Name: simple lithography-free single cell micropatterning using laser-cut stencils
Uploaded: 2020-04-03T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Simple Lithography-Free Single Cell Micropatterning using Laser-Cut Stencils at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי מלגת פוסט דוקטורט מאוניברסיטת סטנפורד מחקר הבריאות המכון (חג המולד) והמכון הלאומי לבריאות (1F32HL142205-01) ל-S. L, משרד NIH של פרס פיוניר של הבמאי (LM012179-03), איגוד הלב האמריקאי הוקמה פרס החוקר (17EIA33410923), המכון לרפואת לב וכלי דם של סטנפורד, קרן הופמן ושרדינגר, ואת החטיבה סטנפורד של תרופות לב וכלי דם, המחלקה לרפואה של ס. מ. W , פרסים מן המכון הלאומי לבריאות (UG3 TR002588, P01 HL141084, R01 HL126527, R01 HL113006, R01 HL123968) ו-טבק הקשורים מחקר תוכנית (TRDRP 27IR-0012) ל-J. C. W, איגוד הלב האמריקני (AHA) פרס פוסט דוקטורט (18POST34030106) ל H. Y, ואת המענק Hengstberger ל ט אנו מודים ד ר אנדרו אולסן שירות מיקרוסקופ מדעי המוח על התמיכה של הדמיה קונפוקלית וקד של היפנוגרף-CM. אנו מודים לח על עיצוב הסטנסיל הראשון, ייצור, תא בודד מיקרוגרף של ipsc-CM על שמיכות פוליאקרילמיד הידרוג'ל מצופה, ו הדמיה מיקוד ראשוני של המבנה סרקומר של תא יחיד מיקרותבנית ipsc-CMs.

1. הייצור של שלילי דפוס polyimide מבוססי סטנסילים
<ol><li>יצירת תבנית (איור 2 א) בתבנית. dxf באמצעות תוכנת עיצוב בעזרת מחשב (לדוגמה, AutoCAD, Solidworks, Onshape, Adobe Illustrator).<ol>
<li>צור עיגול (קוטר = 22 מ"מ) כדי להתוות את הגבול של הסטנסיל.</li>
		<li>צייר צורה מלאת מוצק או את התבנית הרצויה.</li>
		<li>כלול מכתב כירא?...

