Name: simple lithography-free single cell micropatterning using laser-cut stencils
Uploaded: 2020-04-03T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Simple Lithography-Free Single Cell Micropatterning using Laser-Cut Stencils at JoVE.com

Diese Arbeit wurde durch ein Postdoktorandenstipendium des Stanford Child Health Research Institute (CHRI) und des National Institute of Health (1F32HL142205-01) an S.L. nIH Office of Director es Pioneer Award (LM012179-03), den American Heart Association Established Investigator Award (17EIA33410923), das Stanford Cardiovascular Institute, die Hoffmann and Schroepfer Foundation und die Stanford Division of Cardiovascular Medicine, Department of Medicine to S.M.W , Auszeichnungen des National Institute of Health (UG3 TR002588, P01 HL141084, R01 HL126527, R01 HL113006, R01 HL123968) and Tobacco-related Disease Research Program (TRDRP 27IR-0012) an J.C.W, den American Heart Association (AHA) Postdoctoral Fellowship Award (18POST34030106) an H.Y. und das Hengstberger-Stipendium an T.S. Wir danken Dr. Andrew Olsen vom Stanford Neuroscience Microscopy Service für die Unterstützung der konfokalen Bildgebung des mikropatterned hiPSC-CM. Wir danken H.Y. für das erste Schablonendesign, die Herstellung, die einzelzellige Mikromusterung von iPSC-CM auf dem polyacrylamidhydrogelbeschichteten Deckelschlupf und die vorläufige konfokale Abbildung der Sarcomere-Struktur von einzellig mikrogemusterten iPSC-CMs.

1. Herstellung von Polyimid-basierten Schablonen auf Negativmuster
<ol><li>Generieren Sie ein Muster(Abbildung 2A) im .dxf-Format mit computergestützter Designsoftware (z. B. AutoCAD, SolidWorks, Onshape, Adobe Illustrator).<ol>
<li>Generieren Sie einen Kreis (Durchmesser = 22 mm), um den Rahmen der Schablone abzugrenzen.</li>
		<li>Zeichnen Sie eine volumengefüllte Form oder das gewünschte Muster.</li>
		<li>Fügen Sie einen chiralen Buchstaben (z. B. R) ein, um die Vorderseite der Sch...

