Name: opsono-adherence assay to evaluate functional antibodies in vaccine development against bacillus anthracis and other encapsulated pathogens
Uploaded: 2020-05-19T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Opsono-Adherence Assay to Evaluate Functional Antibodies in Vaccine Development Against Bacillus anthracis and Other Encapsulated Pathogens at JoVE.com

J. Chua, D. Chabot et A. Friedlander ont conçu les procédures décrites dans le manuscrit. J. Chua et T. Putmon-Taylor ont effectué les expériences. D. Chabot a effectué une analyse des données. J. Chua a écrit le manuscrit.
Les auteurs remercient Kyle J. Fitts pour son excellente assistance technique.
Le travail a été soutenu par la subvention de l’Agence de réduction des menaces de défense CBM. VAXBT.03.10.RD.015, numéro de plan 921175.
Les opinions, interprétations, conclusions et recommandations sont celles des auteurs et ne sont pas nécessairement approuvées par l’armée américaine. Le contenu de cette publication ne reflète pas nécessairement les points de vue ou les politiques du département de la Défense, et la mention de noms commerciaux, de produits commerciaux ou d’organisations n’implique pas nécessairement l’approbation du gouvernement des États-Unis.

Conformément à la Loi sur le bien-être des animaux, à la politique du Service de santé publique et à d’autres lois et règlements fédéraux relatifs aux animaux et aux expériences impliquant des animaux, la recherche décrite ici a été menée en vertu d’un protocole approuvé par le Comité des soins et de l’utilisation des animaux en établissement. L’établissement où cette recherche a été menée est accrédité par l’Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care, Interna...

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Les vaccins à base de capsules se sont montrés efficaces contre de nombreux agents pathogènes bactériens, et beaucoup sont homologués pour uneutilisation chez l’homme 25,26,27. Ces vaccins fonctionnent en générant des anticorps ciblant la capsule et beaucoup de ces études utilisent l’OPKA pour montrer les fonctions opsono-phagocytiques des anticorps13,14...

