Name: simple lithography-free single cell micropatterning using laser-cut stencils
Uploaded: 2020-04-03T13:00:00
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这项工作得到了斯坦福大学儿童健康研究所（CHRI）和国家卫生研究所（1F32HL142205-01）至S.L的博士后奖学金的支持， NIH主任先锋奖办公室（LM012179-03）、美国心脏协会设立调查员奖（17EIA33410923）、斯坦福心血管研究所、霍夫曼和施罗普费尔基金会以及斯坦福心血管医学系、医学部S.M.W，国家卫生研究院 （UG3 TR002588， P01 HL141084） 奖， R01 HL126527、R01 HL113006、R01 HL123968）和烟草相关疾病研究计划（TRDRP 27IR-0012）至J.C.W、美国心脏协会（AHA）博士后奖学金（18POST34030106）至H.Y，以及恒斯特伯格奖学金至T.S.我们感谢斯坦福大学神经科学显微镜服务的安德鲁·奥尔森博士支持微模式高PSC-CM的共聚焦成像。我们感谢H.Y.在聚丙烯酰胺水凝胶涂层盖玻片上首次进行模具设计、制造、iPSC-CM的单细胞微模式，以及单细胞微型iPSC-CM的sarcomere结构的初步共聚焦成像。

1. 制造基于多酰胺的负型型模具
<ol><li>使用计算机辅助设计软件（例如 AutoCAD、SolidWorks、Onshape、Adobe Illustrator）以 .dxf 格式生成模式 （图 2A）。<ol>
<li>生成一个圆（直径 = 22 mm）来划定模具的边界。</li>
		<li>绘制实心填充形状或所需的图案。</li>
		<li>包括一个手部字母（例如 R）来标记模具的正面。 注： 例如，在单单元和单元格对级别生成一个正方形和矩形数组以模式 ...

<ol>
	<li>Burridge, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+Defined+and+Small+Molecule-Based+Generation+of+Human+Cardiomyocytes.">Chemically Defined and Small Molecule-Based Generation of Human Cardiomyocytes.</a> Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).</li><li>Sayed, N., Liu, C., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translation+of+Human-Induced+Pluripotent+Stem+Cells:+From+Clinical+Trial+in+a+Dish+to+Precision+Medicine.">Translation of Human-Induced Pluripotent Stem Cells: From Clinical Trial in a Dish to Precision Medicine.</a> Journal of the American College of Cardiology. 67 (18), 2161-2176 (2016).</li><li>Ribeiro, A. J. 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E., Tong, X., Yang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogels+with+enhanced+protein+conjugation+efficiency+reveal+stiffness-induced+YAP+localization+in+stem+cells+depends+on+biochemical+cues.">Hydrogels with enhanced protein conjugation efficiency reveal stiffness-induced YAP localization in stem cells depends on biochemical cues.</a> Biomaterials. 202, 26-34 (2019).</li><li>Th&#233;ry, M., P&#233;pin, A., Dressaire, E., Chen, Y., Bornens, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+distribution+of+stress+fibres+in+response+to+the+geometry+of+the+adhesive+environment.">Cell distribution of stress fibres in response to the geometry of the adhesive environment.</a> Cell Motility. 63 (6), 341-355 (2006).</li><li>Kilian, K. A., Bugarija, B., Lahn, B. T., Mrksich, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geometric+cues+for+directing+the+differentiation+of+mesenchymal+stem+cells.">Geometric cues for directing the differentiation of mesenchymal stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (11), 4872-4877 (2010).</li></ol>

我们描述了一种基于光刻模具的微模式方法，该方法能够有效地对粘附细胞进行模式化。在该协议中，我们演示了不同长度-宽度比的hiPSC-CM模式，通过在聚丙烯酰胺水凝胶上微模式基底膜基质蛋白岛进行生理或病理相关组织刚度或硅基弹性体基质。这种方法相对简单，对于任何研究人员，包括那些在光刻和微制造技术方面几乎没有背景的研究人员来说，都很容易获得。所述方法规避了使用软光刻?...

