Name: a mouse model of incompletely resected soft tissue sarcoma for testing (neo)adjuvant therapies
Uploaded: 2020-07-28T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Mouse Model of Incompletely Resected Soft Tissue Sarcoma for Testing Neoadjuvant Therapies at JoVE.com

Este trabalho é apoiado por subsídios do Sock-lo para Sarcoma! Fundação, Associação Australiana e Neozelandesa de Sarcoma, Fundação de Pesquisa em Leucemia Infantil e Câncer e Filantropia Perpétua. W.J.L é apoiado por uma Bolsa Simon Lee e uma bolsa de pesquisa do Conselho Nacional de Saúde e Pesquisa Médica, e do Cancer Council WA.

Os animais utilizados nesses experimentos foram obtidos do Centro de Recursos Animais (Perth, Austrália Ocidental). Os animais foram mantidos sob condições padrão sem patógenos no Harry Perkins Institute of Medical Research Bioresources North Facility (Perth, Austrália Ocidental). Todos os experimentos foram realizados seguindo o protocolo aprovado pelo Comitê de Ética Animal do Instituto Harry Perkins de Pesquisa Médica. Foram utilizados camundongos BALB/c de 8 a 12 semanas de idade nesses experimentos. A linha...

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	<li>Orosco, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positive+Surgical+Margins+in+the+10+Most+Common+Solid+Cancers.">Positive Surgical Margins in the 10 Most Common Solid Cancers.</a> Scientific Reports. 8 (1), 5686 (2018).</li><li>Haas, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perioperative+Management+of+Extremity+Soft+Tissue+Sarcomas.">Perioperative Management of Extremity Soft Tissue Sarcomas.</a> Journal of Clinical Oncology. 36 (2), 118-124 (2018).</li><li>Brennan, M. F., Antonescu, C. 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D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+surgical+models+of+postoperative+tumor+recurrence+for+preclinical+adjuvant+therapy+assessment.">Characterization of surgical models of postoperative tumor recurrence for preclinical adjuvant therapy assessment.</a> American Journal of Translational Research. 4 (2), 206-218 (2012).</li><li>Talmadge, J. E., Singh, R. K., Fidler, I. 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D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+positive-margin+resection+model+recreates+the+postsurgical+tumor+microenvironment+and+is+a+reliable+model+for+adjuvant+therapy+evaluation.">A positive-margin resection model recreates the postsurgical tumor microenvironment and is a reliable model for adjuvant therapy evaluation.</a> Cancer Biology &amp; Therapy. 13 (9), 745-755 (2012).</li><li>Tsukamoto, A., Serizawa, K., Sato, R., Yamazaki, J., Inomata, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vital+signs+monitoring+during+injectable+and+inhalant+anesthesia+in+mice.">Vital signs monitoring during injectable and inhalant anesthesia in mice.</a> Experimental Animals. 64 (1), 57-64 (2015).</li><li>Overwijk, W. W., Restifo, N. 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G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extended+release+of+perioperative+immunotherapy+prevents+tumor+recurrence+and+eliminates+metastases.">Extended release of perioperative immunotherapy prevents tumor recurrence and eliminates metastases.</a> Science Translational Medicine. 10 (433), (2018).</li><li>Tai, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+tumor+model+of+surgical+stress+to+explore+the+mechanisms+of+postoperative+immunosuppression+and+evaluate+novel+perioperative+immunotherapies.">A mouse tumor model of surgical stress to explore the mechanisms of postoperative immunosuppression and evaluate novel perioperative immunotherapies.</a> Journal of Visualized Experiments. (85), e51253 (2014).</li><li>Gast, C. E., Shaw, A. K., Wong, M. H., Coussens, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surgical+Procedures+and+Methodology+for+a+Preclinical+Murine+Model+of+De+Novo+Mammary+Cancer+Metastasis.">Surgical Procedures and Methodology for a Preclinical Murine Model of De Novo Mammary Cancer Metastasis.</a> Journal of Visualized Experiments. (125), (2017).</li><li>Qiu, W., Su, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+orthotopic+pancreatic+tumor+mouse+models.">Development of orthotopic pancreatic tumor mouse models.</a> Methods in Molecular Biology. 980, 215-223 (2013).</li><li>Erstad, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orthotopic+and+heterotopic+murine+models+of+pancreatic+cancer+and+their+different+responses+to+FOLFIRINOX+chemotherapy.">Orthotopic and heterotopic murine models of pancreatic cancer and their different responses to FOLFIRINOX chemotherapy.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 11 (7), (2018).</li></ol>

