Name: enhanced viability for ex vivo 3d hydrogel cultures of patient-derived xenografts in a perfused microfluidic platform
Uploaded: 2020-12-05T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Enhanced Viability for Ex vivo 3D Hydrogel Cultures of Patient-Derived Xenografts in a Perfused Microfluidic Platform at JoVE.com

Detta arbete stöddes av National Institutes of Health National Cancer Institute SBIR fas I (HHSN26120700015C) och P01CA098912.

Tumör vävnad erhölls med patientens samtycke och enligt en godkänd Institutionella Review Board (IRB) protokoll. Xenografts implanterades, odlades och skördades enligt ett accepterat IACUC-protokoll (Institutional Animal Care and Use Committee).
OBS: Allt arbete ska utföras i ett sterilt biologiskt säkerhetsskåp för att bibehålla steriliteten. Alla steg ska genomföras i rumstemperatur om inte annat anges.
1. Beredning av material för PDX-bearbetning
<o...

<ol>
	<li>Jung, J., Seol, H. S., Chang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Generation+and+Application+of+Patient-Derived+Xenograft+Model+for+Cancer+Research.">The Generation and Application of Patient-Derived Xenograft Model for Cancer Research.</a> Cancer Research and Treatment: Official Journal of Korean Cancer Association. 50 (1), 1-10 (2018).</li><li>Malaney, P., Nicosia, S. V., Dave, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One+mouse,+one+patient+paradigm:+New+avatars+of+personalized+cancer+therapy.">One mouse, one patient paradigm: New avatars of personalized cancer therapy.</a> Cancer Letters. 344 (1), 1-12 (2014).</li><li>Meehan, T. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PDX-MI:+Minimal+Information+for+Patient-Derived+Tumor+Xenograft+Models.">PDX-MI: Minimal Information for Patient-Derived Tumor Xenograft Models.</a> Cancer Research. 77 (21), 62-66 (2017).</li><li>Fong, E. L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogel-Based+3D+Model+of+Patient-Derived+Prostate+Xenograft+Tumors+Suitable+for+Drug+Screening.">Hydrogel-Based 3D Model of Patient-Derived Prostate Xenograft Tumors Suitable for Drug Screening.</a> Molecular Pharmaceutics. 11 (7), 2040-2050 (2014).</li><li>Fong, E. L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+3D+in+vitro+model+of+patient-derived+prostate+cancer+xenograft+for+controlled+interrogation+of+in+vivo+tumor-stromal+interactions.">A 3D in vitro model of patient-derived prostate cancer xenograft for controlled interrogation of in vivo tumor-stromal interactions.</a> Biomaterials. 77, 164-172 (2016).</li><li>Engel, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyaluronic+Acid-Based+Hydrogel+Formulations+Suitable+for+Automated+3D+High+Throughput+Drug+Screening+of+Cancer-Stromal+Cell+Cocultures.">Hyaluronic Acid-Based Hydrogel Formulations Suitable for Automated 3D High Throughput Drug Screening of Cancer-Stromal Cell Cocultures.</a> Advanced Healthcare Materials. 4 (11), 1664-1674 (2015).</li><li>Lanz, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapy+response+testing+of+breast+cancer+in+a+3D+high-throughput+perfused+microfluidic+platform.">Therapy response testing of breast cancer in a 3D high-throughput perfused microfluidic platform.</a> BMC Cancer. 17 (1), 709 (2017).</li><li>Wevers, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+compound+evaluation+on+3D+networks+of+neurons+and+glia+in+a+microfluidic+platform.">High-throughput compound evaluation on 3D networks of neurons and glia in a microfluidic platform.</a> Scientific Reports. 6, 38856 (2016).</li><li>Vulto, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phaseguides:+a+paradigm+shift+in+microfluidic+priming+and+emptying.">Phaseguides: a paradigm shift in microfluidic priming and emptying.</a> Lab on a Chip. 11 (9), 1596-1602 (2011).</li><li>Patru, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD133,+CD15/SSEA-1,+CD34+or+side+populations+do+not+resume+tumor-initiating+properties+of+long-term+cultured+cancer+stem+cells+from+human+malignant+glio-neuronal+tumors.">CD133, CD15/SSEA-1, CD34 or side populations do not resume tumor-initiating properties of long-term cultured cancer stem cells from human malignant glio-neuronal tumors.</a> BMC Cancer. 10, 66 (2010).</li><li>Harma, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+panel+of+three-dimensional+models+for+studies+of+prostate+cancer+growth,+invasion+and+drug+responses.">A comprehensive panel of three-dimensional models for studies of prostate cancer growth, invasion and drug responses.</a> PLoS One. 5 (5), 10431 (2010).</li></ol>