hiPSCs的出现和随后针对不同细胞类型的定向分化的协议的开发使得研究在分子和患者特定水平上的发展和疾病成为可能，特别是使用患者衍生的iPSC心肌细胞（iPSC-CMs）来模拟心肌病11、2。2然而，使用iPSC系统和其他体外模型研究发育和生理学的一个主要限制是缺乏结构化的微观环境。就位，细胞受到细胞外基质（ECM）和相邻细胞的约束。这些微环境的特殊生化成分和刚度决定了细胞的空间分布以及可用于参与细胞粘附的因素。这反过来又影响细胞内信号通路、基因表达和细胞命运测定。例如，成人型杆形状的微型iPSC-CM具有明显较好的收缩能力、钙流、线粒体组织、电生理学和横纹状3。因此，微环境在细胞功能调节中具有不可分割的特性。
以前的微模式技术严重依赖光刻（图1A）。在这种技术中，一层感光聚合物或光刻剂从溶液在平坦的基板上旋转，形成约1μm厚的薄膜。接下来，紫外线 （UV） 光通过包含所需图案的蒙版应用于光刻。暴露于紫外线 （UV） 光会通过改变其各自显影溶液中的溶解度来化学地改变光阻，将所需的模式从面罩转移到基板上。许多微模式方法都采用了光刻，因为它赋予纳米对细胞图案设计的微米级控制。然而，光刻机的旋转对杂质非常敏感，因为最小的尘埃颗粒会破坏溶液扩散到薄膜中。因此，光刻必须在未受污染的设施中进行，这些设施维护成本高昂，需要特殊的专门知识才能加以利用。此外，光刻术中使用的化学物质通常对细胞有毒，并可能使重要的生物分子变性。因此，光刻术对制造微模式构成重大障碍，方便生物应用。
1994 年，Whitesides 及其4同事通过开创了一系列称为软光刻技术，克服了与光刻学相关的一些挑战。在软光刻中，用聚二甲基硅氧烷（PDMS）制成的微结构表面（PDMS）是一种透明、橡胶状的材料，用于生成ECM蛋白4的图案。常见的软光刻技术包括微接触印刷和微流体图案。在微接触印刷中，目前最流行的软平版图方法，涂有ECM蛋白的PDMS邮票将材料转移到图所接触的区域的表面（图1B）。在微流体图案中，微结构被设计成PDMS表面，这样当图章被压到基板上时，就会形成一个微通道网络，通过该网络将流体输送到所需区域（图1C）5。5与光刻摄影，柔和的光刻具有多种优点。一旦主晶圆是微结构的，PDMS 邮票就可以轻松复制，而无需进一步使用洁净室设施。此外，软光刻过程中缺乏有机溶剂，因此可以使用聚合物材料，如聚苯乙烯，通常用于细胞培养。最后，使用软光刻方法的微模式并不限于平面。因此，软光刻增加了微图案制造与光刻6的可访问性和功能性。然而，软光刻有显著的缺点。例如，使用光刻术的初始蚀刻步骤仍然需要对邮票进行微压。此外，使用PDMS图章的微图案取决于蛋白质转移到基材上的质量变化6。避免这些差异需要优化和一致性的压力施加到PDMS印章在蛋白质转移期间，否则变形和变形的PDMS模具的特征大小可能发生6。由于小分子吸收7，反复使用PDMS也是一个主要问题。
为了避免使用软光刻和PDMS图章，我们描述了一种基于模具、无光刻的单细胞微图案方法，该方法克服了与光刻和软光刻相关的许多障碍。在这种方法中，聚丙烯酰胺水凝胶用作基于模具的ECM蛋白结合的基质，允许选择性地电镀单个hiPSC-CM。该技术与经典细胞培养条件下的聚合物材料高度兼容。此外，通过适当的清洁和维护，模具可重复使用，在微制造过程中可耐降解和蛋白质吸收。最后，模式化过程在技术上坚固、价格低廉、可定制，并且可供没有专业生物工程技能的人使用。这种基于模具的微模式技术在近期的出版物中得到了广泛的应用，模拟了不同的心肌病88、9、10。9,10