Fornecemos um protocolo para um modelo de rato de ressecção cirúrgica incompleta de sarcoma de tecido mole para testar terapias peri-operatórias. Também padronizamos a incisão cirúrgica para permitir a avaliação da cicatrização de feridas entre camundongos após o tratamento.
A colocação do tumor é uma parte importante deste protocolo. Optamos por um modelo de tumor subcutâneo para permitir fácil acesso cirúrgico ao local do tumor e administração de terapias locais com carga...

A cirurgia continua sendo a principal opção de tratamento para muitos tumores sólidos1, incluindo sarcoma de tecido mole2,3. Apesar das melhorias nas técnicas de cirurgia oncológica e das combinações com terapias (neo)adjuvantes, ainda há um alto risco de recaída e metástase após a ressecção do tumor primário4,5. No sarcoma de tecido mole, as recaídas ocorrem particularmente locoregionalmente, no local da cirurgia, resultando em aumento da morbidade e mortalidade. No cenário clínico, pode ser difícil obter margens largas o suficiente (por exemplo, devido a restrições anatômicas), resultando em ressecção incompleta e recorrência do tumorsubsequente 6. O estresse cirúrgico e o processo subsequente de cicatrização da ferida são conhecidos por criar um microambiente tumoral imunossupressor favorável à recidiva do tumor7,8. Portanto, a descoberta e o desenvolvimento de novas terapias para sarcoma de tecido mole, particularmente imunoterápicos, devem levar em conta a resposta de cicatrização da ferida cirúrgica.
A maioria dos estudos pré-clínicos para terapias adjuvantes são inicialmente realizados utilizando modelos subcutâneos sintéticos ou xenotransplant mouses, sem incorporar o estresse cirúrgico e a resposta de cicatrização da ferida9,,10. Por isso, desenvolvemos um modelo de sarcoma de tecido mole subcutâneo síndico contendo ressecção cirúrgica incompleta. AS células de fibrosarcoma WEHI 164 são inoculadas subcutâneas, e uma vez estabelecidas as tumores, removemos 50-75% do volume tumoral(Figura 1A-E). Tumores consistentemente re-crescer do tumor restante. Este modelo permite testar terapias adjuvantes, considerando o efeito do estresse cirúrgico e da cicatrização das feridas. Modelos cirúrgicos semelhantes de ressecção incompleta têm sido utilizados em uma série de estudos por diversos grupos e constatados ser reprodutíveis e eficazes11,,12,13. Aqui, fornecemos uma descrição detalhada deste protocolo.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>26 gauge 0.5 mL insulin syringe</td>
			<td>Becton Dickinson, Australia</td>
			<td>326769</td>
			<td>None</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Life Technologies Australia Pty Ltd</td>
			<td>21985023</td>
			<td>None</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anaestetic gas machine</td>
			<td>Darvall Vet, Australia</td>
			<td>SKU: 2848</td>
			<td>None</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CTLA-4</td>
			<td>BioXcell, USA</td>
			<td>BE0164</td>
			<td>None</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-PD-1</td>
			<td>BioXcell, USA</td>
			<td>BP0273</td>
			<td>None</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine Hydrochloride Injection, 0.3mg/mL</td>
			<td>RB healthcare UK Limited, UK</td>
			<td>55175</td>
			<td>Prescription order</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlorhexidine Surgical Scrub 4%</td>
			<td>Perigo Australia, Australia</td>
			<td>CHL01449F(scrub</td>
			<td>None</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine serum</td>
			<td>CellSera, Australia</td>
			<td>AU-FBS-PG</td>
			<td>None</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps Fine 10.5 cm</td>
			<td>Surgical house, Western Australia</td>
			<td>CC74110</td>
			<td>None</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps Fine 12 cm Serrated</td>
			<td>Surgical house, Western Australia</td>
			<td>CC74212</td>
			<td>None</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps Halsted 14 cm</td>
			<td>Surgical house, Western Australia</td>
			<td>CD01114</td>
			<td>None</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating chamber</td>
			<td>Datesand Ltd, UK</td>
			<td>Mini-Thermacage</td>
			<td>None</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1M)</td>
			<td>Life Technologies Australia Pty Ltd</td>
			<td>15630080</td>
			<td>None</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Henry Schein Animal Health, Australia</td>
			<td>SKU: 29405</td>
			<td>Prescription order</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lubricating Eye Ointment</td>
			<td>Alcon</td>
			<td>n/a</td>
			<td>None</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin 1000X</td>
			<td>Life Technologies Australia Pty Ltd</td>
			<td>15140122</td>
			<td>None</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Solution 10x</td>
			<td>Life Technologies Australia Pty Ltd</td>
			<td>70013-032</td>
			<td>None</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reflex 7mm Clips</td>
			<td>Able scientific, Australia</td>
			<td>AS59038</td>
			<td>None</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reflex 7mm Wound Clip Applicator</td>
			<td>Able scientific, Australia</td>
			<td>AS59036</td>
			<td>None</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reflex Wound Clip Remover</td>
			<td>Able scientific, Australia</td>
			<td>AS59037</td>
			<td>None</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rodent Qube Anesthesia Breathing Circuit</td>
			<td>Darvall Vet, Australia</td>
			<td>#7885</td>
			<td>None</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium + L-glutamine</td>
			<td>Life Technologies Australia Pty Ltd</td>
			<td>21870092</td>
			<td>None</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors Iris STR 11 cm</td>
			<td>Surgical house, Western Australia</td>
			<td>KF3211</td>
			<td>None</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors Iris STR 9 cm</td>
			<td>Surgical house, Western Australia</td>
			<td>JH4209</td>
			<td>None</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small Induction Chamber</td>
			<td>Darvall Vet, Australia</td>
			<td>SKU: 9630</td>
			<td>None</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE express 1x</td>
			<td>Life Technologies Australia Pty Ltd</td>
			<td>12604-021</td>
			<td>None</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a mouse model of incompletely resected soft tissue sarcoma for testing (neo)adjuvant therapies