<ol>
	<li>Burridge, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+Defined+and+Small+Molecule-Based+Generation+of+Human+Cardiomyocytes.">Chemically Defined and Small Molecule-Based Generation of Human Cardiomyocytes.</a> Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).</li><li>Sayed, N., Liu, C., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translation+of+Human-Induced+Pluripotent+Stem+Cells:+From+Clinical+Trial+in+a+Dish+to+Precision+Medicine.">Translation of Human-Induced Pluripotent Stem Cells: From Clinical Trial in a Dish to Precision Medicine.</a> Journal of the American College of Cardiology. 67 (18), 2161-2176 (2016).</li><li>Ribeiro, A. J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contractility+of+single+cardiomyocytes+differentiated+from+pluripotent+stem+cells+depends+on+physiological+shape+and+substrate+stiffness.">Contractility of single cardiomyocytes differentiated from pluripotent stem cells depends on physiological shape and substrate stiffness.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (41), 12705-12710 (2015).</li><li>Kumar, A., Biebuyck, H. A., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterning+Self-Assembled+Monolayers:+Applications+in+Materials+Science.">Patterning Self-Assembled Monolayers: Applications in Materials Science.</a> Langmuir. 10 (5), 1498-1511 (1994).</li><li>Wilbur, J. L., Kumar, A., Kim, E., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfabrication+by+microcontact+printing+of+self-assembled+monolayers.">Microfabrication by microcontact printing of self-assembled monolayers.</a> Advanced Materials. 6 (7-8), 600-604 (1994).</li><li>Th&#233;ry, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micropatterning+as+a+tool+to+decipher+cell+morphogenesis+and+functions.">Micropatterning as a tool to decipher cell morphogenesis and functions.</a> Journal of Cell Science. 123 (24), 4201-4213 (2010).</li><li>Toepke, M. W., Beebe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PDMS+absorption+of+small+molecules+and+consequences+in+microfluidic+applications.">PDMS absorption of small molecules and consequences in microfluidic applications.</a> Lab on a Chip. 6 (12), 1484-1486 (2006).</li><li>Seeger, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Premature+Termination+Codon+Mutation+in+MYBPC3+Causes+Hypertrophic+Cardiomyopathy+via+Chronic+Activation+of+Nonsense-Mediated+Decay.">A Premature Termination Codon Mutation in MYBPC3 Causes Hypertrophic Cardiomyopathy via Chronic Activation of Nonsense-Mediated Decay.</a> Circulation. 139 (6), 799-811 (2019).</li><li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+PDGF+pathway+links+LMNA+mutation+to+dilated+cardiomyopathy.">Activation of PDGF pathway links LMNA mutation to dilated cardiomyopathy.</a> Nature. 572 (7769), 335-340 (2019).</li><li>Wu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+diastolic+dysfunction+in+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+from+hypertrophic+cardiomyopathy+patients.">Modelling diastolic dysfunction in induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes from hypertrophic cardiomyopathy patients.</a> European Heart Journal. 40 (45), 3685-3695 (2019).</li><li>Fischer, R. S., Myers, K. A., Gardel, M. L., Waterman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stiffness-controlled+three-dimensional+extracellular+matrices+for+high-resolution+imaging+of+cell+behavior.">Stiffness-controlled three-dimensional extracellular matrices for high-resolution imaging of cell behavior.</a> Nature Protocols. 7 (11), 2056-2066 (2012).</li><li>Lee, S., Stanton, A. E., Tong, X., Yang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogels+with+enhanced+protein+conjugation+efficiency+reveal+stiffness-induced+YAP+localization+in+stem+cells+depends+on+biochemical+cues.">Hydrogels with enhanced protein conjugation efficiency reveal stiffness-induced YAP localization in stem cells depends on biochemical cues.</a> Biomaterials. 202, 26-34 (2019).</li><li>Th&#233;ry, M., P&#233;pin, A., Dressaire, E., Chen, Y., Bornens, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+distribution+of+stress+fibres+in+response+to+the+geometry+of+the+adhesive+environment.">Cell distribution of stress fibres in response to the geometry of the adhesive environment.</a> Cell Motility. 63 (6), 341-355 (2006).</li><li>Kilian, K. A., Bugarija, B., Lahn, B. T., Mrksich, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geometric+cues+for+directing+the+differentiation+of+mesenchymal+stem+cells.">Geometric cues for directing the differentiation of mesenchymal stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (11), 4872-4877 (2010).</li></ol>

Wir beschreiben eine lithographiefreie, schablonenbasierte Mikromustermethode, die eine effektive Musterung von anhaftenden Zellen ermöglicht. In diesem Protokoll zeigen wir die Musterung von hiPSC-CMs in unterschiedlichen Längen-Breiten-Verhältnissen durch Mikromusterung von Kellermembran-Matrix-Proteininseln auf Polyacrylamid-Hydrogelen mit physiologisch- oder pathologisch relevanten Gewebesteifigkeiten oder siliziumbasierten Elastomersubstraten. Diese Methode ist relativ einfach und für alle Forscher sehr zugängl...