<ol>
	<li>Burridge, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+Defined+and+Small+Molecule-Based+Generation+of+Human+Cardiomyocytes.">Chemically Defined and Small Molecule-Based Generation of Human Cardiomyocytes.</a> Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).</li><li>Sayed, N., Liu, C., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translation+of+Human-Induced+Pluripotent+Stem+Cells:+From+Clinical+Trial+in+a+Dish+to+Precision+Medicine.">Translation of Human-Induced Pluripotent Stem Cells: From Clinical Trial in a Dish to Precision Medicine.</a> Journal of the American College of Cardiology. 67 (18), 2161-2176 (2016).</li><li>Ribeiro, A. J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contractility+of+single+cardiomyocytes+differentiated+from+pluripotent+stem+cells+depends+on+physiological+shape+and+substrate+stiffness.">Contractility of single cardiomyocytes differentiated from pluripotent stem cells depends on physiological shape and substrate stiffness.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (41), 12705-12710 (2015).</li><li>Kumar, A., Biebuyck, H. A., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterning+Self-Assembled+Monolayers:+Applications+in+Materials+Science.">Patterning Self-Assembled Monolayers: Applications in Materials Science.</a> Langmuir. 10 (5), 1498-1511 (1994).</li><li>Wilbur, J. L., Kumar, A., Kim, E., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfabrication+by+microcontact+printing+of+self-assembled+monolayers.">Microfabrication by microcontact printing of self-assembled monolayers.</a> Advanced Materials. 6 (7-8), 600-604 (1994).</li><li>Th&#233;ry, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micropatterning+as+a+tool+to+decipher+cell+morphogenesis+and+functions.">Micropatterning as a tool to decipher cell morphogenesis and functions.</a> Journal of Cell Science. 123 (24), 4201-4213 (2010).</li><li>Toepke, M. W., Beebe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PDMS+absorption+of+small+molecules+and+consequences+in+microfluidic+applications.">PDMS absorption of small molecules and consequences in microfluidic applications.</a> Lab on a Chip. 6 (12), 1484-1486 (2006).</li><li>Seeger, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Premature+Termination+Codon+Mutation+in+MYBPC3+Causes+Hypertrophic+Cardiomyopathy+via+Chronic+Activation+of+Nonsense-Mediated+Decay.">A Premature Termination Codon Mutation in MYBPC3 Causes Hypertrophic Cardiomyopathy via Chronic Activation of Nonsense-Mediated Decay.</a> Circulation. 139 (6), 799-811 (2019).</li><li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+PDGF+pathway+links+LMNA+mutation+to+dilated+cardiomyopathy.">Activation of PDGF pathway links LMNA mutation to dilated cardiomyopathy.</a> Nature. 572 (7769), 335-340 (2019).</li><li>Wu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+diastolic+dysfunction+in+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+from+hypertrophic+cardiomyopathy+patients.">Modelling diastolic dysfunction in induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes from hypertrophic cardiomyopathy patients.</a> European Heart Journal. 40 (45), 3685-3695 (2019).</li><li>Fischer, R. S., Myers, K. A., Gardel, M. L., Waterman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stiffness-controlled+three-dimensional+extracellular+matrices+for+high-resolution+imaging+of+cell+behavior.">Stiffness-controlled three-dimensional extracellular matrices for high-resolution imaging of cell behavior.</a> Nature Protocols. 7 (11), 2056-2066 (2012).</li><li>Lee, S., Stanton, A. E., Tong, X., Yang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogels+with+enhanced+protein+conjugation+efficiency+reveal+stiffness-induced+YAP+localization+in+stem+cells+depends+on+biochemical+cues.">Hydrogels with enhanced protein conjugation efficiency reveal stiffness-induced YAP localization in stem cells depends on biochemical cues.</a> Biomaterials. 202, 26-34 (2019).</li><li>Th&#233;ry, M., P&#233;pin, A., Dressaire, E., Chen, Y., Bornens, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+distribution+of+stress+fibres+in+response+to+the+geometry+of+the+adhesive+environment.">Cell distribution of stress fibres in response to the geometry of the adhesive environment.</a> Cell Motility. 63 (6), 341-355 (2006).</li><li>Kilian, K. A., Bugarija, B., Lahn, B. T., Mrksich, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geometric+cues+for+directing+the+differentiation+of+mesenchymal+stem+cells.">Geometric cues for directing the differentiation of mesenchymal stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (11), 4872-4877 (2010).</li></ol>

אנו מתארים שיטת המיקרו-מיקרוגרפיה המבוססת על סטנסיל, המאפשרת בחירה יעילה של תאים חסיד. בפרוטוקול זה, אנו מדגימים הפנינג של היסק-CMs ביחס אורך-לרוחב שונים על ידי מיקרופתנינג מטריקס קרום הממברנה איי החלבון על הידרואקרילאמיד הידרו עם מבחינה פיזיולוגית או פתולוגית הרלוונטיות רקמות או הסיליקו?...

