Name: simple lithography-free single cell micropatterning using laser-cut stencils
Uploaded: 2020-04-03T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Simple Lithography-Free Single Cell Micropatterning using Laser-Cut Stencils at JoVE.com

تم دعم هذا العمل من خلال زمالة ما بعد الدكتوراه من معهد ستانفورد لأبحاث صحة الطفل (CHRI) والمعهد الوطني للصحة (1F32HL142205-01) إلى S.L، جائزة رائد مكتب المعاهد القومية للصحة (LM012179-03)، وجمعية القلب الأمريكية جائزة المحقق (17EIA33410923)، ومعهد ستانفورد لأمراض القلب والأوعية الدموية، ومؤسسة هوفمان وشروبفر، وقسم ستانفورد لطب القلب والأوعية الدموية، قسم الطب إلى S.M.W ، جوائز من المعهد الوطني للصحة (UG3 TR002588، P01 HL141084، R01 HL126527، R01 HL113006، R01 HL123968) وبرنامج أبحاث الأمراض المرتبطة بالتبغ (TRDRP 27IR-0012) إلى J.C.W، وجمعية القلب الأمريكية (AHA) جائزة زمالة ما بعد الدكتوراه (18POST34030106) إلى H.Y، وزمالة هنغستبرجر إلى T.S. نشكر الدكتور أندرو أولسن من خدمة الفحص المجهري لعلم الأعصاب في ستانفورد على دعم التصوير البؤري لـ hiPSC-CM المنقوشة بالميكروها. نشكر H.Y. لتصميم الاستنسل الأول، والتصنيع، وmicropatterning خلية واحدة من iPSC-CM على polyacrylamide هيدروجيل المغلفة coverslip، والتصوير الأولي confocal من بنية ساركومير من خلية واحدة micropatterned iPSC-CMs.

1. تلفيق من الأنماط السلبية البولي الاستنسل القائم
<ol><li>إنشاء نمط(الشكل 2A)في تنسيق .dxf باستخدام برامج التصميم بمساعدة الكمبيوتر (على سبيل المثال، أوتوكاد، SolidWorks، Onshape، أدوبي المصور).<ol>
<li>إنشاء دائرة (قطر = 22 ملم) لترسيم حدود الاستنسل.</li>
		<li>رسم شكل مملوء بصلابة أو النمط المطل...

