Name: simple lithography-free single cell micropatterning using laser-cut stencils
Uploaded: 2020-04-03T13:00:00
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इस काम को स्टैनफोर्ड चाइल्ड हेल्थ रिसर्च इंस्टीट्यूट (CHRI) और नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ (1F32HL142205-01) से एसएल तक पोस्टडॉक्टोरल फेलोशिप द्वारा समर्थित किया गया था, निदेशक पायनियर पुरस्कार के NIH कार्यालय (LM012179-03), अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन अन्वेषक पुरस्कार की स्थापना की (17EIA333410923), स्टैनफोर्ड हृदय संस्थान, हॉफमैन और श्रोफेफर फाउंडेशन, और कार्डियोवस्कुलर मेडिसिन के स्टैनफोर्ड डिवीजन, चिकित्सा विभाग एस एमडब्ल्यू को , राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (UG3 TR002588, P01 HL141084 से पुरस्कार, R01 HL126527, R01 HL113006, R01 HL123968) और तंबाकू से संबंधित रोग अनुसंधान कार्यक्रम (TRDRP 27IR-0012) को जेसीडब्ल्यू, अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन (AHA) पोस्टडॉक्टोरल फैलोशिप अवार्ड (18POST34030106) को एचवाई, और एच. एसवाई को हेन्स्ट फेलोशिप हम माइक्रोपैटर्न्ड एचआईपीएससी-सीएम की कॉन्फोकल इमेजिंग के समर्थन पर स्टैनफोर्ड न्यूरोसाइंस माइक्रोस्कोपी सर्विस के डॉ एंड्रयू ऑलसेन को धन्यवाद देते हैं । हम पहले स्टेंसिल डिजाइन, निर्माण, पॉलीएक्रिलामाइड हाइड्रोगेल कोटेड कवरस्लिप पर आईपीएससी-सीएम के एकल सेल माइक्रोपैटर्निंग और एकल सेल माइक्रोपैटर्नेड आईपीएससी-सीएम की सरकोवर संरचना की प्रारंभिक कॉन्फोकल इमेजिंग के लिए एचवाई को धन्यवाद देते हैं।

1. नकारात्मक पैटर्न पॉलीइमिड आधारित स्टेंसिल का निर्माण
<ol><li>कंप्यूटर-एडेड डिज़ाइन सॉफ्टवेयर (जैसे, ऑटोकैड, सॉलिडवर्क्स, ऑनशेप, एडोब इलस्ट्रेटर) का उपयोग करके .dxf प्रारूप में एक पैटर्न(चित्रा 2A)</stro...

<ol>
	<li>Burridge, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+Defined+and+Small+Molecule-Based+Generation+of+Human+Cardiomyocytes.">Chemically Defined and Small Molecule-Based Generation of Human Cardiomyocytes.</a> Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).</li><li>Sayed, N., Liu, C., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translation+of+Human-Induced+Pluripotent+Stem+Cells:+From+Clinical+Trial+in+a+Dish+to+Precision+Medicine.">Translation of Human-Induced Pluripotent Stem Cells: From Clinical Trial in a Dish to Precision Medicine.</a> Journal of the American College of Cardiology. 67 (18), 2161-2176 (2016).</li><li>Ribeiro, A. J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contractility+of+single+cardiomyocytes+differentiated+from+pluripotent+stem+cells+depends+on+physiological+shape+and+substrate+stiffness.">Contractility of single cardiomyocytes differentiated from pluripotent stem cells depends on physiological shape and substrate stiffness.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (41), 12705-12710 (2015).