Här beskriver vi en metod för bearbetning och odling livskraftiga PDX-härledda tumörceller i en hög genomströmning, perfused 3D-kultur system. Medan detta protokoll utnyttjar PCa PDX vävnad, Det är lika effektivt för andra epitelial-härledda tumörer. Tumör egenskaper varierar mellan enskilda PDX linjer även inom samma vävnad av ursprung (prostata, bröst, etc.). Vissa PCa PDX linjer är mer fibrotisk och svårt att isolera livskraftiga celler från medan andra är mer cellulära. Tumören storlek noteras h?...

Under det senaste årtiondet har området cancerforskning visat förnyad entusiasm för patient-derived xenografts (PDXs) som ett verktyg för att bedöma cancer cellväg beroende och läkemedelskänning1. De vanligaste PDX-modellerna är etablerade genom subkutan eller orthotopic implantation av mänskliga tumörceller-en tumör fragment, ett kluster av dissocierade tumör-härledda celler, eller ett prov av isolerade cirkulerande tumörceller (CTC)-till en gnagare värd. Om tumören "ta" är framgångsrik, xenograft cellerna kommer att föröka sig, vaskulär, och på annat sätt interagera med värdvävnaden för att skapa en tumör, som kan skördas i en optimal storlek, subdivided, och åter implanteras i andra värdar. Bland deras många fördelar som ett modellsystem, PDXs behåller vanligtvis en betydande del av den inhemska tumörcellpopulationens heterogenitet och möjliggör bedömning av human-specifika vägar och cellsvar2,3. In vivo sammanhang möjliggör tumör interaktion med vasculature och andra intilliggande stroma och rekapituler vävnad egenskaper såsom läkemedel diffusion dynamik, syre spänning och extracellulära matris inflytande som biologiskt och mekaniskt inverkan tumör progression. En negativ aspekt av PDXs är deras tillit till en gnagare värd, både för tumör expansion och i slutändan för hypotestestning. Eftersom många PDXs inte kan anpassa sig till traditionella tvådimensionella (2D) kultur på vävnad kultur polystyren utan att förlora många av sina önskvärda egenskaper, har det varit minimal medelväg för forskare mellan denna relativt kontrollerade in vitro-metoden, och den betydande ökningen av kostnader, anläggningar och tidskrav för in vivo PDX användning.
Vi har beskrivit flera in vitro-modeller som implementerar 3D-cellkultur inom en stödjande matris, och nyligen utökat det arbetet med att demonstrera den ex vivo-kulturen av multipel prostatacancer (PCa)-derived PDXs, både ensam och i samkultur med benmärgshärledda fibroblaster4,5. Hyaluronsyra (HA)-baserade hydrogelmatriser ger anpassningsbart och biologiskt relevant stöd för båda celltyperna, med facile kontroll över hydrogelegenskaper och optisk klarhet för avbildning genom hydrogeldjupet6.
Mogna PDX tumör vävnader omfattar en variabel blandning av heterogena mänskliga cancerceller och mus stroma (fibroblaster, endotelceller, etc.). För att studera cell-typ specifika bidrag till tumörprogression in vitro, kan det vara fördelaktigt att dissociate tumörer, separera cellpopulationerna, och experimentellt införliva dem på ett organiserat sätt att dissekera vägar av intercellulär kommunikation. De blandade cellpopulationerna inom vävnadsrentappat har differentiell kompatibilitet med specifika odlingsförhållanden. Till exempel, tumör-associerade fibroblast livskraft kräver antingen yta följsamhet eller 3D matriser funktionaliserade med integrin ligander, medan epitelial-härledda PDX celler inte vanligtvis har dessa krav, i stället gynnar cell-cell interaktioner. Dessa skillnader kan utnyttjas för att uppnå effektiv separation av PDX-celler från förorenande mus stromal celler. Rotationskultur av vävnadsuppspjäll tillåter stromal cell adherence till vävnadskulturens yta medan cell-cell adhesions driver PDX-celler som flyter ovanför den roterande odlingsytan för att bilda flercelliga kluster i supernatanten i 24−48 h. De specifika egenskaperna hos dessa kluster varierar med PDX (t.ex. stora, täta, mycket sfäriska kluster eller mindre, lösare aggregat som liknar druvklasar), men är typiskt av biologiskt relevanta storlekar (50−250 μm diameter), tillräckligt för bedömning av cellulära interaktioner som är beroende av intercellulära kontakter.