Das Aufkommen von hiPSCs und die anschließende Entwicklung von Protokollen für ihre gezielte Differenzierung in verschiedene Zelltypen haben es ermöglicht, Entwicklung und Krankheit auf molekularer und patientenspezifischer Ebene zu untersuchen, insbesondere mit patientenabgeleiteten iPSC-Kardiomyozyten (iPSC-CMs) zur Modellierung von Kardiomyopathien1,2. Eine wesentliche Einschränkung für das Studium der Entwicklung und Physiologie mit dem iPSC-System und anderen In-vitro-Modellen ist jedoch das Fehlen einer strukturierten Mikroumgebung. In situ werden Zellen den Einschränkungen der extrazellulären Matrix (ECM) sowie benachbarten Zellen unterworfen. Die besondere biochemische Zusammensetzung und Steifigkeit dieser Mikroumgebungen bestimmen die räumliche Verteilung der Zellen sowie die verfügbaren Faktoren für die Zellhaftung. Dies wiederum beeinflusst intrazelluläre Signalwege, Genexpression und Zellschicksalsbestimmung. Zum Beispiel hat mikrogemusterte iPSC-CM in einer erwachsenen-ähnlichen Stabform eine deutlich bessere Kontraktilität, Kalziumfluss, mitochondriale Organisation, Elektrophysiologie und Quer-Tubule-Bildung3. Somit sind die Eigenschaften der Mikroumgebung integraler Bestandteil der Regulierung zellulärer Funktionen.
Frühere Mikromustertechniken stützten sich stark auf die Photolithographie (Abbildung 1A). Bei dieser Technik wird eine Schicht aus lichtempfindlichem Polymer oder Photoresist auf einem flachen Substrat aus der Lösung gesponnen, um einen dünnen Film zu bilden, der etwa 1 m dick ist. Als nächstes wird ultraviolettes (UV) Licht durch eine Maske, die das gewünschte Muster enthält, auf den Photoresist aufgetragen. Die Exposition gegenüber ultraviolettem (UV) Licht verändert den Photowiderstand chemisch, indem er seine Löslichkeit in der jeweiligen Entwicklerlösung ändert und das gewünschte Muster von der Maske auf das Substrat überträgt. Viele Mikromustermethoden beinhalten photolithographie, da sie Nanometer-Mikrometer-Ebene Kontrolle über die Gestaltung der Zellmuster verleiht. Das Spinnen des Photoresists ist jedoch sehr empfindlich gegenüber Verunreinigungen, da die kleinsten Staubpartikel die Ausbreitung der Lösung in einen dünnen Film stören. Die Photolithographie muss daher in nicht kontaminierten Anlagen durchgeführt werden, die kostspielig zu warten sind und besondere Fachkenntnisse erfordern. Darüber hinaus sind die in der Photolithographie verwendeten Chemikalien oft toxisch für Zellen und können wichtige Biomoleküle denaturieren. Die Photolithographie stellt somit erhebliche Hindernisse für die Herstellung von Mikromustern für bequeme biologische Anwendungen dar.
1994 meisterte Whitesides und Kollegen4 einige der Herausforderungen im Zusammenhang mit der Photolithographie, indem sie eine Sammlung von Techniken namens Soft Lithographie voranbringen. In der weichen Lithographie wird eine mikrostrukturierte Oberfläche aus Polydimethylsiloxan (PDMS), einem transparenten, gummiähnlichen Material, verwendet, um ein Muster von ECM-Proteinen4zu erzeugen. Häufige Soft-Lithographie-Techniken umfassen Mikrokontaktdruck und mikrofluidische Musterung. Im Mikrokontaktdruck, der derzeit beliebtesten Softlithographie-Methode, überträgt ein mit ECM-Proteinen beschichteter PDMS-Stempel das Material auf eine Oberfläche an den durch den Stempel kontaktierten Bereichen (Abbildung 1B). In der mikrofluidischen Musterung werden Mikrostrukturen auf einer PDMS-Oberfläche so konstruiert, dass beim Drücken des Stempels auf ein Substrat ein Netzwerk von Mikrokanälen entsteht, durch das Flüssigkeiten in gewünschte Bereiche geliefert werden können (Abbildung 1C)5. Weiche Lithographie bietet mehrere Vorteile gegenüber der Photolithographie. Sobald ein Master-Wafer mikrofabriziert ist, können die PDMS-Stempel ohne weiteren Einsatz von Reinraumanlagen einfach repliziert werden. Darüber hinaus ermöglicht das Fehlen organischer Lösungsmittel im Prozess der weichen Lithographie die Verwendung von polymeren Materialien wie Polystyrol, das typischerweise in der Zellkultur verwendet wird. Schließlich ist die Mikromusterung mit weichen lithographischen Methoden nicht auf flache Oberflächen beschränkt. So erhöht die weiche Lithographie die Zugänglichkeit und Funktionalität der Mikromusterfertigung gegenüber der Photolithographie6. Die weiche Lithographie hat jedoch erhebliche Nachteile. Zum Beispiel ist ein erster Ätzschritt mit Hilfe der Photolithographie immer noch erforderlich, um den Stempel mikrofabrizieren zu können. Darüber hinaus unterliegt die Mikromusterung mit einem PDMS-Stempel Schwankungen in der Qualität des Proteintransfers auf das Substrat6. Um diese Diskrepanzen zu vermeiden, ist eine Optimierung und Konsistenz des Drucks erforderlich, der während des Proteintransfers auf den PDMS-Stempel ausgeübt wird, da sonst Verformungen und Verzerrungen der Merkmalsgrößen der PDMS-Formen auftreten können6. Es gibt auch ein großes Problem der wiederholten Verwendung des PDMS aufgrund der kleinen Molekülabsorption7.
Um die Verwendung weicher Photolithographie und PDMS-Stempel zu vermeiden, beschreiben wir eine schablonenbasierte, lithographiefreie Einzelzell-Mikromustermethode, die viele der Hindernisse im Zusammenhang mit Photolithographie und weicher Lithographie überwindet. Bei diesem Verfahren wird ein Polyacrylamidhydrogel als Substrat für die Verwendung von ECM-Protein auf Schablonenbasis verwendet, was eine selektive Beschichtung einzelner hiPSC-CMs ermöglicht. Diese Technik ist hochkompatibel mit polymeren Materialien, die in klassischen Zellkulturbedingungen verwendet werden. Darüber hinaus sind die Schablonen bei ordnungsgemäßer Reinigung und Wartung wiederverwendbar und resistent gegen Abbau und Proteinabsorption während des Mikroherstellungsprozesses. Schließlich ist der Musterprozess technisch robust, kostengünstig, anpassbar und zugänglich für diejenigen ohne spezialisierte Bioengineering-Fähigkeiten. Diese schablonenbasierte Mikromustertechnik wurde in unseren jüngsten Veröffentlichungen zur Modellierung verschiedener Kardiomyopathien8,9,10breite Nutzungen erzielt.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Aminoethyl methacrylate hydrochloride (powder)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>516155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide solution 40% (solution)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A-4058-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bench UV lamp 365 nm</td>
			<td>UVP</td>
			<td>UVP 95-0042-07, XX-15L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioFlex culture plate</td>
			<td>FLEXCELL INTERNATIONAL CORPORATION, Burlington, NC</td>
			<td></td>
			<td>6-well plate with silicon elastomer substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bis-acrylamide solution 2% (solution)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1533-25mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning cover glasses square, No. 2, W &#215; L 22 mm &#215; 22 mm</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CLS285522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Irgacure (2-Hydroxy-4&#8242;-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone) (powder)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>410896</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td>basement membrane matrix protein solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl sulfoxide, 99.7+%, Extra Dry, AcroSeal, ACROS Organics</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>326881000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex (13mm) filter unit with Durapore Membrane</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGV013SL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millipore 50mL Steriflip (0.22 &#181;m)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SCGP00525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stencils</td>
			<td>Potomac</td>
			<td>custom design</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfo-SANPAH</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>22589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Select 10x</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A1217702</td>
			<td>Enzyme used for stencil cleaning</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simple lithography-free single cell micropatterning using laser-cut stencils