A cirurgia é frequentemente o primeiro tratamento para muitos tumores sólidos. No entanto, as recaídas locais ocorrem frequentemente após a ressecção do tumor primário, apesar das terapias adjuvantes ou neoadjuvantes. Isso ocorre quando as margens cirúrgicas são insuficientemente livres de tumores, resultando em células cancerígenas residuais. Do ponto de vista biológico e imunológico, a cirurgia não é um evento nulo; o ambiente de cicatrização da ferida é conhecido por induzir vias pró e anti-tumorigênicas. Como consequência, modelos pré-clínicos para o desenvolvimento de medicamentos destinados a prevenir a recaída local devem incorporar a ressecção cirúrgica ao testar novas terapias (neo)adjuvantes, para modelar os cenários clínicos em pacientes tratados com cirurgia.
Aqui, descrevemos um modelo de camundongo de ressecção cirúrgica incompleta de sarcoma de tecido mole WEHI 164 que permite o teste de terapias (neo)adjuvantes no cenário de uma resposta de cicatrização da ferida. Nesse modelo, 50% ou 75% do tumor é removido, deixando para trás algum tecido cancerígeno in situ para modelar doença residual bruta após cirurgia no ambiente clínico. Este modelo permite testar terapias no contexto da cirurgia, ao mesmo tempo em que considera a resposta de cicatrização da ferida, o que pode afetar a eficácia dos tratamentos (neo)adjuvantes. A ressecção cirúrgica incompleta resulta em recrescimento reprodutível do tumor em todos os camundongos na ausência de terapia adjuvante. O tratamento adjuvante com bloqueio de ponto de verificação resulta em redução do recrescimento tumoral. Este modelo é, portanto, apropriado para testar terapias no contexto da cirurgia de debulking e sua resposta associada à cicatrização de feridas e pode ser estendido a outros tipos de câncer sólido.

O crescimento do tumor para um tamanho de 50 mm2 é um tamanho ideal para debulk parcial. A ressecção cirúrgica incompleta de 50 mm2 tumores resulta em 100% (n=5) recrescimento reprodutível dos tumores na ausência de imunoterapia adjuvante(Figura 4A). Em seguida, usamos o modelo para testar imunoterápicos adjuvantes usando anticorpos contra moléculas de checkpoint Citotóxica T Linfócito Associado Proteína 4 (CT...