</li><li>Kumar, A., Biebuyck, H. A., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterning+Self-Assembled+Monolayers:+Applications+in+Materials+Science.">Patterning Self-Assembled Monolayers: Applications in Materials Science.</a> Langmuir. 10 (5), 1498-1511 (1994).</li><li>Wilbur, J. L., Kumar, A., Kim, E., Whitesides, G. 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S., Myers, K. A., Gardel, M. L., Waterman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stiffness-controlled+three-dimensional+extracellular+matrices+for+high-resolution+imaging+of+cell+behavior.">Stiffness-controlled three-dimensional extracellular matrices for high-resolution imaging of cell behavior.</a> Nature Protocols. 7 (11), 2056-2066 (2012).</li><li>Lee, S., Stanton, A. E., Tong, X., Yang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogels+with+enhanced+protein+conjugation+efficiency+reveal+stiffness-induced+YAP+localization+in+stem+cells+depends+on+biochemical+cues.">Hydrogels with enhanced protein conjugation efficiency reveal stiffness-induced YAP localization in stem cells depends on biochemical cues.</a> Biomaterials. 202, 26-34 (2019).</li><li>Th&#233;ry, M., P&#233;pin, A., Dressaire, E., Chen, Y., Bornens, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+distribution+of+stress+fibres+in+response+to+the+geometry+of+the+adhesive+environment.">Cell distribution of stress fibres in response to the geometry of the adhesive environment.</a> Cell Motility. 63 (6), 341-355 (2006).</li><li>Kilian, K. A., Bugarija, B., Lahn, B. T., Mrksich, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geometric+cues+for+directing+the+differentiation+of+mesenchymal+stem+cells.">Geometric cues for directing the differentiation of mesenchymal stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (11), 4872-4877 (2010).</li></ol>

हम एक लिथोग्राफी-फ्री स्टेंसिल-आधारित माइक्रोपैटर्निंग विधि का वर्णन करते हैं जो अनुयायी कोशिकाओं के प्रभावी पैटर्निंग को सक्षम बनाता है। इस प्रोटोकॉल में, हम पॉलीएक्रिलामाइड हाइड्रोगेल पर पॉलीएक?...

विभिन्न सेल प्रकारों में उनके निर्देशित भेदभाव के लिए अंतराल के आगमन और बाद में प्रोटोकॉल के विकास ने आणविक और रोगी-विशिष्ट स्तर पर विकास और रोग का अध्ययन करना संभव बना दिया है, विशेष रूप से रोगी-व्युत्पन्न iPSC कार्डियोमायोसाइट्स (iPSC-सीएम) का उपयोग कार्डियोमायोपैथी1,,2मॉडल के लिए किया है। हालांकि, आईपीएससी प्रणाली और अन्य इन विट्रो मॉडल का उपयोग करके विकास और शरीर विज्ञान का अध्ययन करने की एक प्रमुख सीमा संरचित माइक्रोएनवायरमेंट का अभाव है। सीटू में, कोशिकाओं को बाह्युलर मैट्रिक्स (ईसीएम) के साथ-साथ पड़ोसी कोशिकाओं की बाधाओं के अधीन किया जाता है। इन सूक्ष्म वातावरणों की विशेष जैव रासायनिक संरचना और कठोरता कोशिकाओं के स्थानिक वितरण के साथ-साथ सेल आसंजन में शामिल होने के लिए उपलब्ध कारकों को निर्देशित करती है। यह, बदले में, इंट्रासेलुलर सिग्नलिंग पाथवे, जीन अभिव्यक्ति और सेल भाग्य निर्धारण को प्रभावित करता है। उदाहरण के लिए, वयस्क जैसे रॉड आकार में माइक्रोपैटर्नवाले आईपीएससी-सीएम में काफी बेहतर संकुचन क्षमता, कैल्शियम प्रवाह, माइटोकॉन्ड्रियल संगठन, इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी और ट्रांसवर्स-ट्यूबल फॉर्मेशन3है। इस प्रकार, माइक्रोएनवायरमेंट के गुण सेलुलर कार्यों के नियमन में अभिन्न हैं।