Tumör hämtning och bearbetning oundvikligen resulterar i en viss grad av säkerheter celldöd, antingen på grund av kortsiktiga skador från mekaniska/enzymatiska störningar, eller långsiktiga inkompatibilitet av subpopulations med de valda odlingsförhållandena. Trots nyttan av rotation kultur som en inledande bulk separation, döda eller döende celler överförs oundvikligen med PDX kluster och kan påverka den resulterande kulturen. Dessa döda celler är ofta enskilda PDX-celler som inte integrerades i ett kluster, mus stromal fibroblaster som inte kan överleva i utvalda odlingsförhållanden, eller särskilt bräckliga endotelceller. Sådana döende celler kan påverka experimentella resultat från "överlevande" och kan avsevärt påverka kvantifiering, t.ex. För att förbättra urvalet av levande PDX-celler från denna metod anpassade vi centrifugeringsmetoder med densitetssteg för att enkelt avlägsna enskilda döda/döende celler från PDX-blandningar och behålla övervägande levande flercelliga kluster.
För att förbättra studiet av resulterande PDX-härledda kluster i 3D-kultur, vi utnyttjade en microfluidics-baserade perfusion kultur plattform, den OrganoPlate (Figur 1), som är en hög genomströmning organ-på-ett-chip plattform som möjliggör samtidig kultur av upp till 96 enskilda perfunderas, 3D kulturer på en 384-väl mikrotiter plattan-bas (Figur 1A)7,8. I den 2-flik mikrofluidiska plattan, är en enda vävnad chip ansluten med två mikrofluidiska kanaler (Figur 1B, gel kanal: röd, perfusion kanal: blå) som spänner över fyra brunnar i rad. De två mikrofluidiska kanalerna är åtskilda av en kort plast ås kallas en Phaseguide som förhindrar överflöd av en kanal i sin intilliggande granne kanal, och samtidigt möjliggör ett membranfritt gränssnitt mellan innehållet i gelen och perfusion kanal9. Eftersom botten av den mikrofluidiska plattan består av mikroskop-grade glas, kan kulturerna ses i observationsfönstret genom botten av plattan med en standard eller automatiserad mikroskop. Perfusion är etablerad i den mikrofluidiska plattan med en programmerbar vipp, med hjälp av tyngdkraften för att driva media genom de mikrofluidiska kanalerna, mellan reservoar brunnar (Figur 1C). Perfusion flöde-härma närmare rekapituler tumören mikromiljö än statisk kultur, vilket möjliggör införlivande av skjuvning stress och förbättrad fördelning av gaser och näringsämnen. Fördelarna med att upprätthålla en perfunderad cancer cell kultur i mikrofluidic plattan har tidigare beskrivits som perfused bröstcancer kulturer uppvisade optimal livskraft jämfört med en statisk 3D-kultur av samma celler7.
Den föreliggande rapporten beskriver en anpassad densitet gradient centrifugation metod för att isolera levande multicellulära PDX kluster och visar sitt nytta i upprättandet 3D PDX kulturer inom perfusable microfluidic plattor. Eftersom ett ökande antal forskningslaboratorier söker metoder för att underlätta PDX-användning, räknar vi med att de protokoll som presenteras här kommer att vara av omedelbar nytta.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:812px;" width="812">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">1N NaOH</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td style="width:224px;">any suitable tissue culture grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">60 mm round tissue culture dishes</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td>any suitable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">6-well tissue culture plates</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td>any suitable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">70 &#181;m cell strainers</td>
			<td style="width:148px;">Corning</td>
			<td style="width:189px;">431751</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:251px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:148px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:189px;">5810R with suitable rotor and buckets for 15/50 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Density gradient centrifugation solution</td>
			<td style="width:148px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:189px;">P1644</td>
			<td>Percoll</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Dimethylsulfoxide</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td>any suitable tissue culture grade</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Dissociation enzyme solution</td>