<ol>
	<li>Burridge, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+Defined+and+Small+Molecule-Based+Generation+of+Human+Cardiomyocytes.">Chemically Defined and Small Molecule-Based Generation of Human Cardiomyocytes.</a> Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).</li><li>Sayed, N., Liu, C., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translation+of+Human-Induced+Pluripotent+Stem+Cells:+From+Clinical+Trial+in+a+Dish+to+Precision+Medicine.">Translation of Human-Induced Pluripotent Stem Cells: From Clinical Trial in a Dish to Precision Medicine.</a> Journal of the American College of Cardiology. 67 (18), 2161-2176 (2016).</li><li>Ribeiro, A. J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contractility+of+single+cardiomyocytes+differentiated+from+pluripotent+stem+cells+depends+on+physiological+shape+and+substrate+stiffness.">Contractility of single cardiomyocytes differentiated from pluripotent stem cells depends on physiological shape and substrate stiffness.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (41), 12705-12710 (2015).</li><li>Kumar, A., Biebuyck, H. A., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterning+Self-Assembled+Monolayers:+Applications+in+Materials+Science.">Patterning Self-Assembled Monolayers: Applications in Materials Science.</a> Langmuir. 10 (5), 1498-1511 (1994).</li><li>Wilbur, J. L., Kumar, A., Kim, E., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfabrication+by+microcontact+printing+of+self-assembled+monolayers.">Microfabrication by microcontact printing of self-assembled monolayers.</a> Advanced Materials. 6 (7-8), 600-604 (1994).</li><li>Th&#233;ry, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micropatterning+as+a+tool+to+decipher+cell+morphogenesis+and+functions.">Micropatterning as a tool to decipher cell morphogenesis and functions.</a> Journal of Cell Science. 123 (24), 4201-4213 (2010).</li><li>Toepke, M. W., Beebe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PDMS+absorption+of+small+molecules+and+consequences+in+microfluidic+applications.">PDMS absorption of small molecules and consequences in microfluidic applications.</a> Lab on a Chip. 6 (12), 1484-1486 (2006).</li><li>Seeger, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Premature+Termination+Codon+Mutation+in+MYBPC3+Causes+Hypertrophic+Cardiomyopathy+via+Chronic+Activation+of+Nonsense-Mediated+Decay.">A Premature Termination Codon Mutation in MYBPC3 Causes Hypertrophic Cardiomyopathy via Chronic Activation of Nonsense-Mediated Decay.</a> Circulation. 139 (6), 799-811 (2019).</li><li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+PDGF+pathway+links+LMNA+mutation+to+dilated+cardiomyopathy.">Activation of PDGF pathway links LMNA mutation to dilated cardiomyopathy.</a> Nature. 572 (7769), 335-340 (2019).</li><li>Wu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+diastolic+dysfunction+in+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+from+hypertrophic+cardiomyopathy+patients.">Modelling diastolic dysfunction in induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes from hypertrophic cardiomyopathy patients.</a> European Heart Journal. 40 (45), 3685-3695 (2019).</li><li>Fischer, R. S., Myers, K. A., Gardel, M. L., Waterman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stiffness-controlled+three-dimensional+extracellular+matrices+for+high-resolution+imaging+of+cell+behavior.">Stiffness-controlled three-dimensional extracellular matrices for high-resolution imaging of cell behavior.</a> Nature Protocols. 7 (11), 2056-2066 (2012).</li><li>Lee, S., Stanton, A. E., Tong, X., Yang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogels+with+enhanced+protein+conjugation+efficiency+reveal+stiffness-induced+YAP+localization+in+stem+cells+depends+on+biochemical+cues.">Hydrogels with enhanced protein conjugation efficiency reveal stiffness-induced YAP localization in stem cells depends on biochemical cues.</a> Biomaterials. 202, 26-34 (2019).</li><li>Th&#233;ry, M., P&#233;pin, A., Dressaire, E., Chen, Y., Bornens, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+distribution+of+stress+fibres+in+response+to+the+geometry+of+the+adhesive+environment.">Cell distribution of stress fibres in response to the geometry of the adhesive environment.</a> Cell Motility. 63 (6), 341-355 (2006).</li><li>Kilian, K. A., Bugarija, B., Lahn, B. T., Mrksich, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geometric+cues+for+directing+the+differentiation+of+mesenchymal+stem+cells.">Geometric cues for directing the differentiation of mesenchymal stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (11), 4872-4877 (2010).</li></ol>

نحن نصف طريقة النقش المجهري المستندة إلى الاستنسل الخالية من الطباعة الحجرية التي تمكن من الأنماط الفعالة للخلايا الملتصقة. في هذا البروتوكول، ونحن نظهر النقش من hiPSC-CMs في نسب مختلفة طول إلى العرض عن طريق micropatterning الطابق السفلي غشاء مصفوفة جزر البروتين على هيدروجيلات البولياكريلاميد مع ت?...