पिछले माइक्रोपैटर्निंग तकनीकों भारी फोटोलिथोग्राफी पर भरोसा(चित्रा 1A)। इस तकनीक में, फोटोसेंसिटिव बहुलक, या फोटोडेकी की एक परत, समाधान से एक फ्लैट सब्सट्रेट पर घूमती है ताकि 1 माइक्रोन मोटी के बारे में पतली फिल्म बन सके। इसके बाद, पराबैंगनी (यूवी) प्रकाश वांछित पैटर्न युक्त मास्क के माध्यम से फोटोडपर लागू होता है। पराबैंगनी (यूवी) प्रकाश के संपर्क में रासायनिक रूप से अपने संबंधित डेवलपर समाधान में अपनी घुलनशीलता को संशोधित करके फोटोडको बदल देता है, मुखौटा से सब्सट्रेट पर वांछित पैटर्न को स्थानांतरित करता है। कई माइक्रोपैटर्निंग विधियां फोटोलिथोग्राफी को शामिल करती हैं, क्योंकि यह कोशिका पैटर्न के डिजाइन पर माइक्रोमीटर-स्तरीय नियंत्रण को नैनोमीटर प्रदान करती है। हालांकि, फोटोडका का कताई अशुद्धियों के प्रति अत्यधिक संवेदनशील है, क्योंकि सबसे छोटे धूल कण समाधान के प्रसार को एक पतली फिल्म में बाधित करेंगे। इसलिए फोटोलिथोग्राफी को अदूषित सुविधाओं में किया जाना चाहिए, जिन्हें बनाए रखना महंगा है और उपयोग करने के लिए विशेष विशेषज्ञता की आवश्यकता होती है । इसके अलावा, फोटोलिथोग्राफी में उपयोग किए जाने वाले रसायन अक्सर कोशिकाओं के लिए जहरीले होते हैं और महत्वपूर्ण जैव अणुओं को विकृत कर सकते हैं। इस प्रकार, फोटोलिथोग्राफी सुविधाजनक जैविक अनुप्रयोगों के लिए माइक्रोपैटर्न के निर्माण में महत्वपूर्ण बाधाएं बन गई है।
1 99 4 में, व्हाइटसाइड्स और सहकर्मियों4 ने सॉफ्ट लिथोग्राफी नामक तकनीकों के संग्रह का अग्रणी बनाकर फोटोलिथोग्राफी से जुड़ी कुछ चुनौतियों को पार कर लिया। सॉफ्ट लिथोग्राफी में पॉलीडिमेथिलसिलॉक्सेन (पीडीएम), एक पारदर्शी, रबर जैसी सामग्री से बनी माइक्रोस्ट्रक्चर्ड सतह का उपयोग ईसीएम प्रोटीन4का पैटर्न उत्पन्न करने के लिए किया जाता है। सामान्य नरम लिथोग्राफिक तकनीकों में माइक्रोकॉन्टैक्ट प्रिंटिंग और माइक्रोफ्लूइडिक पैटर्निंग शामिल हैं। माइक्रोकॉन्टैक्ट प्रिंटिंग में, वर्तमान में सबसे लोकप्रिय नरम लिथोग्राफिक विधि, ईसीएम प्रोटीन के साथ लेपित एक पीडीएम स्टांप स्टांप(चित्रा 1 B)से संपर्क क्षेत्रों में सामग्री को सतह पर स्थानांतरित करता है। माइक्रोफ्लूइडिक पैटर्निंग में, माइक्रोस्ट्रक्चर को पीडीएम सतह पर डिज़ाइन किया गया है ताकि जब स्टांप को सब्सट्रेट में दबाया जाता है, तो माइक्रोचैनल्स का एक नेटवर्क, जिसके माध्यम से तरल पदार्थ वांछित क्षेत्रों में वितरित किया जा सकता है, बनाया जाता है(चित्रा 1 C)5। सॉफ्ट लिथोग्राफी फोटोलिथोग्राफी पर कई लाभ प्रदान करती है। एक बार एक मास्टर वेफर microfabricated है, PDMS टिकटों आसानी से स्वच्छ कमरे की सुविधाओं के आगे रोजगार के बिना दोहराया जा सकता है । इसके अलावा, नरम लिथोग्राफी की प्रक्रिया में कार्बनिक सॉल्वैंट्स की अनुपस्थिति पॉलीस्टायरीन जैसी पॉलीमेरिक सामग्रियों