			<td style="width:148px;">StemCell Technologies</td>
			<td style="width:189px;">07921</td>
			<td style="width:224px;">ACCUMAX</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">DMEM-F12</td>
			<td style="width:148px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:189px;">11039021</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Forceps</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td>any suitable</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">HA hydrogel kit</td>
			<td style="width:148px;">ESI BIO</td>
			<td style="width:189px;">GS311</td>
			<td style="width:224px;">HyStem (Hyaluronic acid-SH and PEGDA)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Hanks Balanced Salt Solution</td>
			<td style="width:148px;">Lonza</td>
			<td style="width:189px;">10-527F</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Heat-inactivated fetal bovine serum</td>
			<td style="width:148px;">Atlanta Biologicals</td>
			<td style="width:189px;">S11150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Hemocytometer</td>
			<td style="width:148px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:189px;">02-671-51B Hausser BrightLine</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Hoechst 33342</td>
			<td style="width:148px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:189px;">H1398</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Image processing software</td>
			<td style="width:148px;">Oxford Instruments</td>
			<td style="width:189px;">Imaris 9.3</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:251px;">LIVE/DEAD Cell Viability/Cytotoxicity Kit (Calcein-AM/Ethidium Homodimer-1)</td>
			<td style="width:148px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:189px;">L3224</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Microfluidic culture plate</td>
			<td style="width:148px;">Mimetas</td>
			<td style="width:189px;">9603-400-B</td>
			<td>2-lane OrganoPlate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Microscope</td>
			<td style="width:148px;">Nikon</td>
			<td style="width:189px;">A1R</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="68">
			<td height="68" style="height:68px;width:251px;">Multichannel pipette</td>
			<td style="width:148px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:189px;">3125000036</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:251px;">PDX-derived tumor tissue</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td style="width:224px;">obtained under IRB approval for human tissue and IACUC approval for animal host</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Penicillin-streptomycin</td>
			<td style="width:148px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:189px;">15140-122</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Perfusion rocker</td>
			<td style="width:148px;">Mimetas</td>
			<td style="width:189px;">OrganoPlate Perfusion Rocker Mini</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">pH strips (pH 5-9)</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td>any suitable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Phosphate-buffered saline solution</td>
			<td style="width:148px;">Lonza</td>
			<td style="width:189px;">17-516F</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Razor blades</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td>any suitable</td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;width:251px;">Rotating xy-shaker</td>
			<td style="width:148px;">VWR</td>
			<td style="width:189px;">Advanced 3500 Orbital Shaker</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Scalpel handle</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td>any suitable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Single channel repeating pipette</td>
			<td style="width:148px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:189px;">22260201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Sterile, 15mL conical centrifuge tubes</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td>any suitable</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Sterile, 50mL conical centrifuge tubes</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td>any suitable</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