وقد أدى ظهور hiPSCs وما يتبع ذلك من تطوير بروتوكولات للتمايز الموجه إلى أنواع مختلفة من الخلايا إلى جعل من الممكن دراسة التنمية والمرض على مستوى جزيئي وخاص بالمريض ، على وجه التحديد باستخدام خلايا القلب iPSC المشتقة من المريض (iPSC-CMs) لنموذج cardiomyopathies1،2. ومع ذلك ، فإن أحد القيود الرئيسية على دراسة التنمية وعلم وظائف الأعضاء باستخدام نظام iPSC ونماذج أخرى في المختبر هو عدم وجود بيئة صغيرة منظمة. في الموقع ، تخضع الخلايا لقيود المصفوفة خارج الخلية (ECM) ، وكذلك الخلايا المجاورة. التركيب الكيميائي الحيوي الخاص وصلابة هذه البيئات الدقيقة تملي التوزيع المكاني للخلايا وكذلك العوامل المتاحة للانخراط في التصاق الخلايا. وهذا بدوره يؤثر على مسارات الإشارات داخل الخلايا، والتعبير الجيني، وتحديد مصير الخلايا. على سبيل المثال، iPSC-CM ذات الأنماط الدقيقة في شكل قضيب يشبه البالغين لديه قدرة انكماش أفضل بكثير، وتدفق الكالسيوم، وتنظيم الميتوكوندريا، والفيزيولوجيا الكهربائية، وتشكيل أنبوب عرضي3. وبالتالي ، فإن خصائص البيئة الدقيقة هي جزء لا يتجزأ من تنظيم الوظائف الخلوية.
تقنيات micropatterning السابقة تعتمد اعتمادا كبيرا على الطباعة الضوئية(الشكل 1A). في هذه التقنية ، يتم نسج طبقة من البوليمر الحساس للضوء ، أو مقاومة للضوء ، على ركيزة مسطحة من الحل لتشكيل فيلم رقيق يبلغ سمكه حوالي 1 ميكرومتر. بعد ذلك ، يتم تطبيق الأشعة فوق البنفسجية (UV) على مقاومة الصور من خلال قناع يحتوي على النمط المطلوب. التعرض للأشعة فوق البنفسجية (الأشعة فوق البنفسجية) ضوء يغير كيميائيا مقاومة للضوء عن طريق تعديل ذوبانها في حل المطور الخاص بها، ونقل النمط المطلوب من القناع على الركيزة. تتضمن العديد من أساليب الأنماط الدقيقة الطباعة الضوئية ، لأنها تمنح النانومتر للتحكم على مستوى الميكرومتر في تصميم أنماط الخلية. ومع ذلك ، فإن الغزل من مقاومة الصور حساسة للغاية للشوائب ، لأن أصغر جزيئات الغبار سوف تعطل انتشار الحل في فيلم رقيقة. ولذلك يجب إجراء التصوير الضوئي في مرافق غير ملوثة، وهي مرافق مكلفة للصيانة وتتطلب خبرة خاصة للاستفادة منها. وبالإضافة إلى ذلك، فإن المواد الكيميائية المستخدمة في التصوير الضوئي غالبا ما تكون سامة للخلايا ويمكن أن تشوه الجزيئات الحيوية الهامة. وبالتالي، فإن الطباعة الضوئية تشكل عقبات كبيرة أمام تصنيع الأنماط الدقيقة للتطبيقات البيولوجية المريحة.
في عام 1994، تغلب وايتسايدس وزملاؤهاما 4 على بعض التحديات المرتبطة بالطباعة الضوئية من خلال ريادة مجموعة من التقنيات تسمى الطباعة الحجرية الناعمة. في الطباعة الحجرية الناعمة ، يتم استخدام سطح صغير الحجم مصنوع من البوليديميثيل سيلوكسان (PDMS) ، وهو مادة شفافة تشبه المطاط ، لتوليد نمط من بروتينات ECM4. وتشمل التقنيات الطباعة الحجرية الناعمة الشائعة طباعة الاتصال الدقيق والنقش الميكرووتوني. في الطباعة microcontact، حاليا الطريقة الحجرية الناعمة الأكثر شعبية، ختم PDMS المغلفة مع بروتينات ECM ينقل المواد على سطح في المناطق التي اتصل بها الطابع(الشكل 1B). في الأنماط الدقيقة، تم تصميم الهياكل الدقيقة على سطح PDMS بحيث عندما يتم الضغط على الطابع إلى الركيزة، يتم إنشاء شبكة من القنوات الدقيقة، التي يمكن من خلالها تسليم السوائل إلى المناطق المطلوبة،(الشكل 1C)5. يوفر الطباعة الحجرية الناعمة العديد من الفوائد على الطباعة الضوئية. بمجرد أن يتم تصنيع رقاقة رئيسية ، يمكن بسهولة تكرار طوابع PDMS دون مزيد من التوظيف لمرافق الغرف النظيفة. بالإضافة إلى ذلك ، فإن عدم وجود مذيبات عضوية في عملية الطباعة الحجرية الناعمة يسمح باستخدام المواد البوليمرية مثل البوليسترين ، التي تستخدم عادة في زراعة الخلايا. وأخيراً، لا يقتصر النقش المجهري باستخدام أساليب الطباعة الحجرية الناعمة على الأسطح المسطحة. وبالتالي ، يزيد الطباعة الحجرية الناعمة من إمكانية الوصول إلى تصنيع النماذج الدقيقة ووظائفها على الطباعة الضوئية6. ومع ذلك، الطباعة الحجرية الناعمة لها عيوب كبيرة. على سبيل المثال، لا تزال هناك حاجة إلى خطوة النقش الأولية، باستخدام الطباعة الضوئية، لتلفيق الطابع. بالإضافة إلى ذلك ، يخضع النقش المجهري باستخدام طابع PDMS لاختلافات في جودة نقل البروتين إلى الركيزة6. تجنب هذه التناقضات يتطلب التحسين والاتساق في الضغط المطبق على ختم PDMS أثناء نقل البروتين ، وإلا يمكن أن يحدث تشوه وتشويه أحجام الميزات لقوالب PDMS6. هناك أيضا قلق كبير من استخدام PDMS بشكل متكرر بسبب امتصاص جزيء صغير7.
لتجنب استخدام الطباعة الضوئية الناعمة وطوابع PDMS ، نصف طريقة micropatterning خلية واحدة قائمة على الاستنسل ، خالية من الطباعة الحجرية التي تتغلب على العديد من العقبات المرتبطة بالطباعة الضوئية والطباعة الحجرية اللينة. في هذه الطريقة، يتم استخدام هيدروجيل البولياكريلاميد كركيزة لدمج بروتين ECM القائم على الاستنسل، مما يسمح بالطلاء الانتقائي لـ hiPSC-CMs واحد. هذه التقنية متوافقة للغاية مع المواد البوليمرية المستخدمة في ظروف ثقافة الخلايا الكلاسيكية. وعلاوة على ذلك، مع التنظيف السليم والصيانة، والاستنسل قابلة لإعادة استخدام ومقاومة للتدهور وامتصاص البروتين أثناء عملية التصنيع المجهري. وأخيراً، فإن عملية الأنماط قوية تقنياً وغير مكلفة وقابلة للتخصيص ومتاحة لأولئك الذين ليس لديهم مهارات متخصصة في الهندسة الحيوية. وقد استخدمت هذه التقنية المجهرية الاستنسل القائم على نطاق واسع في منشوراتنا الأخيرة نمذجة أمراض القلب المتنوعة8،9،10.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Aminoethyl methacrylate hydrochloride (powder)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>516155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide solution 40% (solution)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A-4058-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bench UV lamp 365 nm</td>
			<td>UVP</td>
			<td>UVP 95-0042-07, XX-15L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioFlex culture plate</td>
			<td>FLEXCELL INTERNATIONAL CORPORATION, Burlington, NC</td>
			<td></td>
			<td>6-well plate with silicon elastomer substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bis-acrylamide solution 2% (solution)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1533-25mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning cover glasses square, No. 2, W &#215; L 22 mm &#215; 22 mm</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CLS285522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Irgacure (2-Hydroxy-4&#8242;-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone) (powder)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>410896</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td>basement membrane matrix protein solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl sulfoxide, 99.7+%, Extra Dry, AcroSeal, ACROS Organics</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>326881000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex (13mm) filter unit with Durapore Membrane</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGV013SL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millipore 50mL Steriflip (0.22 &#181;m)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SCGP00525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stencils</td>
			<td>Potomac</td>
			<td>custom design</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfo-SANPAH</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>22589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Select 10x</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A1217702</td>
			<td>Enzyme used for stencil cleaning</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simple lithography-free single cell micropatterning using laser-cut stencils