הופעתו של hiPSCs ואת הפיתוח הבאים של פרוטוקולים עבור הבידול שלהם בבימויו של סוגי תאים שונים הפכו את זה אפשרי ללמוד פיתוח ומחלות ברמה מולקולרית ומטופל ספציפי, במיוחד באמצעות החולה נגזר ipsc קרדיוציטים (ipsc-CMs) לדגם cardiomyopathies1,2. עם זאת, מגבלה מרכזית לחקר התפתחות ופיזיולוגיה באמצעות מערכת iPSC ואחרים במודלים חוץ גופית היא העדר מיקרוסביבה מובנית. באתרו, תאים חשופים האילוצים של מטריצה החילוץ (ECM), כמו גם תאים שכנים. ההרכב הביוכימי המסוים והקשיחות של מיקרוסביבות אלה מכתיבים את התפלגות המרחב של תאים, כמו גם גורמים זמינים לעוסקים הדבקה תא. זה, בתורו, משפיע תאיים מסלולים איתות, ביטוי גנים, ונחישות הגורל התא. לדוגמה, iPSC-CM מיקרותבנית בצורת מבוגר כמו מוט יש יכולת כושר טובה יותר באופן משמעותי, זרימת סידן, ארגון מיטוכונדריאלי, אלקטרופיזיולוגיה, ו-כדורית רוחבי היווצרות3. לפיכך, תכונות המיקרו-סביבה הן בלתי-מהותי בוויסות התפקודים הסלולאריים.
טכניקות המיקרו-מיקרוגרפיה הקודמות הסתמכות בכבדות על פוטוליטוגרפיה (איור 1A). בטכניקה זו, שכבה של פולימר לאור, או photoresist, הוא סובב על מצע שטוח מהפתרון כדי ליצור סרט דק על 1 יקרומטר עבה. הבא, אולטרה סגול (UV) האור מוחל על photoresist באמצעות מסכה המכילה את התבנית הרצויה. חשיפה לאולטרה סגול (UV) אור כימית משנה את הphotoresist על ידי שינוי מסיסות שלה בפתרון המפתחים בהתאמה שלה, העברת התבנית הרצויה מן המסכה על מצע. שיטות רבות למיקרו-מיקרוגרפיה משלבות פוטוליטוגרפיה, כפי שהיא משלבת ננו כדי לשלוט ברמת מיקרומטר על העיצוב של דפוסי התא. עם זאת, ספינינג של photoresist הוא רגיש מאוד זיהומים, כי חלקיקי האבק הקטן ביותר יהיה לשבש את התפשטות הפתרון לתוך סרט דק. הפוטוליתוגרפיה חייב להתבצע במתקנים לא מזוהמים, אשר יקרים לשמור ודורשים מומחיות מיוחדת כדי לנצל. בנוסף, הכימיקלים המשמשים בפוטוגרפיה הם לעתים קרובות רעילים לתאים והוא יכול לbiomolecules חשוב. לפיכך, פוטוליתוגרפיה מהווה מכשולים משמעותיים לייצור מיקרודפוסים עבור יישומים ביולוגיים נוחים.
ב 1994, Whitesides ועמיתים4 התגברו על כמה אתגרים הקשורים בפוטוגרפיה על ידי החלוצי אוסף של טכניקות שנקרא ליתוגרפיה רכה. ב ליתוגרפיה רך, משטח מובנה שנעשה עם polydiמתיל siloxane (PDMS), חומר שקוף, כמו גומי, משמש להפקת דפוס של חלבונים ECM4. טכניקות ליטוגרפיה רכות נפוצות כוללות הדפסה במיקרומגע והדפס מיקרופלואידיג. בדפוס microcontact, כיום שיטת הליתוגרפיה הרכה הפופולרית ביותר, חותמת PDMS מצופה בחלבונים של ECM מעבירה את החומר על פני השטח באזורים שאליהם נוצר החותם (איור 1B). In מיקרופלואידיג, מיקרומבנים מתוכננים על פני משטח PDMS כגון, כאשר החותמת היא לחצה על מצע, רשת של מיקרוערוצים, שדרכו ניתן להעביר נוזלים לאזורים הרצויים, נוצר (איור 1C)5. ליתוגרפיה רכה מציעה מספר יתרונות על פני פוטוגרפיה. לאחר וופל מאסטר הוא מיקרופוברק, בולים PDMS ניתן בקלות לשכפל ללא תעסוקה נוספת של מתקני חדר נקי. בנוסף, העדר ממיסים אורגניים בתהליך של ליתוגרפיה רכה מאפשר ניצול של חומרים פולימריים כגון פוליסטירן, בדרך כלל בשימוש בתרבות התא. לבסוף, מיקרוגרף שימוש בשיטות ליטוגרפיה רכות אינו מוגבל למשטחים שטוחים. לכן, ליתוגרפיה רכה מגבירה את הנגישות והפונקציונליות של ייצור מיקרותבניות על גבי פוטוליתוגרפיה6. עם זאת, ליתוגרפיה רכה יש חסרונות משמעותיים. לדוגמה, שלב התחריט ההתחלתי, שימוש בפוטוגרפיה, עדיין נדרש למיקרו-הרכיבו את החותמת. בנוסף, מיקרופילנינג באמצעות חותמת PDMS כפוף וריאציות באיכות של העברת חלבון על מצע6. הימנעות מסתירות אלה דורשת אופטימיזציה ועקביות בלחץ המוחל על החותמת של PDMS במהלך העברת החלבון, הדפורמציה אחרת ועיוות של גודל התכונה של תבניות PDMS יכול להתרחש6. יש גם דאגה עיקרית של השימוש שוב ושוב PDMS בשל ספיגת מולקולה קטנה7.
כדי למנוע באמצעות פוטוגרפיה רך ו-PDMS בולים, אנו מתארים מבוססי סטנסיל, ליתוגרפיה בודדת תא השיטה מיקרודפוס הגוברת על רבים של המכשולים הקשורים בפוטוגרפיה וליתוגרפיה רך. בשיטה זו, משמש הידרואקרילאמיד בתור מצע עבור התאגדות חלבון ECM מבוסס סטנסיל, המאפשר ציפוי סלקטיבי של היפנוסק-CMs יחיד. טכניקה זו מתאימה מאוד לחומרים פולימריים המשמשים בתנאי תרבות תאים קלאסיים. יתר על כן, עם ניקוי ותחזוקה נאותים, הסטנסילים הם הניתנים לשימוש חוזר ועמידים בפני השפלה וספיגת החלבון במהלך תהליך המיקרוייצור. לבסוף, תהליך העיבוד הוא מבחינה טכנית יציב, זול, להתאמה אישית, ונגיש לאלה ללא כישורים bioהנדסאים מיוחדים. זו טכניקה מיקרומניפולציה מבוססי סטנסיל כבר מנוצל באופן כללי ב שלנו פרסומים האחרונים מידול מגוונת cardiomyopathies8,9,10.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Aminoethyl methacrylate hydrochloride (powder)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>516155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide solution 40% (solution)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A-4058-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bench UV lamp 365 nm</td>
			<td>UVP</td>
			<td>UVP 95-0042-07, XX-15L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioFlex culture plate</td>
			<td>FLEXCELL INTERNATIONAL CORPORATION, Burlington, NC</td>
			<td></td>
			<td>6-well plate with silicon elastomer substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bis-acrylamide solution 2% (solution)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1533-25mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning cover glasses square, No. 2, W &#215; L 22 mm &#215; 22 mm</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CLS285522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Irgacure (2-Hydroxy-4&#8242;-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone) (powder)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>410896</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td>basement membrane matrix protein solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl sulfoxide, 99.7+%, Extra Dry, AcroSeal, ACROS Organics</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>326881000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex (13mm) filter unit with Durapore Membrane</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGV013SL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millipore 50mL Steriflip (0.22 &#181;m)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SCGP00525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stencils</td>
			<td>Potomac</td>
			<td>custom design</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfo-SANPAH</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>22589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Select 10x</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A1217702</td>
			<td>Enzyme used for stencil cleaning</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simple lithography-free single cell micropatterning using laser-cut stencils