enhanced viability for ex vivo 3d hydrogel cultures of patient-derived xenografts in a perfused microfluidic platform

Patient-härledda xenografts (PDX), som genereras när resected patienten tumör vävnad är engrafted direkt i immunkomprometterade möss, förbli biologiskt stabil, därigenom bevara molekylära, genetiska och histologiska funktioner, samt heterogenitet ursprungliga tumör. Men med hjälp av dessa modeller för att utföra en mängd experiment, inklusive drogscreening, är oöverkomliga både när det gäller kostnad och tid. Tredimensionella (3D) kultursystem ses allmänt som plattformar där cancerceller behåller sin biologiska integritet genom biokemiska interaktioner, morfologi och arkitektur. Vårt team har lång erfarenhet av att kultföra PDX-celler in vitro med hjälp av 3D-matriser som består av hyaluronsyra (HA). För att separera musfibroblast stromal celler i samband med PDXs, använder vi rotationskultur, där stromal celler följer ytan av vävnad kultur-behandlade plattor medan dissociated PDX tumörceller flyta och själv-associera i flercelliga kluster. Också flytande i supernatanten är singel, ofta döda celler, som presenterar en utmaning, i att samla in livsdugliga PDX-klungor för downstream inkapsling in hydrogels för 3D-cellkultur. För att skilja dessa enstaka celler från levande cell kluster, har vi anställd densitet steg gradient centrifugation. Det protokoll som beskrivs här möjliggör utarmning av icke-livskraftiga enstaka celler från den friska populationen av cellkluster som kommer att användas för ytterligare in vitro-experiment. I våra studier införlivar vi 3D-kulturerna i mikrofluidiska plattor som möjliggör mediaperfusion under kulturen. Efter att ha bedömt de resulterande kulturerna med hjälp av en fluorescerande bild-baserade viability assay av renas kontra icke-renas celler, våra resultat visar att denna ytterligare separation steg avsevärt minskat antalet icke-livskraftiga celler från våra kulturer.

En programmerbar perfusionsrocker framställdes i en vanlig vattenkapade cellkultur inkubator, och tvåfiliga mikrofluidiska plattor var beredda i en standard biosäkerhet skåp för lastning (Figur 1). En MDA-PCA-118b PDX tumör utökades in vivo, skördas när den hade nått en maximal storlek, och dissocieras som beskrivs i protokoll avsnitt 2 för att skapa en slurry suspension av celler, vid ungefär en encellig stat (Figur 2A). Den slurry var dispenseras i...

Watch this Scientific Journal Video about Enhanced Viability for Ex vivo 3D Hydrogel Cultures of Patient-Derived Xenografts in a Perfused Microfluidic Platform at JoVE.com

Enhanced Viability for Ex vivo 3D Hydrogel Cultures of Patient-Derived Xenografts in a Perfused Microfluidic Platform

Detta protokoll demonstrerar metoder för att möjliggöra utökad in vitro-kultur av patient-härledda xenografts (PDX). Ett steg förstärker den totala livskraften hos flercelliga klusterkulturer i 3D-hydrogeler, genom okomplicerat avlägsnande av icke-livskraftiga enstaka celler. Ett sekundärt steg visar bästa praxis för PDX-kultur i en perfused mikrofluidisk plattform.

Förbättrad livskraft för Ex vivo 3D Hydrogel Kulturer av patient-derived Xenografts i en Perfused mikrofluidisk plattform

Patient-derived xenografts (PDX), generated when resected patient tumor tissue is engrafted directly into immunocompromised mice, remain biologically ...