وقد استخدمت تقنيات micropatterning على نطاق واسع في بيولوجيا الخلايا لدراسة آثار السيطرة على شكل الخلية وحجمها على تحديد مصير الخلية في قرار الخلية الواحدة. تتضمن تقنيات الأنماط الدقيقة الحالية للخلية الواحدة الطباعة الحجرية اللينة والطباعة على التلامس الدقيق ، وهي تقنية قوية ، ولكنها تتطلب مهارات هندسية مدربة ودعم مرافق معينة في التصنيع الدقيق. وتتطلب هذه القيود تقنية أيسر منالا. هنا، نحن نصف طريقة بديلة بسيطة خالية من الطباعة الحجرية: الأنماط خلية واحدة على أساس الاستنسل. نحن نقدم إجراءات خطوة بخطوة بما في ذلك تصميم الاستنسل، وتصنيع الهيدروجيل البولياكريلاميد، ودمج البروتين القائم على الاستنسل، وطلاء الخلايا والثقافة. يمكن استخدام هذه الطريقة البسيطة لنمط صفيف يصل إلى 2000 خلية. نحن نظهر نقش خلايا القلب المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات البشرية (hiPSC) مع أشكال خلايا متميزة ، من 1:1 مربع إلى مستطيل يشبه القلب والقلب البالغ 7:1. هذا النقش خلية واحدة الاستنسل القائم هو خالية من الطباعة الحجرية، قوية من الناحية الفنية، مريحة، غير مكلفة، والأهم من ذلك في متناول أولئك الذين يعانون من خلفية الهندسة الحيوية محدودة.

