Name: simple lithography-free single cell micropatterning using laser-cut stencils
Uploaded: 2020-04-03T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Simple Lithography-Free Single Cell Micropatterning using Laser-Cut Stencils at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af postdoc-stipendium fra Stanford Child Health Research Institute (CHRI) og National Institute of Health (1F32HL142205-01) til S.L. NIH Office of Director's Pioneer Award (LM012179-03), American Heart Association Established Investigator Award (17EIA33410923), Stanford Cardiovascular Institute, Hoffmann and Schroepfer Foundation og Stanford Division of Cardiovascular Medicine, Department of Medicine to S.M.W. , priser fra National Institute of Health (UG3 TR002588, P01 HL141084, R01 HL126527, R01 HL113006, R01 HL123968) og Tobaksrelateret Disease Research Program (TRDRP 27IR-0012) til J.C.W. American Heart Association (AHA) Postdoctoral Fellowship Award (18POST34030106) til H.Y. og Hengstberger-stipendium til T.S. Vi takker Dr. Andrew Olsen fra Stanford Neuroscience Microscopy Service på støtte af konfokal billeddannelse af den mikromønstrede hiPSC-CM. Vi takker H.Y. for første stencil design, fabrikation, enkelt celle mikropatterning af iPSC-CM på polyacrylamid hydrogel belagt coverslip, og indledende konfokal billeddannelse af sarcomere struktur af enkelt celle mikromønstret iPSC-CMs.

1. Fremstilling af negative mønster polyimid-baserede stencils
<ol><li>Generer et mønster (Figur 2A) i .dxf-format ved hjælp af computerstøttet designsoftware (f.eks.<ol>
<li>Generer en cirkel (diameter = 22 mm) for at afgrænse stencilens kant.</li>
		<li>Tegn en udfyldt form eller det ønskede mønster.</li>
		<li>Medtag et chiralbogstav (f.eks. BEMÆRK: Som et eksempel genereres en række firkanter og rektangler til at mønstre iPSC-CMs på enkeltcelle- og cellepar. Designfilerne...