Förbättrade odlingsmetoder för patient-härledda tumörprover är kritiskt viktiga när fältet rör sig bort från användningen av konventionella cellinjer. Detta protokoll möjliggör in vitro-kulturen av patient-härledda tumörceller i en plattform som är mottaglig för hög genomströmning och hög innehållslig screening, till skillnad från in vivo cancer modeller. Plattformen innehåller PDXs tillåter oss att bedöma mer heterogena system återspeglar inhemska tumörer.Detta kan ge insikt i läkemedelsmekanismer och möjliggöra snabbare drogscreening. Metoden skulle kunna utvidgas genom införlivandet av stroma, endotelet och immunceller. Dessa samkulturer kan vara ännu mer reflekterande av den inhemska tumörpopulationen och arkitekturen.Öva på att ladda de mikrofluidiska plattorna med lättutbyggda cellinjer för att bli mycket skickliga innan du flyttar till mer värdefulla celler som PDXs. Anpassning under plattan dispensering kraftigt påverkar framgång, och en visuell demonstration kan enkelt förmedla detta koncept. Till att börja med överför tumörvävnad till en förvägd steril 50-milliliter koniska röret.Skölj sex gånger med 30 milliliter steril PBS för att avlägsna blod och föroreningar. Ta bort så mycket vätska som möjligt, och väg tumörvävnaden. Överför tumörvävnaden till en 60-millimeters rund vävnadskulturskål, och använd ett sterilt rakblad eller en skalpell för att finhacka den i en millimeter bitar.Lägg till fem milliliter PDX-bearbetningsmedium för att samla in tumörslammret. Tillsätt fem milliliter dissociation enzymlösning för att samla in tumörslamm. Skölj odlingsfatet med ytterligare fem milliliter av dissociation enzymlösning.Lägg sedan till fem milliliter PDX-bearbetningsmedium. Inkubera 20 minuter vid 37 grader Celsius med varsam skakning. Halvvägs genom inkubationstiden, snurra röret försiktigt.Efter inkubation, pipettera upp och ner försiktigt med en serologisk pipett för att bryta upp klumpar. Placera en 70-mikron cell sil över en ny steril 50-milliliter rör, och filtrera cellerna. Sedan centrifugera vid 1, 200 rpm i två minuter för att pelleta cellerna.Ta bort supernatanten och resuspend i två till tre milliliter av PDX odlingsmedium. Räkna cellerna med hjälp av en hemocytometer eller automatiserad cellräknare. Använd den här tabellen för att uppskatta det erforderliga antalet av de associerade PDX-härledda cellerna som behövs för att uppnå önskad celltäthet per chip.Plate en till två gånger 10 till de sex cellerna i fem milliliter PDX kultur medium per brunn av en sex-väl vävnad kultur tallrik. Inkubera i 48 timmar vid 37 grader Celsius, 5%koldioxid och 95%luftfuktighet med mild skakning vid 50 till 55 rpm för att främja klusterbildning. Efter att klustren har bildats fortsätter du till centrifugeringen.Först förbereda 20 milliliter av 100%densitet gradient lösning genom att noggrant blanda 18 milliliter densitet gradient centrifugerlösning med två milliliter steril 10X HBSS i en steril 50-milliliter konaltrör. Späd denna 100%-lösning med steril 1X HBSS för att göra 10 milliliter vardera av 20%30%40%och 55%densitet gradient lösningar. Lägg till tre milliliter av 55%densitet gradient lösning till botten av en 15-milliliter koniska röret.Hålla röret i en vinkel, långsamt dispensera tre milliliter av 40%densitet gradient lösning på den vinklade sidan av röret och ovanpå 55%skikt. Upprepa med 30%densitetsgradientlösningen. Samla sedan supernatanten av PDX-rotationskulturer med en fem milliliter serologisk pipett i ett rör, skölja plattans yta försiktigt.Centrifugera vid 1, 200 rpm i två minuter till pelletsceller. Ta bort supernatanten och återanvänd cellpelleten i tre milliliter av 20%densitetsgradientlösning. Försiktigt lager 20%densitet gradient lösning med celler på toppen av övertoning i 15-milliliter röret.Cap rören och centrifug i en sväng-hink rotor centrifug 30 minuter vid fyra grader Celsius, 2, 000 gånger G, och noll paus. Efter centrifugeringen syns fraktioner. Livskraftiga PDX cellkulturer finns vanligtvis på 40 till 55%densitet gradient lösningsgränssnitt.Samla in två till tre milliliter av varje fraktion i färska 15-milliliter rör. Tillsätt tre till fyra volymer av steril 1X HBSS till varje fraktion, och invertera för att blanda noggrant. Centrifugera vid 1, 000 gånger G i tre minuter för att pelleta cellerna.Ta bort supernatanten. Resuspend cell pelleten i en till två milliliter av PDX bearbetning medium. Överför en liten alikvot mellan 50 till 100 mikroliter till ett rör, och tillsätt en lika stor volym av dissociation enzymlösning för redissociation.Bedöma cellnumret i den grupperade cellupphängningen. Räkna cellerna med en hemocytometer eller automatiserad cellräknare. Rekonstruerade hyaluronsyrahydrogellösningar enligt tillverkarens anvisningar.Med hjälp av en