La reconnaissance, l’adhérence, l’internalisation et la dégradation d’un agent pathogène font partie intégrante de la phagocytose1, une voie saillante dans la réponse immunitaire innée de l’hôte décrite pour la première fois par Ilya Metchnikoff en 18832,3. Les leucocytes phagocytiques, ainsi que d’autres cellules du système immunitaire, sont très discriminatoires dans leur sélection des cibles; ils sont capables de faire la distinction entre le « non-soi infectieux » et le « soi non infectieux » par des modèles moléculaires associés à l’agent pathogène par leur répertoire de récepteurs de reconnaissance des motifs (PRR)4,5. La reconnaissance par l’hôte d’un agent pathogène peut également se produire avec la liaison des opsonines hôtes, comme le complément et lesanticorps 6. Ce processus, appelé opsonisation, enrobe l’agent pathogène de ces molécules, améliorant l’internalisation en se liant aux récepteurs opsoniques (p. ex., récepteurs de complément et de Fc) sur les cellules phagocytiques6. Pour qu’un agent pathogène adhère à un phagocyte, la liaison collective de récepteurs multiples avec leurs ligands cognate est nécessaire. Ce n’est qu’alors que l’adhérence peut déclencher et soutenir des cascades de signalisation à l’intérieur de la cellule hôte pour initier l’internalisation6.
En raison de l’importance de la phagocytose dans le dégagement des agents pathogènes et la prévention de l’infection, les agents pathogènes extracellulaires ont développé de nombreuses façons de subvertir ce processus pour prolonger leur survie. Une stratégie d’importance est la production d’une capsule anionique polymérique (p. ex., polysaccharide ou acide polyamino) qui est anti-phagocytique en raison de sa charge, est mal immunogène, et protège les molécules sur l’enveloppe bactérienne des PRR6,7. Des agents pathogènes tels que cryptococcus néoformans et streptocoques pneumoniae ont des capsules composées de polymères saccharides, tandis que Staphylococcus epidermidis et certaines espèces de Bacillus produisent de l’acide poly-ɣ-glutamique (PGGA)7,8. Pourtant, d’autres agents pathogènes produisent des capsules qui ressemblent à l’auto non infectieuse. Par exemple, Streptococcus pyogenes et une souche pathogène de B. cereus ont une capsule d’acide hyaluronique qui est non seulement anti-phagocytique, mais qui peut également ne pas être reconnu comme étranger par le système immunitaire9,10.
La conjugaison de la capsule en protéines porteuse les convertit à partir d’antigènes pauvres et indépendants en T hautement immunogènes dépendants des antigènes qui peuvent induire des titres anticorps anti-capsule sériquesélevés 11,12. Cette stratégie est utilisée pour les vaccins homologués contre S. pneumoniae, Haemophilus influenzaeet Neisseria meningitides11. Les activités opsoniques des anticorps anti-capsules ont généralement été évaluées par des analyses de mise à mort opsono-phagocytiques (OPKA)13,14,15,16. Ces analyses testent si les anticorps fonctionnels peuvent déclencher la phagocytose et tuer14. Toutefois, l’utilisation de l’OPKA avec des agents pathogènes infectieux, tels que les agents et toxines biologiques de niveau 1 (BSAT), y compris B. anthracis17,est dangereuse et présente des risques pour la sécurité; ces analyses nécessitent une manipulation approfondie d’un agent sélectionné. La manipulation d’agents sélectionnés ne peut se faire que dans des laboratoires restreints de niveau 3 (BSL-3); les travaux dans ces domaines exigent des procédures d’exploitation prolongées en raison des nombreuses précautions de sécurité qui doivent être suivies. Les laboratoires BSL-3 ne sont généralement pas équipés de l’équipement spécialisé utilisé pour le travail opka, comme les microscopes et les cytomètres. Ainsi, nous avons développé un essai alternatif basé sur l’utilisation de bactéries inactivées18,19. Nous appelons cela un essai opsono-adhérence (OAA) qui ne dépend pas de l’internalisation et de tuer comme sorties d’analyse; au lieu de cela, l’adhérence des agents pathogènes inactivés opsonized est employée comme index de phagocytosis. Mécaniquement, oaa est un substitut approprié parce que l’adhérence se produit a priori et est intimement liée à l’internalisation et à la mise à mort intracellulaire. Du point de vue de la biosécurité, l’OAA est préférable parce qu’elle nécessite une manipulation minimale d’un agent infectieux, est expérimentalement de plus courte durée que l’OPKA et peut être effectuée dans les laboratoires BSL-2 après qu’un stock de l’agent pathogène inactivé a été produit et transféré.
Nous démontrons l’utilisation de l’OAA pour examiner la fonction opsonique des anticorps anti-capsules trouvés dans sera des primates non humains (NHPs) vaccinés avec une capsule conjuguée [c.-à-PGGA de B. anthracis conjugué au complexe de protéine de membrane externe (OMPC) des méningitides de Neisseria]20. Des bacilles opsonized de sérum ont été incubés avec une ligne adhérente de cellules de macrophage de souris, RAW 264.7. Après fixation, le monocouche cellulaire et les bacilles adhérents ont été photographiés par microscopie de fluorescence. L’adhérence bactérienne a augmenté quand les bacilles ont été incubés avec le sérum des NHPs vaccinés avec le conjugué de capsule comparé au sérumde contrôle 20. L’adhérence est corrélée avec la survie du défi anthrax20,21. Ainsi, l’utilisation de l’OAA a caractérisé la fonction des anticorps anti-capsule et a grandement facilité l’essai de notre candidat de vaccin.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1520px;" width="1520">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:380px;">0.20 &#181;m syringe filter (25mm, regenerated cellulose)</td>
			<td style="width:483px;">Corning, Corning, NY</td>
			<td style="width:267px;">431222</td>
			<td style="width:391px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">10 mL syringe (Luer-Lok tip)</td>
			<td>BD, Franklin Lakes, NJ</td>
			<td>302995</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">15&#181; 96 well black plates (plate #1 for imaging)</td>
			<td>In Vitro Scientific, Sunnyvale, CA</td>
			<td>P96-1-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">16% paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Science, Hatfield, PA</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">75 cm sq. tissue culture treated flask</td>
			<td>Corning, Corning, NY</td>
			<td>430641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Agar (powder)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>A1296</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Baby Rabbit Complement</td>
			<td>Cedarlane Labs, Burlington, NC</td>
			<td>CL3441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bacto Yeast Extract</td>
			<td>BD, Sparks, MD</td>
			<td>288620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">BBL Brain Heart Infusion (BHI)</td>
			<td>BD, Sparks, MD</td>
			<td>211059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Blood Agar (TSA with Sheep Blood) plates</td>
			<td>Remel, Lenexa, KS</td>
			<td>R01198</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cell scraper</td>
			<td>Sarstedt, Newton, NC</td>
			<td>83.183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Costar 96 well cell culture plates (plates #2 &#38; 3 for dilutions)</td>
			<td>Corning, Corning, NY</td>
			<td>3596</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cover glass</td>
			<td>Electron Microscopy Science, Hatfield, PA</td>
			<td>72200-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Difco Nutrient Broth</td>
			<td>BD, Sparks, MD</td>
			<td>234000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose</td>
			<td>Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>11965-092</td>
			<td>contains 4500 mg/L glucose, 4 mM L-glutamine, Phenol Red</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EVOS FL Auto Cell Imaging System (fluorescence microscope)</td>
			<td>Life Technologies, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>AMAFD1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Hyclone, GE Healthcare Life Sciences, South Logan, UT</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td>not gamma irradiated, not heat inactivated</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fluorescein isothiocyanate</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>F143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HCS Cell Mask Orange Cell Stain</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>H32713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">hemocytometer (Improved Neubauer)</td>
			<td>Hausser Scientific, Horsham, PA</td>
			<td>3900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">India Ink solution</td>
			<td>BD, Sparks, MD</td>
			<td>261194</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">L- glutamine (200 mM)</td>
			<td>Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham MA</td>
			<td>25030081</td>
			<td>supplement medium with additional 2mM L-glutamine</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nikon Eclipse TE2000-U (inverted compound microscope)</td>
			<td>Nikon Instruments, Melville, NY</td>
			<td>TE2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PBS without Calcium or Magnesium</td>
			<td>Lonza, Walkersville, MD</td>
			<td>17-516F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Penicillin-Streptomycin Solution, 100x</td>
			<td>Hyclone, GE Healthcare Life Sciences, South Logan, UT</td>
			<td>SV30010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">petri dishes (100 x 15 mm)</td>
			<td>Falcon, Corning, Durham, NC</td>
			<td>351029</td>
			<td>for agar plates</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RAW 264.7 macrophage cell line (Tib47)</td>
			<td>ATCC, Manassas, VA</td>
			<td>ATCC TIB-71</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Slides</td>
			<td>VWR, Radnor, PA</td>
			<td>16004-422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trypan Blue Solution (0.4%)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Zeiss 700 Laser Scanning Microscopy (confocal microscope)</td>
			<td>Carl Zeiss Microimaging, Thornwood, NY</td>
			<td>4109001865956000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