के उपयोग के लिए अनुमति देती है, जो आमतौर पर सेल संस्कृति में उपयोग की जाती है। अंत में, नरम लिथोग्राफिक विधियों का उपयोग करके माइक्रोपैटर्निंग सपाट सतहों तक सीमित नहीं है। इस प्रकार, सॉफ्ट लिथोग्राफी फोटोलिथोग्राफी6पर माइक्रोपैटर्न फैब्रिकेशन की पहुंच और कार्यक्षमता को बढ़ाती है। हालांकि, नरम लिथोग्राफी में महत्वपूर्ण कमियां हैं। उदाहरण के लिए, फोटोलिथोग्राफी का उपयोग करके एक प्रारंभिक नक़्क़ाशी कदम, अभी भी स्टांप को माइक्रोफैब्रिकेटर करने की आवश्यकता है। इसके अलावा, पीडीएम स्टांप का उपयोग करके माइक्रोपैटर्निंग सब्सट्रेट6पर प्रोटीन हस्तांतरण की गुणवत्ता में भिन्नता के अधीन है। इन विसंगतियों से बचने के लिए प्रोटीन हस्तांतरण के दौरान पीडीएम स्टांप पर लागू दबाव में अनुकूलन और स्थिरता की आवश्यकता होती है, अन्यथा पीडीएफएमएस मोल्डों के फीचर आकारों में विकृति और विकृति6हो सकती है। छोटे अणु अवशोषण7के कारण पीडीएम का बार - बार उपयोग करने की भी एक बड़ी चिंता है .
सॉफ्ट फोटोलिथोग्राफी और पीडीएम टिकटों का उपयोग करने से बचने के लिए, हम एक स्टेंसिल-आधारित, लिथोग्राफी-मुक्त एकल कोशिका माइक्रोपैटर्निंग विधि का वर्णन करते हैं जो फोटोलिथोग्राफी और सॉफ्ट लिथोग्राफी से जुड़ी कई बाधाओं को दूर करता है। इस विधि में, एक पॉलीएक्रिलैमाइड हाइड्रोजेल का उपयोग स्टेंसिल-आधारित ईसीएम प्रोटीन समावेश के लिए सब्सट्रेट के रूप में किया जाता है, जो एकल एचआईपीएससी-सीएम की चयनात्मक चढ़ाना की अनुमति देता है। यह तकनीक क्लासिक सेल संस्कृति की स्थितियों में उपयोग की जाने वाली पॉलीमेरिक सामग्रियों के साथ अत्यधिक संगत है। इसके अलावा, उचित सफाई और रखरखाव के साथ, स्टेंसिल माइक्रोफैब्रिकेशन प्रक्रिया के दौरान क्षरण और प्रोटीन अवशोषण के लिए पुन: प्रयोज्य और प्रतिरोधी होते हैं। अंत में, पैटर्निंग प्रक्रिया तकनीकी रूप से मजबूत, सस्ती, अनुकूलन योग्य और उन लोगों के लिए सुलभ है जिनके पास कोई विशेष बायोइंजीनियरिंग कौशल नहीं है। स्टेंसिल आधारित माइक्रोपैटर्निंग तकनीक का मोटे तौर पर हमारे हालिया प्रकाशनों मॉडलिंग में 8,9,10विभिन्न कार्डियोमायोपैथियों8का उपयोग किया गया है ।

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Aminoethyl methacrylate hydrochloride (powder)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>516155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide solution 40% (solution)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A-4058-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bench UV lamp 365 nm</td>
			<td>UVP</td>
			<td>UVP 95-0042-07, XX-15L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioFlex culture plate</td>
			<td>FLEXCELL INTERNATIONAL CORPORATION, Burlington, NC</td>
			<td></td>