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A Mouse Model of Incompletely Resected Soft Tissue Sarcoma for Testing Neoadjuvant Therapies

Neste protocolo, descrevemos um modelo de camundongo de ressecção cirúrgica incompleta de sarcoma de tecido mole para testar (neo)terapias adjuvantes.

Um modelo de mouse de sarcoma de tecido mole incompletamente ressectado para testar (Neo)terapias adjuvantes

Surgery is often the first treatment for many solid tumors. However, local relapses frequently occur following primary tumor resection, despite adjuvant ...

Este protocolo visa imitar o cenário clínico da doença residual após a cirurgia de desesbulação do tumor e, portanto, permite testar novas terapias cancerígenas no contexto da cicatrização de feridas pós-operatórias. A vantagem dessa técnica é que ela permite a padronização da quantidade de ferida infligida e a quantidade de tumor para permanecer. Esta técnica é particularmente importante para estudos pré-clínicos na identificação de novos tratamentos para cânceres, que recaí-lo localmente um exemplo de que é sarcoma de tecido mole.Essa demonstração visual é fundamental para demonstrar a técnica de inversão, que nos permite expor o tumor ligado ao lado da pele. Inicie este procedimento com a inoculação subcutânea de células cancerígenas preparadas em camundongos, conforme descrito no protocolo de texto. No dia 12, pós-inoculação, quando os tumores atingiram um tamanho de aproximadamente 50 milímetros quadrados, dose de camundongos com 100 microliters de buprenorfina subcutânea no pescoço, 30 minutos antes da cirurgia.Configure a área cirúrgica com a almofada de calor coberta com casaco de banco e configure um cone de nariz para anestesia. Disponha equipamentos cirúrgicos limpos para que estejam de fácil acesso, incluindo clorhexadina, cotonete, gaze, gel ocular, duas fórceps curvas, tesoura, aplicador de clipe, removedor de clipes e recargas de clipe. Aqueça a câmara de aquecimento a 37 graus Celsius e configure outra almofada de aquecimento para recuperação.Note que este procedimento requer duas pessoas. Um assistente deve monitorar a respiração do mouse de perto durante o procedimento. Depois de anestesiar o mouse como descrito no protocolo de texto, realize um teste de pinça e teste de reflexo córnea para garantir que o rato esteja totalmente anestesiado antes de iniciar a cirurgia.Cubra os olhos do rato com uma pequena quantidade de gel oftálmico para evitar o ressecamento dos olhos. Comece esta cirurgia limpando a área cirúrgica com clorhexadina. Usando fórceps e um par de tesouras fazem uma incisão reta de um centímetro ao longo do lado dorsal, a três milímetros do tumor.Não corte a pele diretamente cobrindo o tumor, pois ele não vai curar bem. Evite usar um bisturi para cortar o tumor e use pinças para colher os pedaços. Usando pinças, retire a fáscia e o tecido gorduroso subcutâneo entre o tumor e o peritônio.O tumor subcutâneo é normalmente ligado ao lado da pele. Abra a ferida segurando suavemente a pele no lado do rolamento do tumor usando pinças e inverta o tumor para que ele fique visível lá fora. Usando um par de tesouras, corte a cápsula tumoral da metade para remover, começando da base do tumor mais próximo da abertura.Para cirurgia de 50%, corte no meio do tumor. Usando fórceps curvas, retire a seção do tumor para ser removida. Pegue qualquer remanescente da área de debulk.Para 75% debulk, comece realizando um debulk tumoral de 50%, depois corte pela metade os 50% restantes do tumor. Pegue 25% do tumor usando fórceps curvos. Para fechar o local cirúrgico, coloque o tumor restante de volta sob a pele e usando fórceps, puxe os retalhos da pele e forra a pele ao longo da ferida.Segure a pele a cinco milímetros da borda da ferida e use clipes cirúrgicos para fechar a ferida começando ao lado, mais perto dos fórceps. Aplique quantos clipes for necessário para garantir que nenhum tecido subjacente seja exposto. Geralmente, três a quatro clipes são aplicados com intervalos de dois milímetros entre os clipes.Permita que os ratos se recuperem colocando-os na câmara de aquecimento quente. Coloque a gaiola do mouse na almofada de calor. Monitore os ratos na câmara de aquecimento até que se recuperem do anestésico.Em seguida, coloque os ratos de volta na gaiola, deixe a gaiola na almofada de calor por mais 10 minutos até que os ratos se tornem mais ativos. Dê aos ratos comida molhada e macia. Monitore os ratos uma hora após a cirurgia para recuperação.Monitore os ratos novamente no final do dia e na manhã seguinte e garanta que os clipes permaneçam no lugar. Trate camundongos perioperativamente com advento ou terapia neoadjuvante a qualquer momento, dependendo do tratamento de interesse. Por exemplo, trate camundongos com uma dose de 100 microgramas de anti-CTLA-4 intraperitonealmente no dia 15 após a inoculação.Alternativamente, trate os camundongos com três doses de 200 microgramas de anti-PD-1 intraperitonealmente nos dias, 15, 17 e 19 após a inoculação. A ressecção cirúrgica incompleta de 50 tumores quadrados, indicado aqui pela linha pontilhada resulta em recrescimento 100% reprodutível dos tumores na ausência de imunoterapia adjuvante. Portanto, o crescimento do tumor para um tamanho de 50 milímetros quadrados é um tamanho ideal para debulk parcial.O modelo foi então usado para testar imunoterápicos adjuvantes usando anticorpos contra módulos de ponto de verificação, proteína associada ao linfócito T citotóxico quatro e receptor de morte programado um. Tratamento de camundongos com anti-CTLA-4, resultou em uma taxa de cura de 80%Enquanto o tratamento de camundongos com anti-PD-1 resultou em uma taxa de cura de 25% A resposta com anti-PD-1 fornece uma oportunidade de testá-lo novas combinações, para melhorar ainda mais a taxa de resposta. É importante que o tumor restante permaneça ligado à pele, caso contrário o suprimento sanguíneo será cortado e o tumor se tornará o necrosado.Após esse procedimento, os tumores podem ser analisados por uma variedade de métodos, como a citometria de fluxo, a fim de avaliar como a cirurgia afeta as células infiltradas de tumores. Este modelo de camundongos nos permitiu explorar como a cicatrização de feridas afeta as imunoterapias cancerígenas.