Mikromustertechniken wurden in der Zellbiologie weit verbreitet, um die Auswirkungen der Kontrolle der Zellform und -größe auf die Bestimmung des Zellschicksals bei Einzelzellauflösung zu untersuchen. Aktuelle, hochmoderne Einzelzell-Mikromustertechniken beinhalten weiche Lithographie und Mikrokontaktdruck, eine leistungsfähige Technologie, erfordert jedoch geschulte Ingenieurskunst und eine gewisse Unterstützung in der Mikrofertigung. Diese Einschränkungen erfordern eine leichter zugängliche Technik. Hier beschreiben wir eine einfache alternative lithographiefreie Methode: schablonenbasierte Einzelzellmusterung. Wir bieten Schritt-für-Schritt-Verfahren wie Schablonendesign, Polyacrylamid-Hydrogel-Fertigung, Schablonen-basierte Protein-Inkorporation, zell-plating und Kultur. Diese einfache Methode kann verwendet werden, um ein Array von bis zu 2.000 Zellen zu modellieren. Wir zeigen die Musterung von Kardiomyozyten, die aus einzelnen menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSC) mit unterschiedlichen Zellformen abgeleitet werden, von einem 1:1-Quadrat bis zu einem 7:1-Erwachsenen-Kardiomyozyten-ähnlichen Rechteck. Diese schablonenbasierte Einzelzellmusterung ist lithographiefrei, technisch robust, bequem, kostengünstig und vor allem für Personen mit eingeschränktem Bioengineering-Hintergrund zugänglich.