טכניקות מיקרופרינינג שימשו באופן נרחב בביולוגיה התא כדי ללמוד את ההשפעות של שליטה בצורה וגודל התא על קביעת הגורל התא ברזולוציה תא בודד. העדכנית ביותר של המדינה-של-art בודד טכניקות מיקרוגרפיה כרוכים לדפוס רך מיקרו מגע הדפסה, שהיא טכנולוגיה רבת עוצמה, אבל דורש מיומנויות הנדסה מוסמך ותמיכה מתקן מסוים במיקרו בייצור. מגבלות אלה דורשות טכניקה נגישה יותר. כאן, אנו מתארים שיטת ליתוגרפיה פשוטה וחופשית: שיטה מבוססת-סטנסיל של תא יחיד. אנו מספקים הליכים צעד-אחר-צעד, כולל עיצוב סטנסיל, ייצור פוליאקרילאמיד הידרוג'ל, התאגדות חלבון מבוססת-סטנסיל, ציפוי תאים ותרבות. שיטה פשוטה זו יכולה לשמש לתבנית מערך של רבים כמו 2,000 תאים. אנו מדגימים את הפנינג של הקרדיוציטים שמקורם באחד בתאי גזע המושרה האנושית pluripotent (היפנוטית) עם צורות תא ברורים, מ 1:1 מרובע כדי 7:1 מלבן מבוגר בצורת הקרדיוציט. זה תא בודד מבוסס סטנסיל מהתכנות הוא ללא ליתוגרפיה, טכנית חסון, נוח, זול, והכי חשוב נגיש לאלה עם רקע ביולוגי מוגבל.