<ol>
	<li>Burridge, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+Defined+and+Small+Molecule-Based+Generation+of+Human+Cardiomyocytes.">Chemically Defined and Small Molecule-Based Generation of Human Cardiomyocytes.</a> Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).</li><li>Sayed, N., Liu, C., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translation+of+Human-Induced+Pluripotent+Stem+Cells:+From+Clinical+Trial+in+a+Dish+to+Precision+Medicine.">Translation of Human-Induced Pluripotent Stem Cells: From Clinical Trial in a Dish to Precision Medicine.</a> Journal of the American College of Cardiology. 67 (18), 2161-2176 (2016).</li><li>Ribeiro, A. J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contractility+of+single+cardiomyocytes+differentiated+from+pluripotent+stem+cells+depends+on+physiological+shape+and+substrate+stiffness.">Contractility of single cardiomyocytes differentiated from pluripotent stem cells depends on physiological shape and substrate stiffness.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (41), 12705-12710 (2015).</li><li>Kumar, A., Biebuyck, H. A., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterning+Self-Assembled+Monolayers:+Applications+in+Materials+Science.">Patterning Self-Assembled Monolayers: Applications in Materials Science.</a> Langmuir. 10 (5), 1498-1511 (1994).</li><li>Wilbur, J. L., Kumar, A., Kim, E., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfabrication+by+microcontact+printing+of+self-assembled+monolayers.">Microfabrication by microcontact printing of self-assembled monolayers.</a> Advanced Materials. 6 (7-8), 600-604 (1994).</li><li>Th&#233;ry, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micropatterning+as+a+tool+to+decipher+cell+morphogenesis+and+functions.">Micropatterning as a tool to decipher cell morphogenesis and functions.</a> Journal of Cell Science. 123 (24), 4201-4213 (2010).</li><li>Toepke, M. W., Beebe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PDMS+absorption+of+small+molecules+and+consequences+in+microfluidic+applications.">PDMS absorption of small molecules and consequences in microfluidic applications.</a> Lab on a Chip. 6 (12), 1484-1486 (2006).</li><li>Seeger, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Premature+Termination+Codon+Mutation+in+MYBPC3+Causes+Hypertrophic+Cardiomyopathy+via+Chronic+Activation+of+Nonsense-Mediated+Decay.">A Premature Termination Codon Mutation in MYBPC3 Causes Hypertrophic Cardiomyopathy via Chronic Activation of Nonsense-Mediated Decay.</a> Circulation. 139 (6), 799-811 (2019).</li><li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+PDGF+pathway+links+LMNA+mutation+to+dilated+cardiomyopathy.">Activation of PDGF pathway links LMNA mutation to dilated cardiomyopathy.</a> Nature. 572 (7769), 335-340 (2019).</li><li>Wu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+diastolic+dysfunction+in+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+from+hypertrophic+cardiomyopathy+patients.">Modelling diastolic dysfunction in induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes from hypertrophic cardiomyopathy patients.</a> European Heart Journal. 40 (45), 3685-3695 (2019).</li><li>Fischer, R. S., Myers, K. A., Gardel, M. L., Waterman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stiffness-controlled+three-dimensional+extracellular+matrices+for+high-resolution+imaging+of+cell+behavior.">Stiffness-controlled three-dimensional extracellular matrices for high-resolution imaging of cell behavior.</a> Nature Protocols. 7 (11), 2056-2066 (2012).</li><li>Lee, S., Stanton, A. E., Tong, X., Yang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogels+with+enhanced+protein+conjugation+efficiency+reveal+stiffness-induced+YAP+localization+in+stem+cells+depends+on+biochemical+cues.">Hydrogels with enhanced protein conjugation efficiency reveal stiffness-induced YAP localization in stem cells depends on biochemical cues.</a> Biomaterials. 202, 26-34 (2019).</li><li>Th&#233;ry, M., P&#233;pin, A., Dressaire, E., Chen, Y., Bornens, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+distribution+of+stress+fibres+in+response+to+the+geometry+of+the+adhesive+environment.">Cell distribution of stress fibres in response to the geometry of the adhesive environment.</a> Cell Motility. 63 (6), 341-355 (2006).</li><li>Kilian, K. A., Bugarija, B., Lahn, B. T., Mrksich, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geometric+cues+for+directing+the+differentiation+of+mesenchymal+stem+cells.">Geometric cues for directing the differentiation of mesenchymal stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (11), 4872-4877 (2010).</li></ol>

Vi beskriver en litografifri stencil-baseret mikromønstermetode, der muliggør effektiv mønstreaf klæbende celler. I denne protokol demonstrerer vi mønstret af hiPSC-CM'er i forskellige længde-til-bredde forhold ved mikropatternrende kældermembranmatrixproteinøer på polyacrylamidhydrogels med fysiologisk- eller patologisk relevante vævsstivheder eller siliciumbaserede elastomersubstrater. Denne metode er forholdsvis enkel og meget tilgængelig for alle forskere, herunder dem, der har ringe baggrund i fotolitogra...