Die Herstellung von Schablonen, die ein Array von Quadraten oder Rechtecken enthalten, wurde demonstriert (Abbildung 4A). Nach diesem Protokoll erhielten wir gemusterte Matrixproteininseln (Abbildung 4B und Abbildung 5A) und Zellen (Abbildung 4C). Die suboptimale Matrixproteinlösungskonzentration führte zu suboptimalen Mustern (Abbildung 5B). Es ist wichtig, die Vordersei...

Watch this Scientific Journal Video about Simple Lithography-Free Single Cell Micropatterning using Laser-Cut Stencils at JoVE.com

Simple Lithography-Free Single Cell Micropatterning using Laser-Cut Stencils

Dieses Protokoll führt eine lithographiefreie Mikromustermethode ein, die einfach und zugänglich für Personen mit einem begrenzten Bioengineering-Hintergrund ist. Diese Methode verwendet maßgeschneiderte lasergeschnittene Schablonen, um extrazelluläre Matrixproteine in einer Form von Interesse für die Modulation von Zellmorphologien mikromustern zu lassen. Das Verfahren zur Mikromusterung wird mit induzierten pluripotenten Stammzellabgeleiteten Kardiomyozyten demonstriert.

Einfache Lithographie-freie Einzelzell-Mikromusterung mit Laser-Cut Schablonen

Micropatterning techniques have been widely used in cell biology to study effects of controlling cell shape and size on cell fate determination at single ...

