Name: simple lithography-free single cell micropatterning using laser-cut stencils
Uploaded: 2020-04-03T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Simple Lithography-Free Single Cell Micropatterning using Laser-Cut Stencils at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door postdoctorale fellowship van Stanford Child Health Research Institute (CHRI) en het National Institute of Health (1F32HL142205-01) aan S.L. de NIH Office of Director's Pioneer Award (LM012179-03), de American Heart Association Established Investigator Award (17EIA33410923), het Stanford Cardiovascular Institute, de Hoffmannroep en Schfer Foundation, en de Stanford Division of Cardiovascular Medicine, Department of Medicine aan S.M.W , awards van het National Institute of Health (UG3 TR002588, P01 HL141084, R01 HL126527, R01 HL113006, R01 HL123968) en Tobacco-related Disease Research Program (TRDRP 27IR-0012) aan J.C.W, de American Heart Association (AHA Postdoctoral) Fellowship Award (18POST34030106) aan H.Y. We danken Dr Andrew Olsen van Stanford Neuroscience Microscopy Service op de ondersteuning van confocale beeldvorming van de micropatroon hiPSC-CM. Wij danken H.Y. voor het eerste stencilontwerp, de fabricage, de micropatterning van iPSC-CM op de polyacrylamidehydrogel gecoate coverslip, en voorlopige confocale beeldvorming van de sarcomerestructuur van enkelcellige micropatroon iPSC-CMs.

1. Fabricage van op negatief patroon polyimide gebaseerde stencils
<ol><li>Een patroon genereren (figuur 2A) in .dxf-indeling met behulp van computerondersteunde ontwerpsoftware (bijvoorbeeld AutoCAD, SolidWorks, Onshape, Adobe Illustrator).<ol>
<li>Genereer een cirkel (diameter = 22 mm) om de rand van het stencil af te zetten.</li>
		<li>Teken een met vaste vulling gevulde vorm of het gewenste patroon.</li>
		<li>Voeg een chirale letter (bijvoorbeeld R) toe om de voorkant van de stencils ...