Fremkomsten af hiPSCs og den efterfølgende udvikling af protokoller for deres direkte differentiering i forskellige celletyper har gjort det muligt at studere udvikling og sygdom på et molekylært og patientspecifikt niveau, specielt ved hjælp af patientafledte iPSC-kardiomyocytter (iPSC-CMs) til model kardiomyopatier1,2. Men en væsentlig begrænsning til at studere udvikling og fysiologi ved hjælp af iPSC-systemet og andre in vitro-modeller er fraværet af et struktureret mikromiljø. In situ, celler er udsat for de begrænsninger af den ekstracellulære matrix (ECM), samt tilstødende celler. Den særlige biokemiske sammensætning og stivhed af disse mikromiljøer dikterer den rumlige fordeling af celler samt faktorer til rådighed for at deltage i cellevedhæftning. Dette påvirker til gengæld intracellulære signalveje, genekspression og celleskæbnebestemmelse. For eksempel, mikromønstret iPSC-CM i en voksen-lignende stang form har en betydeligt bedre kontraktile evne, calcium flow, mitokondrielle organisation, elektrofysiologi, og tværgående tubule dannelse3. Således er mikromiljøets egenskaber en integreret del af reguleringen af cellefunktioner.
Tidligere mikromønstreteknikker, der i høj grad var afhængige af fotolitografi (Figur 1A). I denne teknik, et lag af lysfølsom polymer, eller photoresist, er spundet på et fladt substrat fra opløsning til at danne en tynd film omkring 1 μm tyk. Dernæst er ultraviolet (UV) lys påføres på photoresist gennem en maske, der indeholder det ønskede mønster. Udsættelse for ultraviolet (UV) lys ændrer kemisk fotoresistved at ændre sin opløselighed i sin respektive udviklerløsning, overføre det ønskede mønster fra masken på substratet. Mange mikropatternrende metoder inkorporerer fotolitografi, da det giver nanometer til mikrometer-niveau kontrol over udformningen af cellemønstre. Men spindingen af fotoresisterer er meget følsom over for urenheder, fordi de mindste støvpartikler vil forstyrre spredningen af opløsningen til en tynd film. Fotolitografi skal derfor udføres i uforurenede anlæg, som er dyre at vedligeholde og kræver særlig ekspertise at udnytte. Desuden er de kemikalier, der anvendes i fotolitografi, ofte giftige for celler og kan denaturere vigtige biomolekyler. Således fotolitografi udgør betydelige hindringer for fremstilling af mikromønstre for bekvemme biologiske anvendelser.
I 1994 overvandt Whitesides og kolleger4 nogle af de udfordringer, der er forbundet med fotolitografi ved at være banebrydende for en samling af teknikker kaldet blød litografi. I blød litografi, en mikrostruktureret overflade lavet med polydimethylsiloxan (PDMS), en gennemsigtig, gummi-lignende materiale, bruges til at generere et mønster af ECM proteiner4. Fælles bløde litografiske teknikker omfatter microcontact udskrivning og microfluidic mønstre. Ved mikrokontaktudskrivning, som i øjeblikket er den mest populære bløde litografiske metode, overfører et PDMS-stempel belagt med ECM-proteiner materialet til en overflade på de områder, der berøres af stemplet (Figur 1B). I mikrofluidiske mønstre er mikrostrukturer konstrueret på en PDMS-overflade, således at der, når stemplet trykkes til et underlag, skabes et netværk af mikrokanaler, hvorigennem der kan leveres væsker til de ønskede områder (figur 1C)5. Blød litografi tilbyder flere fordele i forhold til fotolitografi. Når en master wafer er mikrofabrikeret, kan PDMS frimærker nemt replikeres uden yderligere beskæftigelse af renrumsfaciliteter. Hertil kommer, at fraværet af organiske opløsningsmidler i processen med blød litografi giver mulighed for udnyttelse af polymere materialer såsom polystyren, typisk anvendes i cellekultur. Endelig er mikromønstre ved hjælp af bløde litografiske metoder ikke begrænset til flade overflader. Således blød litografi øger tilgængeligheden og funktionaliteten af mikromønster fabrikation over fotolitografi6. Men blød litografi har betydelige ulemper. For eksempel er et indledende ætsningstrin, der bruger fotolitografi, stadig nødvendigt for at mikrofabrikere stemplet. Desuden er mikropatterning ved hjælp af et PDMS-stempel underlagt variationer i kvaliteten af proteinoverførsel på substratet6. Undgå disse uoverensstemmelser kræver optimering og konsistens i det tryk, der anvendes på PDMS stempel under proteinoverførsel, ellers deformation og forvrængning af funktionen størrelser af PDMS forme kan forekomme6. Der er også et stort problem med gentagne gange at bruge PDMS på grund af lille molekyle absorption7.
For at undgå at bruge bløde fotolitografi og PDMS frimærker, beskriver vi en stencil-baseret, litografi-fri enkelt celle mikropatterning metode, der overvinder mange af de forhindringer, der er forbundet med fotolitografi og blød litografi. I denne metode anvendes en polyacrylamidhydrogel som substrat til stencilbaseret ECM-proteininkorporering, hvilket giver mulighed for selektiv plettering af enkelte hiPSC-CMs. Denne teknik er yderst kompatibel med polymere materialer, der anvendes i klassiske cellekulturbetingelser. Desuden, med korrekt rengøring og vedligeholdelse, stencilerne kan genbruges og modstandsdygtige over for nedbrydning og protein absorption under mikrofabrikationsprocessen. Endelig er mønsterprocessen teknisk robust, billig, kan tilpasses og tilgængelig for dem uden specialiserede bioengineering færdigheder. Denne stencil-baserede mikropatterning teknik er blevet bredt udnyttet i vores seneste publikationer modellering varieret kardiomyopatier8,9,10.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Aminoethyl methacrylate hydrochloride (powder)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>516155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide solution 40% (solution)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A-4058-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bench UV lamp 365 nm</td>
			<td>UVP</td>
			<td>UVP 95-0042-07, XX-15L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioFlex culture plate</td>
			<td>FLEXCELL INTERNATIONAL CORPORATION, Burlington, NC</td>
			<td></td>
			<td>6-well plate with silicon elastomer substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bis-acrylamide solution 2% (solution)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1533-25mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning cover glasses square, No. 2, W &#215; L 22 mm &#215; 22 mm</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CLS285522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Irgacure (2-Hydroxy-4&#8242;-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone) (powder)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>410896</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td>basement membrane matrix protein solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl sulfoxide, 99.7+%, Extra Dry, AcroSeal, ACROS Organics</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>326881000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex (13mm) filter unit with Durapore Membrane</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGV013SL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millipore 50mL Steriflip (0.22 &#181;m)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SCGP00525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stencils</td>
			<td>Potomac</td>
			<td>custom design</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfo-SANPAH</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>22589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Select 10x</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A1217702</td>
			<td>Enzyme used for stencil cleaning</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simple lithography-free single cell micropatterning using laser-cut stencils

