la sangre y los contaminantes. Retire tanto líquido como sea posible y pese el tejido tumoral. Transfiera el tejido tumoral a un plato de cultivo de tejido redondo de 60 milímetros, y use una cuchilla de afeitar estéril o un bisturí para picarlo en trozos de un milímetro.Agregue cinco mililitros de medio de procesamiento de PDX para recoger la suspensión tumoral. Añadir cinco mililitros de solución enzimática de disociación para recoger la suspensión tumoral. Enjuague el plato de cultivo con otros cinco mililitros de solución enzimática de disociación.A continuación, agregue cinco mililitros de medio de procesamiento PDX. Incubar 20 minutos a 37 grados centígrados con un suave temblor. A mitad del tiempo de incubación, gire suavemente el tubo.Después de la incubación, pipetear suavemente hacia arriba y hacia abajo con una pipeta serológica para romper los grumos. Coloque un colador celular de 70 micras sobre un nuevo tubo estéril de 50 mililitros y filtre las células. Luego centrifugar a 1.200 rpm durante dos minutos para peletizar las células.Retire el sobrenadante y resuspend en dos o tres mililitros de medio de cultivo PDX. Cuente las células utilizando un hemocitoómetro o un contador de células automatizado. Utilice esta tabla para estimar el número necesario de las células derivadas DE PDX asociadas necesarias para lograr la densidad de celdas deseada por chip.Plato de una a dos veces 10 a las seis células en cinco mililitros de medio de cultivo PDX por pozo de una placa de cultivo de tejido de seis pozos. Incubar durante 48 horas a 37 grados Celsius, 5% dióxido de carbono y 95% de humedad con un suave temblor a 50 a 55 rpm para promover la formación de racimos. Después de que se hayan formado los racimos, proceda a la centrifugación.Primero prepare 20 mililitros de solución de gradiente de densidad 100% mezclando a fondo 18 mililitros de solución de centrifugación de gradiente de densidad con dos mililitros de HBSS estéril 10X en un tubo cónico estéril de 50 mililitros. Diluir esta solución al 100% con HBSS 1X estéril para hacer 10 mililitros cada uno de 20%30%40% y 55% soluciones de gradiente de densidad. Agregue tres mililitros de solución de gradiente de densidad del 55% en la parte inferior de un tubo cónico de 15 mililitros.Sosteniendo el tubo en un ángulo, prescinda lentamente tres mililitros de solución de gradiente de densidad del 40% en el lado en ángulo del tubo y en la parte superior de la capa del 55%. Repita con la solución de gradiente de densidad del 30%. A continuación, recoja el sobrenadante de los cultivos de rotación PDX con una pipeta serológica de cinco mililitros en un tubo, enjuagando suavemente la superficie de la placa.Centrifugar a 1.200 rpm durante dos minutos hasta las células de pellet. Retire el sobrenadante y resuspendir el pellet celular en tres mililitros de solución de gradiente de densidad 20%. Capa cuidadosamente la solución de gradiente de densidad del 20% con células en la parte superior del gradiente en el tubo de 15 mililitros.Tapa los tubos y centrífuga en una centrífuga de rotor oscilante-cubo 30 minutos a cuatro grados Celsius, 2.000 veces G y cero rotura. Después de la centrifugación, las fracciones son visibles. Los cultivos celulares PDX viables se encuentran típicamente en la interfaz de solución de gradiente de 40 a 55% densidad.Recoge de dos a tres mililitros de cada fracción en tubos frescos de 15 mililitros. Agregue de tres a cuatro volúmenes de HBSS estéril 1X a cada fracción e invierta para mezclar a fondo. Centrifugar a 1.000 veces G durante tres minutos para peletizar las células.Retire el sobrenadante. Resuspender el pellet celular en uno o dos mililitros de medio de procesamiento PDX. Transfiera una pequeña alícuota entre 50 y 100 microlitros a un tubo y agregue un volumen igual de solución enzimática de disociación para redissociación.Evalúe el número de celda en la suspensión de celda agrupada. Cuente las células con un hemocitoómetro o un contador de células automatizado. Reconstituir las soluciones de hidrogel de ácido hialurónico de acuerdo con las instrucciones del fabricante.Con una pipeta multicanal, añada 50 microlitros de HBSS a todos los pozos en columnas de ventanas de observación de una placa microfluídica de dos carriles para mantener la humedad del cultivo y las condiciones óptimas de imagen. Calcular el volumen de suspensión celular necesario para 50 microlitros de hidrogel a la densidad celular deseada, por ejemplo, 5.000 células por microlitro. Para sembrar una placa microfluídica, aliquot el volumen calculado en cada uno de cuatro tubos estériles de centrífuga de 1,5 mililitros.Ajuste el pH de la solución de tiol HA a ocho con 1 hidróxido de sodio normal inmediatamente antes de su uso. Realice una geleración de