flerkanalspipett, tillsätt 50 mikroliter av HBSS till alla brunnar i observationsfönsterkolumner av en tvåfilig mikrofluidisk platta för att bibehålla luftfuktighetens fuktighet och optimala bildförhållanden. Beräkna volymen av cellfjädring som behövs för 50 mikroliter hydrogel vid önskad celltäthet, till exempel 5, 000 celler per mikroliter. För sådd en mikrofluidisk platta, alikvotera den beräknade volymen i var och en av fyra sterila 1,5-milliliter centrifugrör.Justera pH-värdet för HA-thiol-lösningen till åtta med 1 normal natriumhydroxid omedelbart före användning. Utför en testgelation genom att blanda 40 mikroliter av HA-thiol med 10 mikroliter PEGdA och övervakningsgelation över tid. Därefter centrifug cellen suspension alikvoter i två minuter vid 200 gånger G och rumstemperatur för att pellet cellerna.Ta försiktigt bort supernatanten, och resuspend cellerna i 40 mikroliter ha tioler för en 50-microliter slutlig volym. Tillsätt 10 mikroliter av PEGdA till en alikvot av cellerna i HA-thiol. Blanda väl, och vänta en till tre minuter innan seedning av mikrofluidiska plattan.Fäst ett tips för dispensering av 1,5 mikroliter till en enkanalig upprepande pipetter, och ladda med cellerna i HA hydrogellösning. Kom ihåg att hålla väte alikvoten välblandad för att säkerställa jämn cellfördelning. För att så den mikrofluidiska plattan, rikta pipettens spets vinkelrätt mot bladet samtidigt som spetsen försiktigt placeras i mitten av gelinloppet för att säkerställa kontakt men inget tryck vid dispensering av 1,5 mikroliter hydrogellösning.Observera påfyllningsstatus för de mikrofluidiska kanalerna genom att visa från plattans överkant, plattans botten eller med mikroskop. Bedöm inläsningen med hjälp av denna figur som vägledning. En minut efter lastningen, invertera plattan medan du förbereder för nästa alikvot.Upprepa sådd av mikrofluidic plattan för de återstående tre alikvoter av celler i HA-lösning. Efter alla chips är fyllda, inkubera plattan vid 37 grader Celsius i en befuktad inkubator 45 minuter tills gelationen är klar. Därefter, med hjälp av den medföljande handboken, se till att perfusionsrockern är installerad i cellodlingsinkubatorn med korrekt profusionsinställning med 14 graders vinkel och fyraminutersintervall.Lägg till 50 mikroliter av PDX-cellodlingsmedium till alla medelspannare. Knacka försiktigt plattan mot en yta för att uppmuntra vätskan att fylla mikrofluidiska kanaler. Vänd sedan på plattan för att kontrollera om kanalerna är fyllda ordentligt.Lägg till 50 mikroliter av DMEM/F-12 för alla medier. Om några luftbubblor är instängda i perfusionskanalen, avlägsna genom skonsam gängning av plattan mot en yta. Med hjälp av ett mikroskop och platta layout form, spela in chip fyllning framgång.Uteslut felaktigt fyllda marker från ytterligare experimentell användning. Placera plattan på en lutande vipp som till en 14-graders lutning och en fyra minuters cykel för att börja perfusion. Varannan dag, byt PDX odlingsmedium, första 50 mikroliter i inloppen, sedan 50 mikroliter i uttagen.I denna studie installerades en programmerbar perfusionsrocker i en vanlig vattenmantlar cellkultur inkubator, och tvåfiliga mikrofluidiska blad utarbetades i en standard biosäkerhet skåp för lastning. 3D mikrofluidic PDX kultur livskraft och morfologi utvärderades i både oseparerade och densitet-gradient centrifugation-separerade villkor. På dag ett uppvisade de kulturer som genomgick separationsmetoden tiofaldigt färre enstaka döda celler jämfört med oseparerade kulturer.Viktigt, bestod de separerade kluster främst av levande celler. Ingen statistiskt signifikant skillnad identifierades för klusterstorleksfördelningen. Kulturer upprätthölls ytterligare i mikrofluidic plattan i sju dagar.Det totala antalet levande celler förblev konsekvent, och kluster behöll cirka 80%livskraft över kulturens livslängd. Kom ihåg att varje PDX linje är unik, så den enkla tumör matsmältningen, den fenotypiska storlek och morfologi av kluster, och klustrets plats inom toningsrening kommer att variera. PDX kulturer som fastställts med hjälp av denna metod kan analyseras med bild-eller plattan-läsare-baserade viability assays, fast och immunofluorescently märkt, eller dissociated att samla in cell lysates för andra protokoll.Metoden gör det möjligt för forskare att rekapitulera tumörmikroeviromen för att utforska biologi eller läkemedelsrespons av tumörceller. Användare bör slutföra standard mänskliga ämnen utbildning och blodburna patogener utbildning innan du arbetar med mänskliga-härledda vävnader. Lämplig personlig skyddsutrustning bör användas.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Labeling of Breast Cancer Patient-derived Xenografts with Traceable Reporters for Tumor Growth and Metastasis Studies