Mikropatternrende teknikker har været meget anvendt i cellebiologi til at studere effekter af kontrollerende celleform og størrelse på celleskæbnebestemmelse ved enkeltcelleopløsning. Nuværende state-of-the-art enkelt celle mikropatterning teknikker involverer blød litografi og mikro-kontakt udskrivning, som er en kraftfuld teknologi, men kræver uddannet tekniske færdigheder og visse facilitet støtte i mikrofabrikation. Disse begrænsninger kræver en mere tilgængelig teknik. Her beskriver vi en simpel alternativ litografifri metode: stencil-baseret enkeltcellemønster. Vi leverer trin-for-trin procedurer, herunder stencil design, polyacrylamid hydrogel fabrikation, stencil-baseret protein inkorporering, og celle plating og kultur. Denne enkle metode kan bruges til at mønstre en matrix af så mange som 2.000 celler. Vi demonstrerer mønstret af kardiomyocytter afledt af enkelte humane inducerede pluripotente stamceller (hiPSC) med forskellige celleformer, fra en 1:1 firkant til en 7:1 voksen kardiomyocyte-lignende rektangel. Denne stencil-baserede enkelt celle mønstre er litografi-fri, teknisk robust, praktisk, billig, og vigtigst tilgængelig for dem med en begrænset bioengineering baggrund.

Fremstilling af stencils, der indeholder en række kvadrater eller rektangler, er blevet påvist (figur 4A). Efter denne protokol opnåede vi mønstrede matrixproteinøer (figur 4B og figur 5A) og celler (figur 4C). Koncentrationen af suboptimalmatrixproteinopløsning førte til suboptimalt mønstermønster (figur 5B). Det er vigtigt at bruge forsiden af stencilen. Hvis bag...