وقد ثبت تلفيق الاستنسل التي تحتوي على مجموعة من المربعات أو المستطيلات(الشكل 4A). بعد هذا البروتوكول، حصلنا على جزر بروتين مصفوفة منقوشة(الشكل 4B والشكل 5A)والخلايا(الشكل 4C). أدى تركيز محلول بروتين المصفوفة دون المستوى الأمثل إ...

Watch this Scientific Journal Video about Simple Lithography-Free Single Cell Micropatterning using Laser-Cut Stencils at JoVE.com

Simple Lithography-Free Single Cell Micropatterning using Laser-Cut Stencils

يقدم هذا البروتوكول طريقة micropatterning خالية من الطباعة الحجرية بسيطة ومتاحة لأولئك الذين يتمتعون بخلفية محدودة في الهندسة الحيوية. تستخدم هذه الطريقة الإستنسل اتّقص بالليزر حسب الطلب لبروتينات مصفوفة خارج الخلية في شكل اهتمام بتحوير الخلايا المورفولوجيا. يتم إثبات إجراء micropatterning باستخدام الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات المشتقة من خلايا القلب.

بسيطة خالية من الطباعة الحجرية خلية واحدة Micropatterning باستخدام الليزر قطع الإستنسل

Micropatterning techniques have been widely used in cell biology to study effects of controlling cell shape and size on cell fate determination at single ...