			<td>6-well plate with silicon elastomer substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bis-acrylamide solution 2% (solution)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1533-25mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning cover glasses square, No. 2, W &#215; L 22 mm &#215; 22 mm</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CLS285522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Irgacure (2-Hydroxy-4&#8242;-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone) (powder)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>410896</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td>basement membrane matrix protein solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl sulfoxide, 99.7+%, Extra Dry, AcroSeal, ACROS Organics</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>326881000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex (13mm) filter unit with Durapore Membrane</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGV013SL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millipore 50mL Steriflip (0.22 &#181;m)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SCGP00525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stencils</td>
			<td>Potomac</td>
			<td>custom design</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfo-SANPAH</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>22589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Select 10x</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A1217702</td>
			<td>Enzyme used for stencil cleaning</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simple lithography-free single cell micropatterning using laser-cut stencils

एकल सेल संकल्प पर सेल भाग्य निर्धारण पर कोशिका आकार और आकार को नियंत्रित करने के प्रभावों का अध्ययन करने के लिए सेल जीव विज्ञान में माइक्रोपैटर्निंग तकनीकों का व्यापक रूप से उपयोग किया गया है। वर्तमान अत्याधुनिक एकल सेल माइक्रोपैटर्निंग तकनीकों में सॉफ्ट लिथोग्राफी और माइक्रो-कॉन्टैक्ट प्रिंटिंग शामिल है, जो एक शक्तिशाली तकनीक है, लेकिन इसके लिए प्रशिक्षित इंजीनियरिंग कौशल और माइक्रोफैब्रिकेशन में कुछ सुविधा समर्थन की आवश्यकता होती है। इन सीमाओं के लिए अधिक सुलभ तकनीक की आवश्यकता होती है। यहां, हम एक सरल वैकल्पिक लिथोग्राफी-मुक्त विधि का वर्णन करते हैं: स्टेंसिल-आधारित एकल सेल पैटर्निंग। हम स्टेंसिल डिजाइन, पॉलीएक्रिलामाइड हाइड्रोगेल फैब्रिकेशन, स्टेंसिल आधारित प्रोटीन इनकॉरपोरेशन और सेल प्लेटिंग और संस्कृति सहित कदम-दर-कदम प्रक्रियाएं प्रदान करते हैं। इस सरल विधि का उपयोग 2,000 कोशिकाओं की एक सरणी पैटर्न के लिए किया जा सकता है। हम एकल मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (hiPSC) से अलग सेल आकार के साथ प्राप्त कार्डियोमायोसाइट्स की पैटर्निंग प्रदर्शित करते हैं, एक 1:1 वर्ग से एक 7:1 वयस्क कार्डियोमायोसाइट की तरह आयत के लिए । यह स्टेंसिल-आधारित एकल सेल पैटर्निंग लिथोग्राफी-मुक्त, तकनीकी रूप से मजबूत, सुविधाजनक, सस्ती, और सबसे महत्वपूर्ण रूप से सीमित बायोइंजीनियरिंग पृष्ठभूमि वाले लोगों के लिए सुलभ है।

वर्गों या आयतों की एक सरणी युक्त स्टेंसिल के निर्माण का प्रदर्शन किया गया है(चित्र4A)। इस प्रोटोकॉल का पालन करते हुए, हमने नमूनों वाले मैट्रिक्स प्रोटीन द्वीप(चित्रा 4B और च...