<ol>
	<li>Burridge, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+Defined+and+Small+Molecule-Based+Generation+of+Human+Cardiomyocytes.">Chemically Defined and Small Molecule-Based Generation of Human Cardiomyocytes.</a> Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).</li><li>Sayed, N., Liu, C., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translation+of+Human-Induced+Pluripotent+Stem+Cells:+From+Clinical+Trial+in+a+Dish+to+Precision+Medicine.">Translation of Human-Induced Pluripotent Stem Cells: From Clinical Trial in a Dish to Precision Medicine.</a> Journal of the American College of Cardiology. 67 (18), 2161-2176 (2016).</li><li>Ribeiro, A. J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contractility+of+single+cardiomyocytes+differentiated+from+pluripotent+stem+cells+depends+on+physiological+shape+and+substrate+stiffness.">Contractility of single cardiomyocytes differentiated from pluripotent stem cells depends on physiological shape and substrate stiffness.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (41), 12705-12710 (2015).</li><li>Kumar, A., Biebuyck, H. A., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterning+Self-Assembled+Monolayers:+Applications+in+Materials+Science.">Patterning Self-Assembled Monolayers: Applications in Materials Science.</a> Langmuir. 10 (5), 1498-1511 (1994).</li><li>Wilbur, J. L., Kumar, A., Kim, E., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfabrication+by+microcontact+printing+of+self-assembled+monolayers.">Microfabrication by microcontact printing of self-assembled monolayers.</a> Advanced Materials. 6 (7-8), 600-604 (1994).</li><li>Th&#233;ry, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micropatterning+as+a+tool+to+decipher+cell+morphogenesis+and+functions.">Micropatterning as a tool to decipher cell morphogenesis and functions.</a> Journal of Cell Science. 123 (24), 4201-4213 (2010).</li><li>Toepke, M. W., Beebe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PDMS+absorption+of+small+molecules+and+consequences+in+microfluidic+applications.">PDMS absorption of small molecules and consequences in microfluidic applications.</a> Lab on a Chip. 6 (12), 1484-1486 (2006).</li><li>Seeger, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Premature+Termination+Codon+Mutation+in+MYBPC3+Causes+Hypertrophic+Cardiomyopathy+via+Chronic+Activation+of+Nonsense-Mediated+Decay.">A Premature Termination Codon Mutation in MYBPC3 Causes Hypertrophic Cardiomyopathy via Chronic Activation of Nonsense-Mediated Decay.</a> Circulation. 139 (6), 799-811 (2019).</li><li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+PDGF+pathway+links+LMNA+mutation+to+dilated+cardiomyopathy.">Activation of PDGF pathway links LMNA mutation to dilated cardiomyopathy.</a> Nature. 572 (7769), 335-340 (2019).</li><li>Wu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+diastolic+dysfunction+in+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+from+hypertrophic+cardiomyopathy+patients.">Modelling diastolic dysfunction in induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes from hypertrophic cardiomyopathy patients.</a> European Heart Journal. 40 (45), 3685-3695 (2019).</li><li>Fischer, R. S., Myers, K. A., Gardel, M. L., Waterman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stiffness-controlled+three-dimensional+extracellular+matrices+for+high-resolution+imaging+of+cell+behavior.">Stiffness-controlled three-dimensional extracellular matrices for high-resolution imaging of cell behavior.</a> Nature Protocols. 7 (11), 2056-2066 (2012).</li><li>Lee, S., Stanton, A. E., Tong, X., Yang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogels+with+enhanced+protein+conjugation+efficiency+reveal+stiffness-induced+YAP+localization+in+stem+cells+depends+on+biochemical+cues.">Hydrogels with enhanced protein conjugation efficiency reveal stiffness-induced YAP localization in stem cells depends on biochemical cues.</a> Biomaterials. 202, 26-34 (2019).</li><li>Th&#233;ry, M., P&#233;pin, A., Dressaire, E., Chen, Y., Bornens, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+distribution+of+stress+fibres+in+response+to+the+geometry+of+the+adhesive+environment.">Cell distribution of stress fibres in response to the geometry of the adhesive environment.</a> Cell Motility. 63 (6), 341-355 (2006).</li><li>Kilian, K. A., Bugarija, B., Lahn, B. T., Mrksich, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geometric+cues+for+directing+the+differentiation+of+mesenchymal+stem+cells.">Geometric cues for directing the differentiation of mesenchymal stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (11), 4872-4877 (2010).</li></ol>

We beschrijven een lithografievrije op stencil gebaseerde micropatroonmethode die effectieve patronen van aanhangende cellen mogelijk maakt. In dit protocol tonen we patronen van hiPSC-CMs in verschillende lengte-breedte verhoudingen door micropatterning kelder membraan matrix eiwiteilanden op polyacrylamide hydrogels met fysiologisch- of pathologisch relevante weefselstijfheid of siliciumgebaseerde elastomeersubstraten. Deze methode is relatief eenvoudig en zeer toegankelijk voor alle onderzoekers, met inbegrip van dege...