سنصف طريقة ميكروباتترن أحادية الخلايا الخالية من الخلايا الأحادية القائمة على الاستنسل، تتغلب على العديد من العقبات المرتبطة بالطباعة الحجرية الضوئية والطباعة الحجرية الناعمة. الاستنسل قابلة لإعادة الاستخدام والعملية غير مكلفة وقابلة للتخصيص. فتحت هذه الطريقة وسيلة جديدة للباحثين غير المهندسين لدراسة شكل الخلايا وchanotransduction الناجمة عن المنطقة في سياقات مختلفة الفسيولوجية والمرضية.وعلاوة على ذلك، يسمح هذا البروتوكول لmicropatterning من الآلاف من الخلايا التي يمكن استخدامها لفحص المخدرات عالية الإنتاجية والنمذجة المرض في طبق. سوف مظاهرة البصرية تسهيل زرع خطوتين حاسمة: مفرزة من الأغطية من هيدروجيل، وتجفيف الهيدروجيل بما فيه الكفاية قبل وضع الاستنسل. إعداد حل البولي أكريلاميد هيدروجيل في أنبوب جديد من أجهزة الطرد المركزي من البروبيلين 50 ملليلتر كما هو موضح في المخطوطة.بعد ذلك ، لإعداد محلول 5٪ من الضوئيات ، قم بحل المكونات في 700 ميكرولترات من الإيثانول بنسبة 100٪. المكونات ليست قابلة للذوبان في الماء لذا تأكد من أن تذوب تماما من قبل دوامة. إضافة 300 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني لحجم النهائي من ملليلتر واحد.العمل على الجليد، وتمييع الطابق السفلي غشاء مصفوفة البروتين الأسهم حل مع الجليد بارد DMEM F12 وسائل الإعلام أو 1X PBS إلى نسبة التخفيف الأمثل. الحفاظ على الجليد لاستخدامها في وقت لاحق. عند العمل مع مصفوفة غشاء الطابق السفلي، تأكد من العمل دائما على الجليد واستخدام حلول الجليد الباردة في النصائح والميصة المبردة وأنابيب.ضع مصباح بدلاء الأشعة فوق البنفسجية في غطاء محرك السيارة السلامة البيولوجية. المقبل، ضع الأفلام البارافين تعقيم أعدت سابقا. إذا كانت أفلام البارافين ليست جافة تماما، استخدم نظام التطلع فراغ لإزالة أي السائل المتبقية.باستخدام ملقط autoclaved، ضع ستة يغطي autoclaved على فيلم البارافين ستة في كل طبق بيتري. لإعداد حل البولي أكريلاميد للأشعة فوق البنفسجية القابلة للربط، تمييع محلول الضوئي مع حل السلائف الهيدروجيل البوليكريلاميد. تعقيم الحل باستخدام وحدة تصفية 50 ملليلتر مع حجم مسام ميكرومتر 0.22.ثم الاستغناء 200 ميكرولترات من الأشعة فوق البنفسجية عبر ربط بوليكريلاميد الحل النهائي على كل من يغطي الزجاج الستة في أطباق بيتري. باستخدام ملقط ذاتية التكفا، قم بتغطية كل غطاء بعناية مع غطاء ثاني ينبس طبقة من الحل بين الأغطية. ضع أطباق بيتري التي تحتوي على الأغطية تحت مصباح مقاعد البدلاء للأشعة فوق البنفسجية مع الغطاء غير المغلق.تغطية ورقة بيضاء على سطح غير أبيض مهم للحد من فقدان كثافة الأشعة فوق البنفسجية. للحماية من الأشعة فوق البنفسجية، غطي المصباح بورق الألومنيوم. Photopolymerize الهيدروجيلات البولي اكريلاميد لمدة خمس دقائق.استخدم شفرة حلاقة لفصل كل زوج من الأغطية بعناية. ملء الخزان الذي يحتوي على ستة مركبات غطاء هيدروجيل مع برنامج تلفزيوني. بعد الشطف لمدة خمس دقائق، والعودة المركبة غطاء هيدروجيل إلى فيلم البارافين في طبق بيتري.الحصول على أنبوب من Sulfo-SANPAH من التخزين في ناقص 80 درجة مئوية. إضافة 1، 200 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني مبردة مسبقا إلى الأنبوب ومزيج عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا. الاستغناء عن 200 ميكرولترات من Sulfo-SANPAH المخفف على فيلم البارافين في طبق بيتري.وضع مركب غطاء هيدروجيل على Sulfo-SANPAH مع الهيدروجيل الاتصال Sulfo-SANPAH. بعد ذلك ، ضع مركبات غطاء هيدروجيل تحت مصباح الأشعة فوق البنفسجية وفضحها لمدة خمس دقائق لتنشيط Sulfo-SANPAH. إذا تحول Sulfo-SANPAH من البرتقالي إلى البني مما يشير إلى نجاح التنشيط والدمج ، انتقل إلى الخطوات التالية في غضون 10 دقائق.