prueba mezclando 40 microlitros de HA thiol con 10 microlitros de PEGdA y controlando la gelificación a lo largo del tiempo. A continuación, centrifugar las alícuotas de suspensión celular durante dos minutos a 200 veces G y temperatura ambiente para peletizar las células.Retire con cuidado el sobrenadante y resuspendir las células en 40 microlitros de ha thiol para un volumen final de 50 microlitros. Añadir 10 microlitros de PEGdA a una alícuota de las células de HA thiol. Mezcle bien y espere de uno a tres minutos antes de sembrar la placa microfluídica.Fije una punta para dispensar 1,5 microlitros a una pipeta repetitiva de un solo canal y cargue con las células en la solución de hidrogel HA. Recuerde mantener la alícuota de hidrógeno bien mezclada para asegurar una distribución uniforme de la célula. Para sembrar la placa microfluídica, alinee la punta de la pipeta perpendicular a la hoja mientras coloca suavemente la punta en el centro de la entrada de gel para asegurar el contacto, pero sin presión al dispensar 1,5 microlitros de solución de hidrogel.Observe el estado de llenado de los canales microfluídicos visualizando desde la parte superior de la placa, la parte inferior de la placa o por microscopio. Evalúe la carga utilizando esta figura como guía. Un minuto después de la carga, invierta la placa mientras se prepara para la siguiente alícuota.Repita la siembra de la placa microfluídica para las tres alícuotas restantes de las células en la solución HA. Después de llenar todas las virutas, incubar el plato a 37 grados Centígrados en una incubadora humidificada 45 minutos hasta que se complete la geleración. Después de eso, utilizando el manual proporcionado, asegúrese de que el balancín de perfusión esté instalado en la incubadora de cultivo celular con el ajuste de profusión correcto en ángulo de 14 grados e intervalos de cuatro minutos.Agregue 50 microlitros de medio de cultivo celular PDX a todas las entradas medias. Toque suavemente la placa contra una superficie para animar al líquido a llenar los canales microfluídicos. A continuación, voltee la placa para comprobar si los canales están llenos correctamente.Agregue 50 microlitros de DMEM/F-12 para todos los medios de comunicación. Si alguna burbuja de aire está atrapada en el canal de perfusión, retírela tocando suavemente la placa contra una superficie. Usando un microscopio y una forma de diseño de placa, registre el éxito del llenado de virutas.Excluya las virutas mal rellenadas del uso experimental adicional. Coloque la placa sobre un balancín basculante basculante en una inclinación de 14 grados y un ciclo de cuatro minutos para comenzar la perfusión. Cada dos días, reemplace el medio de cultivo PDX, primero 50 microlitros en las entradas y luego 50 microlitros en las tomas de corriente.En este estudio, se instaló un balancín de perfusión programable en una incubadora de cultivo celular con camisa de agua estándar, y se prepararon cuchillas microfluídicas de dos carriles en un gabinete de bioseguridad estándar para la carga. Se evaluó la viabilidad y morfología del cultivo PDX microfluídico 3D en condiciones separadas por centrifugación de gradiente de densidad y de densidad. En el primer día, aquellos cultivos que se sometieron al método de separación exhibieron diez veces menos células muertas individuales en comparación con cultivos no clasificados.Es importante destacar que los clústeres separados consistían principalmente en celdas vivas. No se identificó ninguna diferencia estadísticamente significativa para la distribución del tamaño del clúster. Los cultivos se mantuvieron aún más en la placa microfluídica durante siete días.El número total de células vivas se mantuvo constante, y los grupos retuvieron aproximadamente el 80% de viabilidad durante la vida del cultivo. Recuerde que cada línea PDX es única, por lo que la facilidad de la digestión tumoral, el tamaño fenotípico y la morfología de los racimos, y la ubicación del clúster dentro de la purificación del gradiente variarán. Los cultivos PDX establecidos con este método se pueden ensayar con ensayos de viabilidad basados en lectores de imágenes o placas, etiquetados fijas e inmunofluorescentes, o disociados para recoger lisatos celulares para otros protocolos.El método permitirá a los investigadores recapitular el microambiente tumoral para explorar la biología o la respuesta farmacológica de las células tumorales. Los usuarios deben completar el entrenamiento estándar de sujetos humanos y la formación de patógenos transmitidos por la sangre antes de trabajar con tejidos derivados del ser humano. Se debe usar el equipo de protección personal adecuado.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

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