De komst van hiPSC's en de daaropvolgende ontwikkeling van protocollen voor hun gerichte differentiatie in verschillende celtypen hebben het mogelijk gemaakt om ontwikkeling en ziekte op moleculair en patiëntspecifiek niveau te bestuderen, met name met behulp van door patiënten afgeleide iPSC-cardiomyocyten (iPSC-CC's) om cardiomyopathmieten te modelleren1,2. Echter, een belangrijke beperking tot het bestuderen van ontwikkeling en fysiologie met behulp van het iPSC-systeem en andere in vitro modellen is de afwezigheid van een gestructureerde micro-omgeving. In situ worden cellen onderworpen aan de beperkingen van de extracellulaire matrix (ECM), evenals naburige cellen. De bijzondere biochemische samenstelling en stijfheid van deze micro-omgevingen dicteren de ruimtelijke verdeling van cellen en factoren die beschikbaar zijn voor het aangaan van celhechting. Dit, op zijn beurt, beïnvloedt intracellulaire signalering trajecten, genexpressie, en cel lot bepaling. Bijvoorbeeld, micropatroon iPSC-CM in een volwassen-achtige staaf vorm heeft een aanzienlijk betere contractiele vermogen, calcium stroom, mitochondriale organisatie, elektrofysiologie, en dwars-tubule vorming3. Zo zijn de eigenschappen van de micro-omgeving integraal in de regulatie van cellulaire functies.
Eerdere micropatroontechnieken waren sterk afhankelijk van fotolithografie(figuur 1A). In deze techniek wordt een laag fotogevoelig polymeer, of fotoresist, gesponnen op een plat substraat van oplossing tot een dunne film van ongeveer 1 μm dik. Vervolgens wordt ultraviolet (UV) licht op de fotoresist aangebracht door middel van een masker met het gewenste patroon. Blootstelling aan ultraviolet (UV) licht verandert de fotoresist chemisch door de oplosbaarheid ervan in de respectievelijke ontwikkelaarsoplossing aan te passen, waardoor het gewenste patroon van het masker op het substraat wordt overgebracht. Veel micropatroonmethoden bevatten fotolithografie, omdat het nanometer-aan micrometer-niveau controle over het ontwerp van de celpatronen verleent. Het spinnen van de fotoresist is echter zeer gevoelig voor onzuiverheden, omdat de kleinste stofdeeltjes de verspreiding van de oplossing in een dunne film zullen verstoren. Fotolithografie moet daarom worden uitgevoerd in niet-verontreinigde faciliteiten, die kostbaar zijn om te onderhouden en speciale expertise vereisen om te gebruiken. Bovendien zijn de chemische stoffen die in de fotolithografie worden gebruikt vaak giftig voor cellen en kunnen ze belangrijke biomoleculen denatureren. Fotolithografie vormt dus aanzienlijke obstakels voor de fabricage van micropatronen voor handige biologische toepassingen.
In 1994, Whitesides en collega's4 overwon een aantal van de uitdagingen in verband met fotolithografie door baanbrekende een verzameling van technieken genaamd zachte lithografie. In zachte lithografie wordt een microgestructureerd oppervlak gemaakt met polydimethylsiloxaan (PDMS), een transparant, rubberachtig materiaal, gebruikt om een patroon van ECM-eiwitten te genereren4. Veelvoorkomende zachte lithografische technieken omvatten microcontactafdrukken en microfluïdische patronen. Bij het printen van microcontact, momenteel de meest populaire zachte lithografische methode, brengt een PDMS-stempel bekleed met ECM-eiwitten het materiaal over op een oppervlak op de gebieden die door de stempel worden gecontacteerd (figuur 1B). In microfluïdische patronen worden microstructuren zodanig ontworpen op een PDMS-oppervlak, zodat wanneer de stempel op een substraat wordt gedrukt, een netwerk van microkanalen ontstaat, waardoor vloeistoffen aan gewenste gebieden kunnen worden geleverd , wordt gecreëerd (Figuur 1C)5. Zachte lithografie biedt verschillende voordelen ten opzichte van fotolithografie. Zodra een master wafer is gemicrofabriceerd, de PDMS stempels kunnen gemakkelijk worden gerepliceerd zonder verdere werkgelegenheid van clean-room faciliteiten. Bovendien maakt de afwezigheid van organische oplosmiddelen in het proces van zachte lithografie het gebruik van polymere materialen zoals polystyreen mogelijk, meestal gebruikt in de celkweek. Ten slotte is micropatroon met behulp van zachte lithografische methoden niet beperkt tot vlakke oppervlakken. Zo verhoogt zachte lithografie de toegankelijkheid en functionaliteit van micropatroonfabricage via fotolithografie6. Zachte lithografie heeft echter belangrijke nadelen. Een eerste etsstap, met behulp van fotolithografie, is bijvoorbeeld nog steeds nodig om de stempel te microfabriceren. Bovendien is micropatroon met behulp van een PDMS-stempel onderhevig aan variaties in de kwaliteit van eiwitoverdracht op het substraat6. Het vermijden van deze discrepanties vereist optimalisatie en consistentie in de druk die wordt uitgeoefend op de PDMS-stempel tijdens eiwitoverdracht, anders kunnen vervorming en vervorming van de functiegrootte van de PDMS-mallen optreden6. Er is ook een grote zorg van herhaaldelijk gebruik van de PDMS als gevolg van kleine molecuul absorptie7.
Om te voorkomen dat het gebruik van zachte fotolithografie en PDMS-stempels, beschrijven we een stencil-gebaseerde, lithografie-vrije single cell micropatterning methode die veel van de obstakels in verband met fotolithografie en zachte lithografie overwint. Bij deze methode wordt een polyacrylamidehydrogel gebruikt als substraat voor de integratie van ECM-eiwit op basis van stencil, waardoor selectieve beplating van enkele hiPSC-CC's mogelijk is. Deze techniek is zeer compatibel met polymere materialen die worden gebruikt in klassieke celkweekomstandigheden. Bovendien zijn de stencils met de juiste reiniging en onderhoud herbruikbaar en bestand tegen afbraak en eiwitabsorptie tijdens het microfabricageproces. Ten slotte is het patroonproces technisch robuust, goedkoop, aanpasbaar en toegankelijk voor mensen zonder gespecialiseerde bio-engineeringvaardigheden. Deze stencil-gebaseerde micropatterning techniek is breed gebruikt in onze recente publicaties modellering gevarieerde cardiomyopathies8,9,10.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Aminoethyl methacrylate hydrochloride (powder)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>516155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide solution 40% (solution)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A-4058-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bench UV lamp 365 nm</td>
			<td>UVP</td>
			<td>UVP 95-0042-07, XX-15L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioFlex culture plate</td>
			<td>FLEXCELL INTERNATIONAL CORPORATION, Burlington, NC</td>
			<td></td>
			<td>6-well plate with silicon elastomer substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bis-acrylamide solution 2% (solution)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1533-25mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning cover glasses square, No. 2, W &#215; L 22 mm &#215; 22 mm</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CLS285522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Irgacure (2-Hydroxy-4&#8242;-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone) (powder)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>410896</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td>basement membrane matrix protein solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl sulfoxide, 99.7+%, Extra Dry, AcroSeal, ACROS Organics</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>326881000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex (13mm) filter unit with Durapore Membrane</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGV013SL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millipore 50mL Steriflip (0.22 &#181;m)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SCGP00525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stencils</td>
			<td>Potomac</td>
			<td>custom design</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfo-SANPAH</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>22589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Select 10x</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A1217702</td>
			<td>Enzyme used for stencil cleaning</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simple lithography-free single cell micropatterning using laser-cut stencils