Watch this Scientific Journal Video about Simple Lithography-Free Single Cell Micropatterning using Laser-Cut Stencils at JoVE.com

Simple Lithography-Free Single Cell Micropatterning using Laser-Cut Stencils

Denne protokol indfører en litografi-fri mikropatterning metode, der er enkel og tilgængelig for dem med en begrænset bioengineering baggrund. Denne metode udnytter tilpassede laser-cut stencils til mikromønster ekstracellulære matrix proteiner i en form af interesse for modulerende celle morfologier. Proceduren for mikropatterning påvises ved hjælp af inducerede pluripotente stamceller afledt kardiomyocytter.

Simple litografi-fri enkelt celle mikromønster ved hjælp af Laser-Cut Stencils

Micropatterning techniques have been widely used in cell biology to study effects of controlling cell shape and size on cell fate determination at single ...

Vi beskriver en stencil-baseret litografi-fri encellet mikropattern metode, der overvinder mange forhindringer forbundet med fotolitografi og blød litografi. Stencils kan genbruges, og processen er billig og kan tilpasses. Denne metode åbnede en ny vej for ikke-ingeniør forskere til at studere celle form og område-induceret mechanotransduction i forskellige fysiologiske og patologiske sammenhænge.Desuden, denne protokol giver mulighed for mikropattering af tusindvis af celler, som kan udnyttes til høj-throughput drug screening og sygdom modellering i en skål. Visuel demonstration vil lette implantationen af to afgørende trin:løsrivelse af dækslæb fra hydrogel, tørring hydrogel tilstrækkeligt før placering af stencilen. Forbered polyacryamidhydrgelopløsningen i et nyt 50 milliliter propylencentrifugerør som beskrevet i manuskriptet.Dernæst for at forberede 5% fotoinitiator opløsning, opløse ingredienserne i 700 mikroliter af 100% ethanol. Ingredienserne er ikke vandopløselige, så sørg for at opløses helt ved at hvirvle. Tilsæt 300 mikroliter PBS for et endeligt volumen på en milliliter.Arbejde på is, fortyndet kælder membran matrix protein lager opløsning med iskold DMEM F12 medier eller 1X PBS til den optimerede fortyndingsforhold. Opbevares på is til senere brug. Når du arbejder med kældermembranmatrix, skal du sørge for altid at arbejde på is og bruge iskolde opløsninger i kølede pipettespidser og rør.Anstæl en UV-bænklampe i en biologisk sikkerhedshætte. Dernæst placere steriliserede paraffin film udarbejdet tidligere. Hvis paraffinfilmene ikke er helt tørre, skal du bruge et vakuumaspirationssystem til at fjerne eventuel resterende væske.Brug autoklavede kraftviber, sted seks autoclaved coverslips på paraffin film seks i hver Petri skål. For at forberede den UV-krydssammenkædbare polyacryamid endelige opløsning, fortyndes fotoinitiatorløsningen med polyacrylamid hydrogelprækursoropløsningen. Opløsningen steriliseres ved hjælp af en 50 milliliterfilterenhed med en porestørrelse på 0,22 mikrometer.Derefter dispenseres 200 mikroliter UV cross-linkable polyarylamid endelige opløsning på hver af de seks glas coverslips i petriskåle. Brug autoklaveret kraftbeslag, omhyggeligt dække hver dækslæb med en anden coverlip fældefangst et lag af opløsningen mellem de to dæksleter. Placer petriskålene, der indeholder dækslerne under UV-bænklampen, med låget uanfæstet.Dækningen af hvidt papir på den ikke-hvide overflade er vigtig for at minimere UV-intensitetstabet. For beskyttelse mod UV-stråling, dække lampen med aluminiumsfolie. Photopolymerize polyakrylamid hydrogels i fem minutter.Brug et barberblad til omhyggeligt at adskille hvert par dækslæber. Fyld beholderen med seks hydrogel coverslip kompositter med PBS. Efter skylning i fem minutter, returnere hydrogel coverslip kompositter til paraffin filmen i Petriskålen.Få et rør sulfo-SANPAH fra opbevaring ved minus 80 grader Celsius. Tilsæt 1, 200 mikroliter af forkølet PBS til røret og bland ved pipettering op og ned. Dispensere 200 mikroliter af den fortyndede Sulfo-SANPAH på paraffinfilmen i