Research

JoVE Journal

Medicine

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Medicina

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Técnica cirúrgica para entrega da Medula Espinhal de Terapias: Demonstração de Processo em Göttingen porquinhos

This is a  compact visual description of a combination of surgical technique and device  for the  delivery of (gene and cell) therapies into the spinal ...

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O<em&gt; Em ovo</em&gt; CAM-ensaio como um Xenograftmodel para o Sarcoma

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Transplantation of Pulmonary Valve Using a Mouse Model of Heterotopic Heart Transplantation

O transplante de válvula pulmonar Usando um modelo do rato de Heterotópica Transplante de Coração

Tissue engineered heart valves, especially decellularized valves, are starting to gain momentum in clinical use of reconstructive surgery with mixed ...

Evaluation of the Efficacy of the H. pylori Protein HP-NAP as a Therapeutic Tool for Treatment of Bladder Cancer in an Orthotopic Murine Model

Evaluation of the Efficacy of the H. pylori Protein HP-NAP as a Therapeutic Tool for Treatment of Bladder Cancer in an Orthotopic Murine Model

Avaliação da Eficácia da<em&gt; H. pylori</em&gt; Protein HP-NAP como uma ferramenta terapêutica para o tratamento de cancro da bexiga em um Modelo murino Orthotopic

Bladder cancer is one of the most common malignancies of the urogenital tract. Intravesical injection of Bacillus Calmette-Gu&#233;rin (BCG) is the gold ...

A Mouse Model for Laser-induced Choroidal Neovascularization

Um modelo de rato para induzida por laser coróide Neovascularização

The mouse laser-induced choroidal neovascularization (CNV) model has been a crucial mainstay model for neovascular age-related macular degeneration (AMD) ...

A Mouse Model of Orthopedic Surgery to Study Postoperative Cognitive Dysfunction and Tissue Regeneration

Um modelo do rato de cirurgia ortopédica para estudar a disfunção cognitiva pós-operatória e regeneração de tecidos

Surgery is commonly used to improve and maintain quality of life. Unfortunately, in vulnerable patients such as the elderly, complications may occur and ...