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Simple Lithography-Free Single Cell Micropatterning using Laser-Cut Stencils

यह प्रोटोकॉल एक लिथोग्राफी-मुक्त माइक्रोपैटर्निंग विधि का परिचय देता है जो सीमित बायोइंजीनियरिंग पृष्ठभूमि वाले लोगों के लिए सरल और सुलभ है। यह विधि सेल मॉर्फोलोजी को मॉड्यूल करने के लिए ब्याज के आकार में माइक्रोपैटर्न एक्स्ट्रासेलुलर मैट्रिक्स प्रोटीन के लिए अनुकूलित लेजर-कट स्टेंसिल का उपयोग करती है। माइक्रोपैटर्निंग की प्रक्रिया प्रेरित प्लुरीपोटस्टेम सेल व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स का उपयोग करके प्रदर्शित की जाती है।

सरल लिथोग्राफी-फ्री सिंगल सेल माइक्रोपैटर्निंग लेजर-कट स्टेंसिल का उपयोग कर

Micropatterning techniques have been widely used in cell biology to study effects of controlling cell shape and size on cell fate determination at single ...

हम एक स्टेंसिल-आधारित लिथोग्राफी-मुक्त एकल-सेल माइक्रोपैटर्न विधि का वर्णन करेंगे जो फोटोलिथोग्राफी और सॉफ्ट लिथोग्राफी से जुड़ी कई बाधाओं को दूर करता है। स्टेंसिल पुन: प्रयोज्य हैं और प्रक्रिया सस्ती और अनुकूलन योग्य है। इस विधि ने गैर-इंजीनियर शोधकर्ताओं के लिए विभिन्न शारीरिक और रोग संदर्भों में सेल आकार और क्षेत्र-प्रेरित मशीनोट्रांसडक्शन का अध्ययन करने के लिए एक नया अवसर खोला।इसके अलावा, यह प्रोटोकॉल हजारों कोशिकाओं के माइक्रोपैटर्निंग की अनुमति देता है जिसका उपयोग डिश में उच्च-थ्रूपुट दवा स्क्रीनिंग और रोग मॉडलिंग के लिए किया जा सकता है। दृश्य प्रदर्शन दो महत्वपूर्ण चरणों के प्रत्यारोपण की सुविधा देगा: हाइड्रोजेल से कवरस्लिप की टुकड़ी, स्टेंसिल रखने से पहले पर्याप्त हाइड्रोगेल सुखाने। पांडुलिपि में वर्णित एक नए 50 मिलीलीटर प्रोपिलीन सेंट्रलाइज ट्यूब में पॉलीएक्रीलामाइड हाइड्रोजेल समाधान तैयार करें।इसके बाद, 5% फोटोनिटिनिएटर समाधान तैयार करने के लिए, 100% इथेनॉल के 700 माइक्रोलीटर में सामग्री को भंग करें। सामग्री पानी में घुलनशील नहीं हैं इसलिए भंवर से पूरी तरह घुलना सुनिश्चित करें। एक मिलीलीटर की अंतिम मात्रा के लिए पीबीएस के 300 माइक्रोलीटर जोड़ें।बर्फ पर काम करना, आइस कोल्ड डीएमईएम एफ 12 मीडिया या 1X पीबीएस के साथ आइस कोल्ड झिल्ली मैट्रिक्स प्रोटीन स्टॉक समाधान को अनुकूलित कमजोर पड़ने के अनुपात में पतला करें। बाद में उपयोग के लिए बर्फ पर रखें। तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स के साथ काम करते समय, हमेशा बर्फ पर काम करने के लिए और ठंडा पिपेट सुझावों और ट्यूबों में बर्फ ठंडे समाधान का उपयोग करने के लिए सुनिश्चित करें ।