Wir beschreiben eine schablonenbasierte lithographiefreie Einzelzell-Mikromustermethode, die viele Hindernisse im Zusammenhang mit Photolithographie und weicher Lithographie überwindet. Die Schablonen sind wiederverwendbar und der Prozess ist kostengünstig und anpassbar. Diese Methode eröffnete nicht-technischen Forschern einen neuen Weg, um die Zellform und die flächeninduzierte Mechanotransduktion in verschiedenen physiologischen und pathologischen Kontexten zu untersuchen.Darüber hinaus ermöglicht dieses Protokoll die Mikromusterung von Tausenden von Zellen, die für das Screening von Arzneimitteln mit hohem Durchsatz und die Modellierung von Krankheiten in einer Schale verwendet werden können. Visuelle Demonstration wird die Implantation von zwei entscheidenden Schritten erleichtern: Ablösung von Deckelrutsch von Hydrogel, Trocknen Hydrogel ausreichend vor dem Platzieren der Schablone. Bereiten Sie die Polyacrylamid-Hydrogellösung in einem neuen 50 Milliliter Propylenzentrifugenrohr vor, wie im Manuskript beschrieben.Als nächstes, um die 5%Photoinitiator-Lösung vorzubereiten, lösen Sie die Zutaten in 700 Mikroliter von 100%Ethanol auf. Die Zutaten sind nicht wasserlöslich, also achten Sie darauf, sich vollständig durch Wirbel aufzulösen. Fügen Sie 300 Mikroliter PBS für ein endgültiges Volumen von einem Milliliter hinzu.Arbeiten auf Eis, verdünnt Keller Membran Matrix Protein-Stock-Lösung mit eiskalten DMEM F12 Medien oder 1X PBS auf das optimierte Verdünnungsverhältnis. Halten Sie auf Eis für den späteren Gebrauch. Achten Sie bei der Arbeit mit der Kellermembranmatrix darauf, immer auf Eis zu arbeiten und eiskalte Lösungen in gekühlten Pipettenspitzen und -rohren zu verwenden.Legen Sie eine UV-Tischleuchte in eine biologische Sicherheitshaube. Als nächstes stellen Sie die zuvor vorbereiteten sterilisierten Paraffinfolien auf. Wenn die Paraffinfolien nicht vollständig trocken sind, verwenden Sie ein Vakuum-Aspirationssystem, um Restflüssigkeit zu entfernen.Mit autoklavierten Zangen legen Sie sechs autoklavierte Abdeckungen auf den Paraffinfilm sechs in jeder Petrischale. Zur Herstellung der UV-verklinkbaren Polyacrylamid-Endlösung die Photoinitiatorlösung mit der Polyacrylamid-Hydrogel-Vorläuferlösung verdünnen. Sterilisieren Sie die Lösung mit einer 50-Milliliter-Filtereinheit mit einer Porengröße von 0,22 Mikrometern.Dann geben Sie 200 Mikroliter UV-verklinkbare Polyacrylamid-Endlösung auf jede der sechs Glasabdeckungen in den Petrischalen. Mit autoklavierten Zangen, sorgfältig abdecken jeden Abdeckungsslip mit einem zweiten Deckelrutsch, der eine Schicht der Lösung zwischen den beiden Abdeckungen einfängt. Legen Sie die Petri-Schalen mit den Abdeckungen unter die UV-Tischlampe mit dem Deckel unverschlossen.Die Abdeckung von weißem Papier auf der nicht-weißen Oberfläche ist wichtig, um den UV-Intensitätsverlust zu minimieren. Zum Schutz vor UV-Strahlung, decken Sie die Lampe mit Aluminiumfolie. Photopolymerisieren Sie die Polyacrylamid-Hydrogele für fünf Minuten.Verwenden Sie eine Rasierklinge, um jedes Paar Deckenlippen sorgfältig zu trennen. Füllen Sie das Reservoir mit sechs Hydrogel-Abdeckungs-Verbundwerkstoffen mit PBS. Nach dem Spülen für fünf Minuten, geben Sie die Hydrogel-Abdeckungsrutsch-Verbundwerkstoffe in die Paraffinfolie in der Petrischale zurück.Erhalten Sie eine Röhre Sulfo-SANPAH aus der Lagerung bei minus 80 Grad Celsius. Fügen Sie 1, 200 Mikroliter vorgekühlten PBS in das Rohr und mischen Sie durch Pipettieren nach oben und unten. 