ייצור של סטנסילים המכילים מערך של ריבועים או מלבנים הפגינו (איור 4A). בעקבות פרוטוקול זה, הצלחנו להשיג בדוגמת איי חלבון מטריצות (איור 4B ואיור 5a) ותאים (איור 4b). הריכוז הפתרון האופטימלי של חלבון מטריצה תת-אופטימלית (א?...

Watch this Scientific Journal Video about Simple Lithography-Free Single Cell Micropatterning using Laser-Cut Stencils at JoVE.com

Simple Lithography-Free Single Cell Micropatterning using Laser-Cut Stencils

פרוטוקול זה מציג שיטת המיקרו-ליתוגרפיה ללא הגבלה, פשוטה ונגישה לבעלי רקע ביוהנדסי מוגבל. שיטה זו משתמשת בסטנסילים מותאמים אישית לחתוך לייזר כדי מיקרו מטריצות חלבונים מטריצה בצורה של עניין עבור מודלדירוג תאים מורפולוגיות. ההליך עבור מיקרופנינג הוא הפגין באמצעות מושרה המושרה תא גזע המופק הקרדיוציטים.

פשוט ליתוגרפיה-ללא מיקרוהדפס תא יחיד באמצעות סטנסילים לייזר לחתוך

Micropatterning techniques have been widely used in cell biology to study effects of controlling cell shape and size on cell fate determination at single ...