Märkning av bröstcancerpatient som härrör xenografter med spår Reportrar för tumörtillväxt och metastas studier

The use of preclinical models to study tumor biology and response to treatment is central to cancer research. Long-established human cell lines, and many ...

Isolation and Characterization of Tumor-initiating Cells from Sarcoma Patient-derived Xenografts

Isolering och karakterisering av tumör-initiera celler från sarkom patient-derived xenografts

The existence and importance of tumor-initiating cells (TICs) have been supported by increasing evidence during the past decade. These TICs have been ...

Fluorescence Molecular Tomography for In Vivo Imaging of Glioblastoma Xenografts

Fluorescence Molecular Tomography for In Vivo Imaging of Glioblastoma Xenografts

Fluorescens molekylär tomografi för In Vivo Imaging av Glioblastoma xenograft

Tumorigenicity is the capability of cancer cells to form a tumor mass. A widely used approach to determine if the cells are tumorigenic is by injecting ...

Patient-derived Heterogeneous Xenograft Model of Pancreatic Cancer Using Zebrafish Larvae as Hosts for Comparative Drug Assessment

Patient-derived heterogena xenograft modell av pankreascancer med Zebrafish larver som värdar för jämförande drog bedömning

Patient-derived tumor xenograft (PDX) and cell-derived tumor xenograft (CDX) are important techniques for preclinical assessment, medication guidance and ...

Physiologic Patient Derived 3D Spheroids for Anti-neoplastic Drug Screening to Target Cancer Stem Cells

Fysiologisk patient härledda 3D spheroids för anti-neoplastisk drog screening för att rikta cancer stamceller

In this protocol, we outline the procedure for generation of tumor spheroids within 384-well hanging droplets to allow for high-throughput screening of ...

Assessing Cell Viability and Death in 3D Spheroid Cultures of Cancer Cells

Bedömning cell livs kraft och död i 3D Sfäroiden kulturer av cancer celler

Three-dimensional spheroids of cancer cells are important tools for both cancer drug screens and for gaining mechanistic insight into cancer cell biology. ...

Establishment of Gastric Cancer Patient-derived Xenograft Models and Primary Cell Lines

Inrättande av patienter med Ventrikelhärledd xenograft-modell och primära cellinjer

The use of preclinical models to advance our understanding of tumor biology and investigate the efficacy of therapeutic agents is key to cancer research. ...

Testing Targeted Therapies in Cancer using Structural DNA Alteration Analysis and Patient-Derived Xenografts

Testa riktade terapier i cancer med strukturell DNA-ändringsanalys och patientbaserade Xenografts

We present here an integrative approach for testing efficacy of targeted therapies that combines the next generation sequencing technolo-gies, therapeutic ...

Drug Screening of Primary Patient Derived Tumor Xenografts in Zebrafish

Läkemedelsscreening av primär patient härledd tumör Xenografts i Zebrafish

Patient derived xenograft models are critical in defining how different cancers respond to drug treatment in an in vivo system. Mouse models are the ...

Patient-Derived Tumor Explants As a "Live" Preclinical Platform for Predicting Drug Resistance in Patients

Patient-härledda tumör explanter som en "levande" preklinisk plattform för att förutsäga läkemedelsresistens hos patienter

An understanding of drug resistance and the development of novel strategies to sensitize highly resistant cancers rely on the availability of suitable ...