opsono-adherence assay to evaluate functional antibodies in vaccine development against bacillus anthracis and other encapsulated pathogens

L’essai d’opsono-adhérence est un essai fonctionnel qui énumère l’attachement des pathogènes bactériens aux phagocytes professionnels. Puisque l’adhérence est nécessaire à la phagocytose et à la mise à mort, l’essai est une méthode alternative aux analyses opsono-phagocytiques de mise à mort. Un avantage de l’essai d’opsono-adhérence est l’option d’utiliser des agents pathogènes inactivés et des lignées cellulaires de mammifères, qui permet la normalisation à travers plusieurs expériences. L’utilisation d’un agent pathogène inactivé dans l’analyse facilite également le travail avec des agents infectieux de niveau 3 de biosécurité et d’autres agents pathogènes virulents. Dans nos travaux, l’essai d’opsono-adhérence a été employé pour évaluer la capacité fonctionnelle des anticorps, du sera des animaux vaccinés avec un vaccin à base de capsule d’anthrax, pour induire l’adhérence des anthracis fixes de Bacillus à une lignée cellulaire de macrophage de souris, RAW 264.7. La microscopie automatisée de fluorescence a été employée pour capturer des images des bacilles adhérant aux macrophages. L’adhérence accrue a été corrélée avec la présence des anticorps d’anti-capsule dans le sérum. Les primates non humains qui présentaient des concentrations élevées d’anticorps anti-capsules sériques ont été protégés contre le défi de l’anthrax. Ainsi, l’essai d’opsono-observance peut être employé pour élucider les fonctions biologiques des anticorps spécifiques d’antigène dans sera, pour évaluer l’efficacité des candidats de vaccin et d’autres thérapeutiques, et pour servir de corrélation possible de l’immunité.

Cette section montre des micrographes représentatifs recueillis au cours d’une expérience de l’OAA ainsi que des résultats montrant que l’OAA peut être utilisé pour examiner la fonction biologique des anticorps. Ici, l’analyse a été utilisée avec succès pour évaluer l’efficacité d’un candidat vaccin contre l’anthrax. Il est essentiel de vérifier l’état de l’encapsulation sur les bacilles que peu ou pas d’encapsulation les amène à adhérer aux cellules hôtes, produisant un fond élevé....

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Opsono-Adherence Assay to Evaluate Functional Antibodies in Vaccine Development Against Bacillus anthracis and Other Encapsulated Pathogens

L’essai d’opsono-adhérence est une méthode alternative à l’essai opsono-phagocytic de tuer pour évaluer les fonctions opsonic des anticorps dans le développement de vaccin.

Opsono-Adherence Test pour évaluer les anticorps fonctionnels dans le développement de vaccins contre les anthracis Bacillus et autres pathogènes encapsulés

The opsono-adherence assay is a functional assay that enumerates the attachment of bacterial pathogens to professional phagocytes. Because adherence is ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Opsono-Adherence Assay to Evaluate Functional Antibodies in Vaccine Development Against Bacillus anthracis and Other Encapsulated Pathogens

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Passive Administration of Monoclonal Antibodies Against H. capsulatum and Others Fungal Pathogens

L&#39;administration passive d&#39;anticorps monoclonaux contre H. capsulatum Et autres pathogènes fongiques

The purpose of the use of this methodology is 1) to advance our capacity to protect individuals with antibody or vaccine for preventing or treating ...

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