एक जैविक सुरक्षा हुड में एक यूवी बेंच लैंप रखें। इसके बाद, पहले तैयार की गई निष्फल पैराफिन फिल्मों को रखें। यदि पैराफिन फिल्में पूरी तरह से सूखी नहीं हैं, तो किसी भी अवशिष्ट तरल को हटाने के लिए वैक्यूम आकांक्षा प्रणाली का उपयोग करें।ऑटोक्लेवेड संदंश का उपयोग करके, प्रत्येक पेट्री डिश में पैराफिन फिल्म सिक्स पर छह ऑटोक्लेव्ड कवर्लिप्स रखें। यूवी क्रॉस-लिंकेबल पॉलीएक्रिलेमाइड अंतिम समाधान तैयार करने के लिए, फोटोनिटिनिटेटर समाधान को पॉलीएक्रिलेमाइड हाइड्रोगेल अग्रदूत समाधान के साथ पतला करें। 0.22 माइक्रोमीटर पोर आकार के साथ 50 मिलीलीटर फिल्टर इकाई का उपयोग करके समाधान को स्टरलाइज करें।फिर पेट्री व्यंजनों में छह ग्लास कवरलिप में से प्रत्येक पर यूवी क्रॉस-लिंकेबल पॉलीएक्रीलामाइड अंतिम समाधान के 200 माइक्रोलीटर वितरित करें। ऑटोक्लेव्ड संदंश का उपयोग करके, प्रत्येक कवरस्लिप को दो कवरस्लिप के बीच समाधान की एक परत को फँसाने के साथ एक दूसरे कवरस्लिप को ध्यान से कवर करें। यूवी बेंच लैंप के नीचे कवरस्लिप युक्त पेट्री व्यंजन को ढक्कन के साथ बिना बंद रखें।यूवी तीव्रता के नुकसान को कम करने के लिए गैर-सफेद सतह पर श्वेत पत्र का कवरेज महत्वपूर्ण है। यूवी विकिरण से सुरक्षा के लिए, एल्यूमीनियम पन्नी के साथ दीपक को कवर। फोटोपॉलीमेराइज पॉलीएक्रेमाइड हाइड्रोगेल को पांच मिनट के लिए।कवरस्लिप की प्रत्येक जोड़ी को ध्यान से अलग करने के लिए एक रेजर ब्लेड का उपयोग करें। पीबीएस के साथ छह हाइड्रोगेल कवरलिप कंपोजिट वाले जलाशय को भरें। पांच मिनट के लिए कुल्ला करने के बाद, पेट्री डिश में पैराफिन फिल्म के लिए हाइड्रोगेल कवरलिप कंपोजिट वापस करें।माइनस 80 डिग्री सेल्सियस पर भंडारण से सल्फो-सैंपाएच की एक ट्यूब प्राप्त करें। ट्यूब में प्री-ठंडा पीबीएस के 1, 200 माइक्रोलीटर जोड़ें और ऊपर और नीचे पाइपिंग करके मिलाएं। पेट्री डिश में पैराफिन फिल्म पर पतला सल्फो-सैंपाएच के २०० माइक्रोलीटर बांटें ।सल्फो-सैंपाएच से संपर्क करने वाले हाइड्रोगेल के साथ सल्फो-सैंपाएच के ऊपर एक हाइड्रोगेल कवरलिप कंपोजिट रखें। इसके बाद, हाइड्रोगेल कवरलिप कंपोजिट को यूवी लैंप के नीचे रखें और सुलफो-सैंपा को सक्रिय करने के लिए उन्हें पांच मिनट के लिए बेनकाब करें। यदि सल्फो-सैंपा नारंगी से भूरे रंग में बदल जाता है, तो सफल सक्रियण और समावेशन का संकेत देता है, 10 मिनट के भीतर अगले चरणों में आगे बढ़ें।ताजा पीबीएस के साथ डिस्पोजेबल पॉलीप्रोपाइलीन जलाशय की भरपाई करें। सक्रिय हाइड्रोगेल कवर्लिप कंपोजिट को जलाशय में स्थानांतरित करें और अनबाउंड सल्फो-सैंपा को हटाने के लिए उन्हें संक्षेप में कुल्ला करें। पेट्री व्यंजनों में पैराफिन फिल्म पर हाइड्रोगेल कवरलिप कंपोजिट रखें और ध्यान से उन्हें बाँझ लिंट-फ्री वाइप्स के साथ डब करें।