تجديد خزان البولي بروبلين المتاح مع برنامج تلفزيوني جديد. نقل مركبات غطاء هيدروجيل المنشط إلى الخزان وشطفها لفترة وجيزة لإزالة Sulfo-SANPAH غير منضم. ضع مركبات غطاء الهيدروجيل على فيلم البارافين في أطباق بيتري وامسحها بعناية مع مناديل خالية من الوبر العقيمة.وضع استنسل على رأس كل مركب غطاء هيدروجيل. لضمان ختم محكم بين الاستنسل والمركبة، قم بإزالة الرطوبة الزائدة عن طريق الزبن مع مناديل خالية من الوبر. الاستغناء بعناية عن غشاء الطابق السفلي المخفف مصفوفة حل البروتين وضع 200 ميكرولتر على رأس كل مركب غطاء هيدروجيل.احتضان الانشاءات بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية. في اليوم التالي، نقل المركبات إلى لوحة ستة جيدا. يمكن التحقق من صحة الختم الضيق بين الهيدروجيل والاستنسل بسهولة من خلال ملاحظة ما إذا كان قد تم الاحتفاظ بمحلول بروتين المصفوفة على قمة الاستنسل.الفشل في تشكيل ختم ضيق يؤدي إلى تسرب سريع من محلول البروتين من خلال الثقوب. غمر تماما المركبات في برنامج تلفزيوني. باستخدام ملاقط autoclaved، فصل بعناية الاستنسل من الهيدروجيلس دون تمزيق الهيدروجيل.إزالة برنامج تلفزيوني من الآبار وإعادة ملء الآبار مع DMEM. احتضان لوحة بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية. بعد إزالة لوحة من الحاضنة، فحص DMEM.إذا DMEM غير غائم، وhydlip مركبات هيدروجيل جاهزة للاستخدام في طلاء الخلايا. كانت قوالب الاستنسل ملفقة تحتوي على صفائف من المربعات والمستطيلات. تم إنشاء ركائز هيدروجيل micropatterned من الاستنسل وتم الحصول على جزر من البروتين المصفوفة.كما تم الحصول على جزر الخلية. على سبيل المثال، جزر من الخلايا القلبية المشتقة من الخلايا الجذعية المشتقة من الخلايا الجذعية التي يسببها الإنسان. ماتريكس تركيز البروتين لعبت دورا أساسيا في توليد أنماط السليم.أدى التركيز الأمثل إلى توزيع متجانس للبروتينات. أدت تركيزات محلول البروتين المصفوفة دون الأمثل إلى نقش دون المستوى الأمثل. من الضروري استخدام الجانب الأمامي من الاستنسل.إذا تم استخدام الجانب الخلفي من الاستنسل ، فإن حجم الجزر البروتينية المصفوفة يزيد بسبب اتجاه القطع بالليزر. أثناء استخدام الجانب الخلفي من الاستنسل لم يؤثر بشكل كبير على عرض النقوش المستطيلة، زاد الارتفاع بشكل كبير مما أدى إلى انخفاض في نسبة العرض إلى الارتفاع المقصودة. تم تطبيق النقش القائم على الاستنسيل على ركائز ميسترومر السيليكون.تم تصور الخلايا القلبية المنقوشة على ركائز ميسترومر السيليكون من خلال الكيمياء المناعية للتروبونات القلبية T في التكبير المنخفض وعن طريق البروتين الساركميري ألفا أكتينين في التكبير العالي. تم تطبيق النقش القائم على الاستنسل أيضًا على نمط اثنين من الخلايا القلبية جنباً إلى جنب على الهيدروجيل مع تصلبات مختلفة. وقد جعل اكتشاف الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان وبروتوكولات التمايز المقابلة لها نموذجًا بشريًا مثاليًا في المختبر لدراسة تولد النسل والأمراض.ومع ذلك ، فإن أحد القيود الرئيسية لاستخدام نظام IPS هو عدم وجود هيكل للبيئة الدقيقة التي لديها تركيبة كيميائية حيوية معينة وتصلب للتفاعل مع الخلايا. ويمكن الجمع بين النقش مع المجهر قوة الجر والجر المقايسات المناعيةchemistry لتوصيف هيكل ووظيفة عضلة القلب. تحليل أنواع الخلايا المشتقة من IPS ، في حالاتنا cardiomyocyte ، في مورفولوجيا أكثر فسيولوجية يفتح الفرص لدراسة cardiomyocytes الصعبة في طبق الثقافة.ويمكن أيضا تطبيق هذه التقنية على العديد من النظم الأخرى مثل ولوحات فحص المحتوى العالي. يمكن ضبط الشكل والركيزة بسهولة إلى التطبيق.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos

عزل وتوصيف الخلايا واحدة من اسماك الزرد الأجنة

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been ...

Epigenetic Conversion as a Safe and Simple Method to Obtain Insulin-secreting Cells from Adult Skin Fibroblasts

تحويل جينية كطريقة آمنة وبسيطة للحصول على خلايا إفراز الأنسولين من الخلايا الليفية الجلد الكبار

Regenerative medicine requires new, fully functional cells that are delivered to patients in order to repair degenerated or damaged tissues. When such ...

Stencil Micropatterning of Human Pluripotent Stem Cells for Probing Spatial Organization of Differentiation Fates

الاستنسل Micropatterning من الخلايا الجذعية متعددة القدرات البشرية لجس التنظيم المكاني للتمايز الأقدار

Human pluripotent stem cells (hPSCs), including embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells, have the intrinsic ability to differentiate into ...

Imaging Cleared Embryonic and Postnatal Hearts at Single-cell Resolution

التصوير تطهيرها الجنينية وبعد الولادة قلوب في قرار وحيدة الخلية

Single clonal tracing and analysis at the whole-heart level can determine cardiac progenitor cell behavior and differentiation during cardiac development, ...

A Simple Method to Identify Kinases That Regulate Embryonic Stem Cell Pluripotency by High-throughput Inhibitor Screening

طريقة بسيطة لتحديد الحركات التي تنظم تعدد القدرات الجذعية للخلايا الجذعية من خلال فحص المانع عالي الإنتاجية

Embryonic stem cells (ESCs) can self-renew or differentiate into all cell types, a phenomenon known as pluripotency. Distinct pluripotent states have been ...

High-resolution Episcopic Microscopy (HREM) - Simple and Robust Protocols for Processing and Visualizing Organic Materials

High-resolution Episcopic Microscopy HREM - Simple and Robust Protocols for Processing and Visualizing Organic Materials

عالية الدقة مجهر ابيسكوبي (هريم) - بروتوكولات بسيطة وقوية لمعالجة وتصور المواد العضوية

We provide simple protocols for generating digital volume data with the high-resolution episcopic microscopy (HREM) method. HREM is capable of imaging ...

Single-Cell Quantification of Protein Degradation Rates by Time-Lapse Fluorescence Microscopy in Adherent Cell Culture

خلية واحدة القياس الكمي لمعدلات تحلل البروتين بالأسفار الوقت الفاصل بين الفحص المجهري في ثقافة الخلية ملتصقة

Proteins are in a dynamic state of synthesis and degradation and their half-lives can be adjusted under various circumstances. However, most commonly used ...

Clonal Analysis of Embryonic Hematopoietic Stem Cell Precursors Using Single Cell Index Sorting Combined with Endothelial Cell Niche Co-culture

تحليل الاستنساخ من سلائف الخلايا الجذعية الجنينية المكونة للدم باستخدام مؤشر وحيد الخلية الفرز جنبا إلى جنب مع الخلية البطانية مكانة ثقافة المشارك

The ability to study hematopoietic stem cell (HSC) genesis during embryonic development has been limited by the rarity of HSC precursors in the early ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

فوتوكونفيرسيون خلية واحدة في معيشة سليمة الزرد

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

Single-cell Transcriptomic Analyses of Mouse Pancreatic Endocrine Cells

تحليلات ترانسكريبتوميك خلية واحدة من خلايا الغدد الصماء البنكرياس الماوس

Pancreatic endocrine cells, which are clustered in islets, regulate blood glucose stability and energy metabolism. The distinct cell types in islets, ...