נתאר שיטת מיקרופטרן חד-תאית נטולת סטנסיל, המתגברת על מכשולים רבים הקשורים לפוטוליתוגרפיה וליתוגרפיה רכה. סטנסילים הם לשימוש חוזר ואת התהליך הוא זול להתאמה אישית. שיטה זו פתחה שדרה חדשה לחוקרים שאינם מהנדסים לחקור את צורת התא ואת mechanotransduction הנגרמת על ידי האזור בהקשרים פיזיולוגיים ופתולוגיים שונים.יתר על כן, פרוטוקול זה מאפשר micropatterning של אלפי תאים אשר ניתן להשתמש בהם עבור הקרנת תרופות בתפוקה גבוהה ומידול מחלות בצלחת. הדגמה חזותית תקל על ההשתלה של שני שלבים מכריעים: ניתוק של כיסוי מהידרוגל, ייבוש הידרוג'ל מספיק לפני הנחת הסטנסיל. הכינו את פתרון ההידרוגל פוליאקרילמיד בצינור צנטריפוגה חדש של 50 מיליליטר כפי שמתואר בכתב היד.לאחר מכן, כדי להכין את הפתרון פוטואיניטאטור 5%, להמיס את החומרים 700 microliters של 100% אתנול. המרכיבים אינם מסיסים במים ולכן הקפד להתמוסס לחלוטין על ידי מערבולת. הוסף 300 microliters של PBS עבור נפח סופי של מיליליטר אחד.עבודה על קרח, לדלל את פתרון מלאי חלבון מטריצת קרום המרתף עם קר כקרח DMEM F12 מדיה או 1X PBS ליחס דילול אופטימיזציה. שמור על קרח לשימוש מאוחר יותר. כאשר עובדים עם מטריצת קרום מרתף, הקפד תמיד לעבוד על קרח ולהשתמש פתרונות קרים כקרח טיפים צינורות מצוננים.מניחים מנורת ספסל UV במכסה בטיחות ביולוגי. לאחר מכן, מקם את סרטי הפרפין הסטריליים שהוכנו בעבר. אם סרטי הפרפין אינם יבשים לחלוטין, השתמשו במערכת שאיפת ואקום להסרת כל נוזל שיורית.באמצעות מלקחים autoclaved, למקם שישה כיסויים autoclaved על הסרט פרפין שש בכל צלחת פטרי. כדי להכין את הפתרון הסופי פוליאקרילמיד UV cross-linkable, לדלל את פתרון photoinitiator עם פתרון מבשר הידרוג'ל polyacrylamide. לעקר את הפתרון באמצעות יחידת סינון 50 מיליליטר עם גודל נקבובית 0.22 מיקרומטר.ואז לוותר על 200 microliters של פתרון סופי פוליאקרילמיד UV cross-linkable על כל אחד מששת כיסויי זכוכית במנות פטרי. באמצעות מלקחים אוטומטיים, מכסים בזהירות כל כיסוי עם כיסוי שני לוכד שכבה של הפתרון בין שני כיסויים. מניחים את מנות פטרי המכילות את הכיסויים מתחת למנורת ספסל UV עם המכסה לא סגור.הכיסוי של נייר לבן על המשטח הלא לבן חשוב כדי למזער את אובדן עוצמת UV. להגנה מפני קרינת UV, לכסות את המנורה עם רדיד אלומיניום. צלם את הפוליאקרילמיד הידרוג'ל במשך חמש דקות.השתמש בסכין גילוח כדי להפריד בזהירות כל זוג כיסויים. מלאו את המאגר המכיל שישה מרוכבים של כיסויי הידרוג'ל עם PBS. לאחר שטיפה במשך חמש דקות, להחזיר את מרוכבים מכסה הידרוג'ל לסרט פרפין בצלחת פטרי.להשיג צינור של סולפו-SANPAH מאחסון במינוס 80 מעלות צלזיוס. מוסיפים לצינור 1,200 מיקרוליטר של PBS מקורר מראש ומערבבים על ידי צינור למעלה ולמטה. לוותר על 200 מיקרוליטרים של סולפו-SANPAH מדולל על סרט הפרפין בצלחת פטרי.מניחים כיסוי רחפת מרוכב מעל סולפו-SANPAH עם הידרוג'ל יצירת קשר עם Sulfo-SANPAH. לאחר מכן, מניחים את מרוכבים מכסה הידרוג'ל מתחת למנורת UV ולחשוף אותם במשך חמש דקות כדי להפעיל את Sulfo-SANPAH. אם Sulfo-SANPAH הופך מכתום לחום המציין הפעלה ושילוב מוצלחים, המשך לשלבים הבאים תוך 10 דקות.