petriskålen.Placer en hydrogel coverslip komposit over Sulfo-SANPAH med hydrogel kontakte Sulfo-SANPAH. Dernæst placere hydrogel coverslip kompositter under UV-lampen og udsætte dem i fem minutter for at aktivere Sulfo-SANPAH. Hvis Sulfo-SANPAH skifter fra orange til brun, hvilket indikerer vellykket aktivering og inkorporering, skal du gå videre til de næste trin inden for 10 minutter.Genopfyld engangspolypropylenbeholderen med frisk PBS. Overfør de aktiverede hydrogel coverslip kompositter til reservoiret og skyl dem kortvarigt for at fjerne ubundet Sulfo-SANPAH. Placer hydrogel coverslip kompositter på paraffin filmen i Petri retter og forsigtigt duppe dem med sterile fnug-fri klude.Placer en stencil på toppen af hver hydrogel coverslip komposit. For at sikre en stram forsegling mellem stencilen og kompositten fjernes overskydende fugt ved at duppe med autoklavede fnugfrie klude. Dispenser forsigtigt den fortyndede kældermembran matrix protein opløsning placere 200 mikroliter på toppen af hver hydrogel coverslip komposit.Inkuber konstruktionerne natten over ved 37 grader Celsius. Den næste dag, overføre kompositter til en seks-brønd plade. En tæt forsegling mellem hydrogel og stencil kan let valideres ved at observere, om matrixproteinopløsningen er blevet bevaret oven på stencilen.Manglende form af en stram tætning fører til hurtig lækage af proteinopløsningen gennem hullerne. Kompositmaterialerne nedsænkes helt i PBS. Brug autoclaved pincet, forsigtigt løsrive stencils fra hydrogels uden at rive hydrogels.Fjern PBS fra brøndene og genopfyld brøndene med DMEM. Inkuber pladen natten over ved 37 grader Celsius. Efter fjernelse af pladen fra inkubatoren, undersøge DMEM.Hvis DMEM ikke er uklar, hydrogel coverslip kompositter er klar til at blive brugt til cellebelægning. Stencils blev fremstillet indeholdende arrays af firkanter og rektangler. Micropatterned hydrogel substrater blev skabt fra stencils og øer af matrix protein blev opnået.Der blev også fremkomt celleøer. For eksempel, øer af menneskeskabte pluripotente stamceller-afledte kardiomyocytter. Matrix protein koncentration spillede en afgørende rolle i at generere ordentlig mønstre.En optimal koncentration førte til en homogen fordeling af proteiner. Suboptimal matrix proteinopløsning koncentrationer førte til suboptimale mønstre. Det er vigtigt at bruge forsiden af stencilen.Hvis bagsiden af stencilen anvendes, øges størrelsen af matrixproteinøerne på grund af laserskæringens retning. Mens du bruger bagsiden af stencilen ikke væsentligt påvirke bredden af de rektangulære mønstre, højden betydeligt øget fører til en reduktion i den tilsigtede højde-bredde-forhold. Stencil-baserede mønstre blev anvendt på silicium elastomer substrater.De mønstrede kardiomyocytter på silicium elastomer substrater blev visualiseret ved immunocytochemistry af hjertetroponin T ved lav forstørrelse og ved sarkomerisk protein alpha-actinin ved høj forstørrelse. Stencil-baserede mønstre blev også anvendt til mønster to kardiomyocytter side om side på hydrogels med forskellige stivheder. Opdagelsen af menneskeskabte pluripotente stamceller og tilsvarende differentieringsprotokoller har gjort dette til en ideel in vitro menneskelig model til undersøgelse af oncogenesis og patogenese.En væsentlig begrænsning ved brugen af IPS-systemet er imidlertid fraværet af struktur til mikromiljøet, som har særlig biokemisk sammensætning og stivhed til at interagere med celler. Mønstret kan kombineres med trækkraft mikroskopi og immunokætætæmi assays at karakterisere strukturen og funktionen af kardiomyocytter. Analyse af IPS-afledte celletyper, i vores tilfælde cardiomyocyte, i en mere fysiologisk morfologi åbner muligheder for at studere udfordrende kardiomyocytter i kultur fad.Teknikken kan også anvendes på mange andre systemer såsom og højt indhold screening plader. Formen og underlaget kan let justeres til applikationen.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos

Isolering og karakterisering af enkeltceller fra zebrafisk embryoer

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been ...

Epigenetic Conversion as a Safe and Simple Method to Obtain Insulin-secreting Cells from Adult Skin Fibroblasts

Epigenetisk Konvertering som en sikker og enkel metode til at opnå insulinproducerende celler fra voksne hud fibroblaster

Regenerative medicine requires new, fully functional cells that are delivered to patients in order to repair degenerated or damaged tissues. When such ...

Stencil Micropatterning of Human Pluripotent Stem Cells for Probing Spatial Organization of Differentiation Fates

Stencil Micropatterning for Human pluripotente stamceller til Sondering Spatial Organisation af differentiering Fates

Human pluripotent stem cells (hPSCs), including embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells, have the intrinsic ability to differentiate into ...

Imaging Cleared Embryonic and Postnatal Hearts at Single-cell Resolution

Imaging Cleared Embryonale og postnatal hjerter på Single-celle Opløsning

Single clonal tracing and analysis at the whole-heart level can determine cardiac progenitor cell behavior and differentiation during cardiac development, ...

A Simple Method to Identify Kinases That Regulate Embryonic Stem Cell Pluripotency by High-throughput Inhibitor Screening

En simpel metode til at identificere kinaser, der regulerer embryonisk stamcellepluripotens ved høj gennemstrømningshæmmende screening

Embryonic stem cells (ESCs) can self-renew or differentiate into all cell types, a phenomenon known as pluripotency. Distinct pluripotent states have been ...

High-resolution Episcopic Microscopy (HREM) - Simple and Robust Protocols for Processing and Visualizing Organic Materials

High-resolution Episcopic Microscopy HREM - Simple and Robust Protocols for Processing and Visualizing Organic Materials

High-Resolution Episcopic Microscopy (HREM) - Simple og robuste protokoller til behandling og visualisering af organiske materialer

We provide simple protocols for generating digital volume data with the high-resolution episcopic microscopy (HREM) method. HREM is capable of imaging ...

Single-Cell Quantification of Protein Degradation Rates by Time-Lapse Fluorescence Microscopy in Adherent Cell Culture

Encellede kvantificering af Protein nedbrydning satser for Time-Lapse Fluorescens mikroskopi i vedhængende cellekultur

Proteins are in a dynamic state of synthesis and degradation and their half-lives can be adjusted under various circumstances. However, most commonly used ...

Clonal Analysis of Embryonic Hematopoietic Stem Cell Precursors Using Single Cell Index Sorting Combined with Endothelial Cell Niche Co-culture

Klonede analyse af embryonale hæmatopoietisk stamcelle prækursorer ved hjælp af enkelt celle indeks sortering kombineret med endotel celle Niche Co kultur

The ability to study hematopoietic stem cell (HSC) genesis during embryonic development has been limited by the rarity of HSC precursors in the early ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

Encellede Photoconversion i levende intakt zebrafisk

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

Single-cell Transcriptomic Analyses of Mouse Pancreatic Endocrine Cells

Encellede transkriptom analyser af mus i bugspytkirtlen endokrine celler

Pancreatic endocrine cells, which are clustered in islets, regulate blood glucose stability and energy metabolism. The distinct cell types in islets, ...