Micropatroon technieken zijn op grote schaal gebruikt in de celbiologie om de effecten van het beheersen van celvorm en grootte op cel lot bepaling bij een enkele cel resolutie te bestuderen. De huidige state-of-the-art single cell micropatterning technieken omvatten zachte lithografie en micro-contact afdrukken, dat is een krachtige technologie, maar vereist getrainde technische vaardigheden en bepaalde faciliteit ondersteuning in microfabricage. Deze beperkingen vereisen een meer toegankelijke techniek. Hier beschrijven we een eenvoudige alternatieve lithografievrije methode: stencil-gebaseerde eencellige patronen. Wij bieden stapsgewijze procedures, waaronder stencilontwerp, polyacrylamidehydrogelfabricage, eiwitopname op basis van stencil en celbeplating en -cultuur. Deze eenvoudige methode kan worden gebruikt om een array van maar liefst 2.000 cellen patroon. We tonen de patronen van cardiomyocyten afgeleid van enkele door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSC) met verschillende celvormen, van een 1:1 vierkant tot een 7:1 volwassen cardiomyocyte-achtige rechthoek. Deze stencil-gebaseerde eencellige patroonis lithografie-vrij, technisch robuust, handig, goedkoop, en vooral toegankelijk voor mensen met een beperkte bio-engineering achtergrond.

Fabricage van stencils die een array van vierkanten of rechthoeken bevatten , is aangetoond (figuur 4A). Volgens dit protocol hebben we matrix-eiwiteilanden met patroon verkregen (figuur 4B en figuur 5A) en cellen (figuur 4C). Suboptimale matrixeiwitoplossingsconcentratie leidde tot suboptimale patronen (Figuur 5B). Het is van cruciaal belang om de voorkant van het stencil ...