לחדש את מאגר פוליפרופילן חד פעמי עם PBS טרי. מעבירים את מרוכבי ההידרוגל המופעלים למאגר ושטיפתם לזמן קצר כדי להסיר סולפו-SANPAH לא מאוגד. מניחים את מרוכבים מכסה הידרוג'ל על סרט פרפין במנות פטרי בזהירות לטבול אותם עם מגבונים סטריליים ללא מוך.מניחים שבלון על גבי כל מרוכב כיסוי הידרוג'ל. כדי להבטיח אטם הדוק בין הסטנסיל לבין מרוכבים, להסיר לחות עודפת על ידי dabbing עם מגבונים אוטומטיים ללא מוך. מחלקים בזהירות את פתרון חלבון מטריצת הממברנה המדולל במרתף ומניחים 200 מיקרוליטרים על גבי כל מרוכב כיסוי הידרוג'ל.דגירה המבנים לילה ב 37 מעלות צלזיוס. למחרת, להעביר את המשולבים לצלחת שש בארות. חותם הדוק בין הידרוג'ל לסטנסיל יכול להיות מאומת בקלות על ידי התבוננות אם פתרון חלבון מטריצה נשמר על גבי הסטנסיל.כישלון ליצור חותם הדוק מוביל לדליפה מהירה של פתרון החלבון דרך החורים. טבילה מלאה של המרוכבים ב- PBS. באמצעות פינצטה אוטוקלאבת, נתק בזהירות את ההידרוגלים מבלי לקרוע את ההידרוגלים.הסר את ה- PBS מה בארות ומילוי מחדש של בארות עם DMEM. דגירה הצלחת לילה ב 37 מעלות צלזיוס. לאחר הסרת הצלחת מהחממה, בדקו את ה- DMEM.אם ה- DMEM אינו מעונן, מרוכבים מכסה הידרוג'ל מוכנים לשימוש עבור ציפוי תאים. סטנסילים היו מפוברקים המכילים מערכים של ריבועים ומלבנים. מצעים הידרוג'ל micropatterned נוצרו מן stencils ואיים של חלבון מטריקס הושגו.כמו כן הושגו איים סלולריים. לדוגמה, איים של קרדיומיוציטים שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים הנגרמים על ידי בני אדם. ריכוז חלבון מטריקס שיחק תפקיד חיוני ביצירת דפוסים נאותים.ריכוז אופטימלי הוביל להפצה הומוגנית של חלבונים. ריכוזי תמצית חלבון מטריצה תת אופטימלית הובילו לדפוסים תת-אופטימליים. זה קריטי להשתמש בצד הקדמי של הסטנסיל.אם נעשה שימוש בצד האחורי של הסטנסיל, גודל איי החלבון מטריקס עולה בשל הכיוון של חיתוך הלייזר. בעוד שהשימוש בצד האחורי של הסטנסיל לא השפיע באופן משמעותי על רוחב הדפוסים המלבניים, הגובה גדל באופן משמעותי והוביל לירידה ביחס הגובה-רוחב המיועד. תבנית מבוססת סטנסיל הוחלה על מצעי אלסטומר סיליקון.קרדיומיוציטים בדוגמת על מצעים אלסטומר סיליקון היו דמיינו על ידי אימונוציטוכימיה של טרופונין לב T בהגדלה נמוכה ועל ידי חלבון סרקומרי אלפא-actinin בהגדלה גבוהה. התבניות המבוססות על סטנסיל הוחלו גם על תבנית שני קרדיומיוציטים זה לצד זה על הידרוג'לים עם נוקשות שונה. הגילוי של תאי גזע פלוריפוטנטיים הנגרמים על ידי בני אדם ופרוטוקולי בידול תואמים הפכו את זה למודל אנושי במבחנה אידיאלי לחקר אונקוגנזה ופתוגנזה.עם זאת, מגבלה עיקרית של שימוש במערכת IPS היא היעדר מבנה למיקרו-וירוס שיש לו הרכב ביוכימי מסוים ונוקשות לאינטראקציה עם תאים. התבניות יכולות להיות משולבות עם מיקרוסקופ כוח המתיחה ו בדיקות אימונוציטוכימיה כדי לאפיין את המבנה והתפקוד של הקרדיומיוציטים. ניתוח של סוגי תאים שמקורם ב- IPS, במקרה שלנו קרדיומיוציטים, במורפולוגיה פיזיולוגית יותר פותח הזדמנויות ללמוד קרדיומיוציטים מאתגרים בצלחת התרבות.הטכניקה יכולה להיות מיושמת גם על מערכות רבות אחרות כגון לוחות הקרנה תוכן גבוה. ניתן להתאים את הצורה והמצע בקלות ליישום.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos

בידוד ואפיון של תאים בודדים מעוברים דג הזברה

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been ...

Epigenetic Conversion as a Safe and Simple Method to Obtain Insulin-secreting Cells from Adult Skin Fibroblasts

מרת אפיגנטיים כאמצעי בטוח ופשוט להשיג תאי מפרישי אינסולין פיברובלסטים עור בוגרים

Regenerative medicine requires new, fully functional cells that are delivered to patients in order to repair degenerated or damaged tissues. When such ...

Stencil Micropatterning of Human Pluripotent Stem Cells for Probing Spatial Organization of Differentiation Fates

סטנסיל micropatterning של תאי גזע האנושי pluripotent עבור גשוש הארגון המרחבי של גורל הבידול

Human pluripotent stem cells (hPSCs), including embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells, have the intrinsic ability to differentiate into ...

Imaging Cleared Embryonic and Postnatal Hearts at Single-cell Resolution

הדמיה הותרה עוברית ולבבות אחרי לידה ברזולוצית תא בודד

Single clonal tracing and analysis at the whole-heart level can determine cardiac progenitor cell behavior and differentiation during cardiac development, ...

A Simple Method to Identify Kinases That Regulate Embryonic Stem Cell Pluripotency by High-throughput Inhibitor Screening

שיטה פשוטה לזהות קינאזות כי לווסת עובריים גזע עובריים גזע על ידי תפוקה גבוהה מעכב הקרנה

Embryonic stem cells (ESCs) can self-renew or differentiate into all cell types, a phenomenon known as pluripotency. Distinct pluripotent states have been ...

High-resolution Episcopic Microscopy (HREM) - Simple and Robust Protocols for Processing and Visualizing Organic Materials

High-resolution Episcopic Microscopy HREM - Simple and Robust Protocols for Processing and Visualizing Organic Materials

מיקרוסקופיה אפיסקופית ברזולוציה גבוהה (HREM) - פרוטוקולים פשוטים ורב-עוצמה לעיבוד והדמיה של חומרים אורגניים

We provide simple protocols for generating digital volume data with the high-resolution episcopic microscopy (HREM) method. HREM is capable of imaging ...

Single-Cell Quantification of Protein Degradation Rates by Time-Lapse Fluorescence Microscopy in Adherent Cell Culture

תא בודד כימות של חלבון השפלה המחירים על-ידי קרינה פלואורסצנטית זמן לשגות מיקרוסקופ בתרבות תא חסיד

Proteins are in a dynamic state of synthesis and degradation and their half-lives can be adjusted under various circumstances. However, most commonly used ...

Clonal Analysis of Embryonic Hematopoietic Stem Cell Precursors Using Single Cell Index Sorting Combined with Endothelial Cell Niche Co-culture

ניתוח המשובטים של תא גזע Hematopoietic מבשרי באמצעות אינדקס תא בודד מיון משולב עם תאי אנדותל נישה תרבות משותפת

The ability to study hematopoietic stem cell (HSC) genesis during embryonic development has been limited by the rarity of HSC precursors in the early ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

Photoconversion תא בודד בהמחיה שלם דג זברה

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

Single-cell Transcriptomic Analyses of Mouse Pancreatic Endocrine Cells

Transcriptomic תא בודד ניתוחים של תאים בלבלב האנדוקרינית העכבר

Pancreatic endocrine cells, which are clustered in islets, regulate blood glucose stability and energy metabolism. The distinct cell types in islets, ...