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Aminoethyl methacrylate hydrochloride (powder)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>516155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide solution 40% (solution)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A-4058-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bench UV lamp 365 nm</td>
			<td>UVP</td>
			<td>UVP 95-0042-07, XX-15L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioFlex culture plate</td>
			<td>FLEXCELL INTERNATIONAL CORPORATION, Burlington, NC</td>
			<td></td>
			<td>6-well plate with silicon elastomer substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bis-acrylamide solution 2% (solution)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1533-25mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning cover glasses square, No. 2, W &#215; L 22 mm &#215; 22 mm</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CLS285522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Irgacure (2-Hydroxy-4&#8242;-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone) (powder)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>410896</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td>basement membrane matrix protein solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl sulfoxide, 99.7+%, Extra Dry, AcroSeal, ACROS Organics</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>326881000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex (13mm) filter unit with Durapore Membrane</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGV013SL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millipore 50mL Steriflip (0.22 &#181;m)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SCGP00525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stencils</td>
			<td>Potomac</td>
			<td>custom design</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfo-SANPAH</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>22589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Select 10x</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A1217702</td>
			<td>Enzyme used for stencil cleaning</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simple lithography-free single cell micropatterning using laser-cut stencils

微模式技术在细胞生物学中得到了广泛的应用，用于研究控制细胞形状和大小对单细胞分辨率细胞命运测定的影响。目前最先进的单细胞微图案技术涉及软光刻和微接触印刷，这是一项强大的技术，但需要经过培训的工程技能和微制造的某些设施支持。这些限制需要一种更易于访问的技术。在这里，我们描述了一个简单的替代光刻无图法：基于模具的单细胞模式。我们提供分步程序，包括模具设计、聚丙烯酰胺水凝胶制造、基于模具的蛋白质的整合以及细胞电镀和培养。这个简单的方法可用于对多达 2，000 个单元格的数组进行模式化。我们演示了从具有不同细胞形状的单人类诱导多能干细胞（hiPSC）衍生的心肌细胞的图案，从1：1平方到7：1的成人心肌细胞状矩形。这种基于模具的单细胞图案是无光刻，技术稳健，方便，价格便宜，最重要的是，对于那些有限的生物工程背景。

已演示了包含正方形或矩形数组的模具的制造（图 4A）。按照该协议，我们获得了图案矩阵蛋白岛（图4B和图5A）和细胞（图4C）。次优基质蛋白溶液浓度导致模式不理想（图5B）。使用模具的前侧至关重要。如果使用模具的背面，则基质蛋白岛的大小会随着激光切割的方向而增加（<stro...

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Simple Lithography-Free Single Cell Micropatterning using Laser-Cut Stencils

该协议引入了一种无光刻图的微模式方法，该方法对于生物工程背景有限的人来说简单且易于使用。该方法利用定制的激光切割模具，以感兴趣的形状进行微模式细胞外基质蛋白，以调节细胞形态。微模式程序使用诱导多能干细胞衍生心肌细胞进行演示。

使用激光切割模具实现简单的无光刻单细胞微模式

Micropatterning techniques have been widely used in cell biology to study effects of controlling cell shape and size on cell fate determination at single ...