Watch this Scientific Journal Video about Simple Lithography-Free Single Cell Micropatterning using Laser-Cut Stencils at JoVE.com

Simple Lithography-Free Single Cell Micropatterning using Laser-Cut Stencils

Dit protocol introduceert een lithografievrije micropatroonmethode die eenvoudig en toegankelijk is voor mensen met een beperkte bio-engineeringachtergrond. Deze methode maakt gebruik van aangepaste laser-cut stencils om micropatroon extracellulaire matrix eiwitten in een vorm van belang voor het moduleren van cel morfologieën. De procedure voor micropatterning wordt aangetoond met behulp van geïnduceerde pluripotente stamcel afgeleide cardiomyocyten.

Eenvoudige lithografie-vrije single cell micropatterning met behulp van Laser-Cut Stencils

Micropatterning techniques have been widely used in cell biology to study effects of controlling cell shape and size on cell fate determination at single ...

We beschrijven een op stencil gebaseerde lithografie-vrije eencellige micropattern methode die veel obstakels in verband met fotolithografie en zachte lithografie overwint. De stencils zijn herbruikbaar en het proces is goedkoop en aanpasbaar. Deze methode opende een nieuwe weg voor niet-ingenieur onderzoekers om celvorm en gebied-geïnduceerde mechanotransductie in verschillende fysiologische en pathologische contexten te bestuderen.Bovendien, dit protocol maakt het mogelijk voor micropatterning van duizenden cellen die kunnen worden gebruikt voor high-throughput drug screening en ziekte modellering in een schotel. Visuele demonstratie zal de implantatie van twee cruciale stappen vergemakkelijken: het loskoppelen van coverslip van hydrogel, het drogen van hydrogel voldoende voor het plaatsen van het stencil. Bereid de polyacrylamide hydrogel oplossing voor in een nieuwe 50 milliliter propyleencentrifugebuis zoals beschreven in het manuscript.Vervolgens, om de 5%fotoinitiator oplossing te bereiden, los de ingrediënten op in 700 microliter van 100% ethanol. De ingrediënten zijn niet oplosbaar in water dus zorg ervoor dat u volledig oplossen door vortexing. Voeg 300 microliter PBS toe voor een eindvolume van één milliliter.Werken op ijs, verdun kelder membraan matrix eiwit voorraad oplossing met ijskoude DMEM F12 media of 1X PBS aan de geoptimaliseerde verdunningsverhouding. Blijf op ijs voor later gebruik. Bij het werken met kelder membraan matrix, zorg ervoor dat altijd werken op ijs en gebruik ijskoude oplossingen in gekoelde pipet tips en buizen.Plaats een UV-banklamp in een biologische veiligheidskap. Plaats vervolgens de eerder gesteriliseerde paraffinefilms. Als de paraffinefolies niet volledig droog zijn, gebruikt u een vacuümaspiratiesysteem om eventuele restvloeistof te verwijderen.Met behulp van autoclaved tang, plaats zes autoclaved coverslips op de paraffine film zes in elke Petri schotel. Om de UV cross-linkable polyacrylamide uiteindelijke oplossing voor te bereiden, verdun de foto-initiatoroplossing met de polyacrylamide hydrogel precursoroplossing. Steriliseren van de oplossing met behulp van een 50 milliliter filterunit met een poriegrootte van 0,22 micrometer.Dan afzien van 200 microliter uv cross-linkable polyacrylamide definitieve oplossing op elk van de zes glazen coverslips in de petrischaaltjes. Bedek met behulp van autoclaved tangen zorgvuldig elke coverslip met een tweede coverslip die een laag van de oplossing tussen de twee coverslips overvult. Plaats de petrischaaltjes met de hoezenlips onder de UV-banklamp met het deksel niet gesloten.De dekking van wit papier op het niet-witte oppervlak is belangrijk om het uv-intensiteitsverlies te minimaliseren. Voor bescherming tegen UV-straling, bedek de lamp met aluminiumfolie. Fotopolymeer de polyacrylamide hydrogels gedurende vijf minuten.Gebruik een scheermesje om elk paar coverslips zorgvuldig te scheiden. Vul het reservoir met zes hydrogel coverslip composieten met PBS. Na vijf minuten spoelen, breng je de hydrogel coverslip composieten terug naar de paraffinefilm in de Petri schotel.Haal een buis van Sulfo-SANPAH uit opslag bij min 80 graden Celsius. Voeg 1.200 microliter voorgekoelde PBS aan de buis toe en meng door op en neer te pipetten. Doe 200 microliter van de verdunde Sulfo-SANPAH op de paraffinefilm in de petrischaal.Plaats een hydrogel coverslip composiet