200 Mikroliter des verdünnten Sulfo-SANPAH in der Petrischale auf den Paraffinfilm geben.Legen Sie einen Hydrogel-Abdeckungs-Verbundstoff über den Sulfo-SANPAH mit dem Hydrogel, das den Sulfo-SANPAH kontaktiert. Als nächstes legen Sie die Hydrogel-Abdeckungs-Verbundwerkstoffe unter die UV-Lampe und setzen sie für fünf Minuten aus, um den Sulfo-SANPAH zu aktivieren. Wenn sich der Sulfo-SANPAH von orange zu braun dreht und eine erfolgreiche Aktivierung und Einarbeitung anzeigt, fahren Sie innerhalb von 10 Minuten mit den nächsten Schritten fort.Füllen Sie das Einweg-Polypropylen-Reservoir mit frischem PBS auf. Übertragen Sie die aktivierten Hydrogel-Abdeckungs-Verbundwerkstoffe in das Reservoir und spülen Sie sie kurz aus, um ungebundenes Sulfo-SANPAH zu entfernen. Die Hydrogel-Abdeckungsrutsch-Verbundwerkstoffe auf die Paraffinfolie in die Petrischalen legen und sorgfältig mit sterilen fusselfreien Tüchern abziehen.Legen Sie eine Schablone auf jeden Hydrogel-Abdeckungs-Verbund. Um eine enge Abdichtung zwischen Schablone und Verbundwerkstoff zu gewährleisten, entfernen Sie überschüssige Feuchtigkeit, indem Sie mit autoklavierten fusselfreien Tüchern dabben. Geben Sie vorsichtig die verdünnte Kellermembran-Matrix-Proteinlösung aus, die 200 Mikroliter auf jedem Hydrogel-Abdeckungsverbund platziert.Inkubieren Sie die Konstrukte über Nacht bei 37 Grad Celsius. Am nächsten Tag die Verbundwerkstoffe auf eine Sechs-Brunnen-Platte übertragen. Eine enge Abdichtung zwischen Hydrogel und Schablone kann leicht validiert werden, indem beobachtet wird, ob die Matrixproteinlösung auf der Schablone erhalten geblieben ist.Wenn keine enge Dichtung entfällt, führt dies zu einem schnellen Leck der Proteinlösung durch die Löcher. Tauchen Sie die Verbundwerkstoffe vollständig in PBS ein. Mit autoklavierter Pinzette die Schablonen vorsichtig von den Hydrogelen lösen, ohne die Hydrogele zu zerreißen.Entfernen Sie die PBS aus den Brunnen und füllen Sie die Brunnen mit DMEM auf. Inkubieren Sie die Platte über Nacht bei 37 Grad Celsius. Nachdem Sie die Platte aus dem Inkubator entfernt haben, untersuchen Sie die DMEM.Wenn das DMEM nicht trübe ist, können die Hydrogel-Abdeckungs-Verbundwerkstoffe für die Zellbeschichtung verwendet werden. Schablonen wurden mit Arrays von Quadraten und Rechtecken hergestellt. Aus den Schablonen und Inseln des Matrixproteins wurden mikrogemusterte Hydrogelsubstrate hergestellt.Zellinseln wurden ebenfalls erhalten. Zum Beispiel Inseln von vom Menschen induzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Kardiomyozyten. Die Matrixproteinkonzentration spielte eine wesentliche Rolle bei der Erzeugung richtiger Muster.Eine optimale Konzentration führte zu einer homogenen Verteilung von Proteinen. Suboptimale Matrixproteinlösungskonzentrationen führten zu suboptimalen Mustern. Es ist wichtig, die Vorderseite der Schablone zu verwenden.Wenn die Rückseite der Schablone verwendet wird, erhöht sich die Größe der Matrixproteininseln aufgrund der Richtung des Laserschneidens. Während die Verwendung der Rückseite der Schablone die Breite der rechteckigen Muster nicht signifikant beeinflusste, erhöhte sich die Höhe signifikant, was zu einer Verringerung des beabsichtigten Seitenverhältnisses führte. Schablonenbasierte Musterung wurde auf Siliziumelastomersubstrate angewendet.Die gemusterten Kardiomyozyten auf Siliziumelastomersubstraten wurden durch Immunzytochemie des Kardialtroponins T bei geringer Vergrößerung und durch sarkomisches Protein Alpha-Actinin bei hoher Vergrößerung visualisiert. Die schablonenbasierte Musterung wurde auch auf Muster zwei Kardiomyozyten nebeneinander auf Hydrogele mit unterschiedlichen Steifigkeiten angewendet. Die Entdeckung von vom Menschen induzierten pluripotenten Stammzellen und entsprechenden Differenzierungsprotokollen hat dies zu einem idealen in vitro menschlichen Modell für die Untersuchung von Onkogenese und Pathogenese gemacht.Eine wesentliche Einschränkung der Verwendung des IPS-Systems ist jedoch das Fehlen von Struktur für die Mikroumgebung, die eine besondere biochemische Zusammensetzung und Steifigkeit hat, um mit Zellen zu interagieren. Die Musterung kann mit Traktionskraftmikroskopie und Immunzytochemie-Assays kombiniert werden, um die Struktur und Funktion der Kardiomyozyten zu charakterisieren. Die Analyse von IPS-abgeleiteten Zelltypen, in unserem Fall Kardiomyozyten, in einer physiologischeren Morphologie eröffnet Möglichkeiten, herausfordernde Kardiomyozyten in Kulturgericht zu studieren.Die Technik kann auch auf viele andere Systeme wie und hochklassare Siebplatten angewendet werden. Form und Substrat lassen sich leicht an die Anwendung anpassen.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos

Isolierung und Charakterisierung von Einzelzellen aus Zebrafischembryonen

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Epigenetic Conversion as a Safe and Simple Method to Obtain Insulin-secreting Cells from Adult Skin Fibroblasts

Epigenetische Umwandlung als eine sichere und einfache Methode, Insulin absondernden Zellen aus adulten Fibroblasten der Haut zu erhalten

Regenerative medicine requires new, fully functional cells that are delivered to patients in order to repair degenerated or damaged tissues. When such ...

Stencil Micropatterning of Human Pluripotent Stem Cells for Probing Spatial Organization of Differentiation Fates

Stencil Mikrostrukturierung von humanen pluripotenten Stammzellen für die Sondierung räumliche Organisation Differenzierung Fates

Human pluripotent stem cells (hPSCs), including embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells, have the intrinsic ability to differentiate into ...

Imaging Cleared Embryonic and Postnatal Hearts at Single-cell Resolution

Imaging Gelöscht Embryonale und postnatale Hearts bei Einzelzell-Auflösung

Single clonal tracing and analysis at the whole-heart level can determine cardiac progenitor cell behavior and differentiation during cardiac development, ...

A Simple Method to Identify Kinases That Regulate Embryonic Stem Cell Pluripotency by High-throughput Inhibitor Screening

Eine einfache Methode zur Identifizierung von Kinasen, die die embryonale Stammzell-Pluripotenz durch Hochdurchsatz-Inhibitor-Screening regulieren

Embryonic stem cells (ESCs) can self-renew or differentiate into all cell types, a phenomenon known as pluripotency. Distinct pluripotent states have been ...

High-resolution Episcopic Microscopy (HREM) - Simple and Robust Protocols for Processing and Visualizing Organic Materials

High-resolution Episcopic Microscopy HREM - Simple and Robust Protocols for Processing and Visualizing Organic Materials

Hochauflösende episkopische Mikroskopie (HREM) - Einfache und robuste Protokolle zur Verarbeitung und Visualisierung von organischen Materialien

We provide simple protocols for generating digital volume data with the high-resolution episcopic microscopy (HREM) method. HREM is capable of imaging ...

Single-Cell Quantification of Protein Degradation Rates by Time-Lapse Fluorescence Microscopy in Adherent Cell Culture

Einzellige Quantifizierung der Protein-Abbauraten von Time-Lapse Fluoreszenzmikroskopie in adhärente Zellkultur

Proteins are in a dynamic state of synthesis and degradation and their half-lives can be adjusted under various circumstances. However, most commonly used ...

Clonal Analysis of Embryonic Hematopoietic Stem Cell Precursors Using Single Cell Index Sorting Combined with Endothelial Cell Niche Co-culture

Klonale Analyse der embryonalen Hämatopoetischen Stammzellen Vorstufen mit einzelligen Index sortieren kombiniert mit Endothelzellen Nischenkultur Co

The ability to study hematopoietic stem cell (HSC) genesis during embryonic development has been limited by the rarity of HSC precursors in the early ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

Einzellige Ladungszustand im lebendigen intakten Zebrafisch

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

Single-cell Transcriptomic Analyses of Mouse Pancreatic Endocrine Cells

Einzellige Transkriptomischen Analysen der Maus endokrinen Zellen der Bauchspeicheldrüse

Pancreatic endocrine cells, which are clustered in islets, regulate blood glucose stability and energy metabolism. The distinct cell types in islets, ...