我们将介绍一种基于模具的无光刻无单细胞微模式方法，该方法克服了与光刻和软光刻相关的许多障碍。模具可重复使用，且过程低廉且可定制。该方法为非工程研究人员在各种生理和病理环境中研究细胞形状和面积诱发的机械转化开辟了一条新途径。此外，该协议允许对数千个细胞进行微模型，这些细胞可用于培养皿中高通量药物筛选和疾病建模。视觉演示将促进植入两个关键步骤：从水凝胶分离盖玻片，在放置模具之前充分干燥水凝胶。如手稿所述，在新的 50 毫升丙烯离心管中准备聚丙烯酰胺水凝胶溶液。接下来，准备5%光启动器溶液，将成分溶解在700微升100%乙醇中。成分不溶水，所以一定要完全溶解的漩涡。添加 300 微升 PBS，最终体积为 1 毫升。在冰上工作，用冰冷DMEM F12介质或1X PBS稀释基底膜基质蛋白库存溶液，以优化稀释比。放在冰上供以后使用。使用地下室膜基质时，确保始终在冰上工作，并在冷冻移液器尖端和管中使用冰冷溶液。将紫外线台灯放在生物安全罩中。接下来，将之前准备的灭菌石蜡薄膜放置。如果石蜡薄膜未完全干燥，请使用真空吸气系统去除任何残留液体。使用自 <3>化钳子，在每个培养皿中，在石蜡膜上放置六个自 <3>自 <3>化盖玻片。为了准备UV交核多丙烯酰胺最终溶液，用聚丙烯酰胺水凝胶前体溶液稀释光启动器溶液。使用 50 毫升过滤装置对溶液进行灭菌，其孔径为 0.22 微米。然后将 200 微升的 UV 交核多丙烯酰胺最终溶液分配到 Petri 盘中的六个玻璃盖玻片上。使用自动解吸钳，小心地用第二个盖玻片盖住每个盖玻片，在两个盖玻片之间捕获溶液的一层。将装有盖玻片的培养皿放在紫外线台灯下，盖子未关闭。白纸覆盖在非白色表面上对尽量减少紫外线强度损失非常重要。为防止紫外线辐射，请用铝箔盖住灯。多丙烯酰胺水凝胶的光聚聚一体，可进行五分钟。使用剃须刀刀片小心地分离每对盖玻片。用 PBS 填充包含六种水凝胶盖玻片复合材料的储液罐。冲洗五分钟后，将水凝胶盖玻片复合材料返回培养皿中的石蜡膜。在零下80摄氏度的储存中获取一管S sulfo-SANPAH。将1，200微升预冷却PBS加入管子，通过上下移液混合。将稀释的 Sulfo-SANPAH 的 200 微升分配到 Petri 盘中的石蜡薄膜上。将水凝胶盖玻片复合材料放在 Sulfo-SANPAH 上，水凝胶与 Sulfo-SANPAH 接触。接下来，将水凝胶盖玻片复合材料放在紫外灯下，并将其暴露五分钟，以激活 Sulfo-SANPAH。如果 Sulfo-SANPAH 从橙色变为棕色，表示激活和合并成功，请于 10 分钟内继续执行下一步。用新鲜的 PBS 补充一次性聚丙烯储液罐。将激活的水凝胶盖玻片复合材料转移到储液罐中，并短暂冲洗，以去除未绑定的 Sulfo-SANPAH。将水凝胶盖玻片复合材料放在培养皿中的石蜡薄膜上，然后用无菌无绒湿巾小心地涂抹。在每个水凝胶盖玻片复合材料的顶部放置一个模具。为确保模具和复合材料之间的密封紧密，使用自动清洁的无绒湿巾擦拭，去除多余的水分。小心地分配稀释的基底膜基质蛋白溶液，在每个水凝胶盖玻片复合材料上放置 200 微升。在37摄氏度下过夜孵化结构。第二天，将复合材料转移到六井板。通过观察基质蛋白溶液是否保留在模具顶部，可以很容易地验证水凝胶和模具之间的紧密密封。未能形成紧密密封会导致蛋白质溶液快速通过孔泄漏。将复合材料完全浸入 PBS 中。使用自 <3>化钳子，小心地将模具从水凝胶中分离，而不会撕裂水凝胶。从油井中去除 PBS，用 DMEM 重新填充油井。在37摄氏度下孵育板。从培养箱中取出板后，检查 DMEM。如果 DMEM 不是多云的，水凝胶盖玻片复合材料可用于细胞电镀。模具是制造出来的，包含方形和矩形数组。微表层水凝胶基板是从基质蛋白的模具和孤岛中创造的。也获得细胞岛。例如，人类诱导多能干细胞衍生的心肌细胞的岛屿。基质蛋白浓度在生成适当模式方面起着至关重要的作用。最佳浓度导致蛋白质的均匀分布。次优基质蛋白溶液浓度导致模式不理想。使用模具的正面至关重要。如果使用模具的背面，则由于激光切割的方向，基质蛋白岛的大小会增加。虽然使用模具的背面没有显著影响矩形图案的宽度，但高度显著增加导致预期纵横比降低。基于模具的图案应用于硅弹性体基板。硅弹性体基板上的图案心肌细胞在低放大率下通过心脏肌蛋白T的免疫细胞化学和高放大率的沙康蛋白α-actin进行可视化。基于模具的图案也应用于具有不同刚度的水凝胶上并排的两个心肌细胞。人类诱导多能干细胞的发现和相应的分化方案，使其成为研究肿瘤生成和发病机系的理想体外模型。然而，使用IPS系统的一个主要限制是缺乏结构，对微环境具有特殊的生化成分和刚度与细胞相互作用。模式可以与牵引力显微镜和免疫细胞化学分析相结合，来描述心肌细胞的结构和功能。分析IPS衍生细胞类型，在我们的案例中，在更生理的形态中，为研究培养皿中具有挑战性的心肌细胞提供了机会。该技术还可用于许多其他系统，如和高含量筛选板。形状和基板可以随应用而轻松调整。

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