over de Sulfo-SANPAH met de hydrogel contact met de Sulfo-SANPAH. Plaats vervolgens de hydrogel coverslip composieten onder de UV-lamp en leg ze gedurende vijf minuten bloot om de Sulfo-SANPAH te activeren. Als de Sulfo-SANPAH van oranje naar bruin verandert, wat wijst op succesvolle activering en integratie, gaat u binnen 10 minuten naar de volgende stappen.Vul het wegwerp polypropyleenreservoir aan met verse PBS. Breng de geactiveerde hydrogel coverslip composieten naar het reservoir en spoel ze kort om ongebonden Sulfo-SANPAH te verwijderen. Plaats de hydrogel coverslip composieten op de paraffine film in de Petri gerechten en zorgvuldig deppen ze met steriele pluisjes-vrije doekjes.Plaats een stencil op de top van elke hydrogel coverslip composiet. Om een strakke afdichting tussen het stencil en het composiet te garanderen, verwijdert u overtollig vocht door te deppen met autoaclaved pluisvrije doekjes. Doe voorzichtig de verdunde keldermembraanmaten eiwitoplossing af die 200 microliters bovenop elke hydrogel coverslipcomposiet plaatst.Incubeer de constructies 's nachts op 37 graden Celsius. De volgende dag, breng de composieten naar een zes-put plaat. Een strakke afdichting tussen hydrogel en stencil kan eenvoudig worden gevalideerd door te observeren of de matrix eiwitoplossing bovenop het stencil is bewaard.Het niet vormen van een strakke afdichting leidt tot een snelle lekkage van de eiwitoplossing door de gaten. Dompel de composieten volledig onder in PBS. Met behulp van autoclaved pincet, voorzichtig los de stencils van de hydrogels zonder scheuren de hydrogels.Haal de PBS uit de putten en vul de putten met DMEM. Incubeer de plaat 's nachts op 37 graden Celsius. Na het verwijderen van de plaat uit de couveuse, onderzoek de DMEM.Als de DMEM niet troebel is, zijn de hydrogel coverslip composieten klaar om te worden gebruikt voor celbeplating. Stencils werden vervaardigd met arrays van vierkanten en rechthoeken. Micropatronen werden gemicrosileerd uit de stencils en er werden eilanden van matrixeiwit verkregen.Celeilanden werden ook verkregen. Bijvoorbeeld, eilanden van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocyten. Matrix eiwitconcentratie speelde een essentiële rol bij het genereren van de juiste patronen.Een optimale concentratie leidde tot een homogene verdeling van eiwitten. Suboptimale matrix eiwit oplossing concentraties leidde tot suboptimale patronen. Het is van cruciaal belang om de voorkant van het stencil te gebruiken.Als de achterkant van het stencil wordt gebruikt, neemt de grootte van de matrix-eiwiteilanden toe als gevolg van de richting van het lasersnijden. Terwijl het gebruik van de achterkant van het stencil de breedte van de rechthoekige patronen niet significant beïnvloedde, nam de hoogte aanzienlijk toe, wat leidde tot een vermindering van de beoogde beeldverhouding. Stencil-gebaseerde patronen werden toegepast op silicium elastomeersubstraten.De gedessineerde cardiomyocyten op siliciumelastomersubstraten werden gevisualiseerd door immunocytochemie van harttroponine T bij lage vergroting en door sarcomeric eiwit alpha-actinine bij hoge vergroting. De stencil-gebaseerde patroon werd ook toegepast op patroon twee cardiomyocyten naast elkaar op hydrogels met verschillende stijfheid. De ontdekking van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcel en bijbehorende differentiatieprotocollen heeft dit tot een ideaal in vitro menselijk model gemaakt voor het bestuderen van oncogenese en pathogenese.Een belangrijke beperking van het gebruik van het IPS-systeem is echter het ontbreken van structuur aan de micro-omgeving, die een bijzondere biochemische samenstelling en stijfheid heeft om met cellen te communiceren. De patronen kunnen worden gecombineerd met tractiekracht microscopie en immunocytochemie testen om de structuur en functie van de cardiomyocyten te karakteriseren. Analyse van IPS-afgeleide celtypen, in ons geval cardiomyocyte, in een meer fysiologische morfologie opent mogelijkheden om uitdagende cardiomyocyten te bestuderen in cultuurschotel.De techniek kan ook worden toegepast op vele andere systemen, zoals en hoge inhoud screening platen. De vorm en het substraat kunnen gemakkelijk aan de toepassing worden aangepast.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos

Isolatie en karakterisering van enkele cellen van zebravis embryo&#39;s

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been ...

Epigenetic Conversion as a Safe and Simple Method to Obtain Insulin-secreting Cells from Adult Skin Fibroblasts

Epigenetische Conversie als een veilige en eenvoudige methode om insuline-afscheidende cellen van volwassen huidfibroblasten

Regenerative medicine requires new, fully functional cells that are delivered to patients in order to repair degenerated or damaged tissues. When such ...

Stencil Micropatterning of Human Pluripotent Stem Cells for Probing Spatial Organization of Differentiation Fates

Stencil micropatterning van menselijke pluripotente stamcellen voor Probing ruimtelijke organisatie van Differentiatie Fates

Human pluripotent stem cells (hPSCs), including embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells, have the intrinsic ability to differentiate into ...

Imaging Cleared Embryonic and Postnatal Hearts at Single-cell Resolution

Imaging Ontruimde embryonale en postnatale Hearts bij Single-cell Resolution

Single clonal tracing and analysis at the whole-heart level can determine cardiac progenitor cell behavior and differentiation during cardiac development, ...

A Simple Method to Identify Kinases That Regulate Embryonic Stem Cell Pluripotency by High-throughput Inhibitor Screening

Een eenvoudige methode om Kinases te identificeren die de embryonale stamcelpluripotency reguleren door middel van high-throughput inhibitor screening

Embryonic stem cells (ESCs) can self-renew or differentiate into all cell types, a phenomenon known as pluripotency. Distinct pluripotent states have been ...

High-resolution Episcopic Microscopy (HREM) - Simple and Robust Protocols for Processing and Visualizing Organic Materials

High-resolution Episcopic Microscopy HREM - Simple and Robust Protocols for Processing and Visualizing Organic Materials

Episcopische Microscopie met hoge resolutie (HREM) - Eenvoudige en robuuste protocollen voor het verwerken en visualiseren van organische materialen

We provide simple protocols for generating digital volume data with the high-resolution episcopic microscopy (HREM) method. HREM is capable of imaging ...

Single-Cell Quantification of Protein Degradation Rates by Time-Lapse Fluorescence Microscopy in Adherent Cell Culture

Eencellige kwantificering van eiwit afbraak tarieven door Time-Lapse fluorescentie microscopie in aanhangend celkweek

Proteins are in a dynamic state of synthesis and degradation and their half-lives can be adjusted under various circumstances. However, most commonly used ...

Clonal Analysis of Embryonic Hematopoietic Stem Cell Precursors Using Single Cell Index Sorting Combined with Endothelial Cell Niche Co-culture

Klonen analyse van embryonale hematopoietische stamcellen precursoren met eencellige Index sorteren gecombineerd met Endothelial Niche co celkweek

The ability to study hematopoietic stem cell (HSC) genesis during embryonic development has been limited by the rarity of HSC precursors in the early ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

Eencellige Photoconversion in levende Intact zebravis

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

Single-cell Transcriptomic Analyses of Mouse Pancreatic Endocrine Cells

Eencellige Transcriptomic Analyses van muis alvleesklier endocriene cellen

Pancreatic endocrine cells, which are clustered in islets, regulate blood glucose stability and energy metabolism. The distinct cell types in islets, ...