प्रत्येक हाइड्रोगेल कवरलिप कंपोजिट के शीर्ष पर एक स्टेंसिल रखें। स्टेंसिल और कंपोजिट के बीच एक तंग सील सुनिश्चित करने के लिए, ऑटोक्लेवेड लिंट-फ्री वाइप्स के साथ डबिंग करके अतिरिक्त नमी को हटा दें। प्रत्येक हाइड्रोगेल कवरलिप कंपोजिट के शीर्ष पर 200 माइक्रोलीटर रखने वाले पतला तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स प्रोटीन समाधान को सावधानीपूर्वक वितरित करें।रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर निर्माण को इनक्यूबेट करें। अगले दिन कंपोजिट को छह अच्छी प्लेट में ट्रांसफर करें। हाइड्रोजेल और स्टेंसिल के बीच एक तंग सील को यह देखकर आसानी से मान्य किया जा सकता है कि क्या मैट्रिक्स प्रोटीन समाधान स्टेंसिल के शीर्ष पर बनाए रखा गया है।एक तंग सील बनाने में विफलता छेद के माध्यम से प्रोटीन समाधान के त्वरित रिसाव की ओर जाता है। पूरी तरह से पीबीएस में कंपोजिट विसर्जित कर दिया। ऑटोक्लेव चिमटी का उपयोग करके, हाइड्रोगेल्स से स्टेंसिल को सावधानीपूर्वक अलग करें हाइड्रोगेल्स को फाड़े बिना।कुओं से पीबीएस निकालें और DMEM के साथ कुओं को फिर से भरना। थाली रात को ३७ डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट । इनक्यूबेटर से प्लेट हटाने के बाद डीएमईएम की जांच करें।यदि डीएमईएम बादल नहीं है, तो हाइड्रोगेल कवर्लिप कंपोजिट सेल प्लेटिंग के लिए उपयोग करने के लिए तैयार हैं। स्टेंसिल मनगढ़ंत थे जिनमें वर्गों और आयतों की सरणी थी। स्टेंसिल से माइक्रोपैटर्न्ड हाइड्रोजेल सब्सट्रेट्स बनाए गए थे और मैट्रिक्स प्रोटीन के द्वीप प्राप्त किए गए थे।सेल द्वीप भी प्राप्त किए गए थे। उदाहरण के लिए, मानव-प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स के द्वीप। मैट्रिक्स प्रोटीन एकाग्रता उचित पैटर्न पैदा करने में एक आवश्यक भूमिका निभाई।एक इष्टतम एकाग्रता के कारण प्रोटीन का समरूप वितरण हुआ। सबऑप्टिमल मैट्रिक्स प्रोटीन समाधान सांद्रता के कारण सबऑप्टिमल पैटर्निंग हुई। स्टेंसिल के सामने की ओर उपयोग करना महत्वपूर्ण है।अगर स्टेंसिल के पीछे की तरफ का इस्तेमाल किया जाए तो लेजर कटिंग की दिशा के कारण मैट्रिक्स प्रोटीन आइलैंड्स का आकार बढ़ जाता है। स्टेंसिल के पीछे की ओर का उपयोग करते समय आयताकार पैटर्न की चौड़ाई को काफी प्रभावित नहीं किया, ऊंचाई में काफी वृद्धि हुई जिससे इच्छित पहलू अनुपात में कमी आई। स्टेंसिल आधारित पैटर्निंग सिलिकॉन इलास्टोमर सब्सट्रेट्स पर लागू किया गया था।सिलिकॉन इलास्टोमर सब्सट्रेट्स पर पैटर्न वाले कार्डियोमायोसाइट्स को कम आवर्धन पर कार्डियक ट्रोपोनिन टी के इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री और उच्च आवर्धन पर सारकोमरिक प्रोटीन अल्फा-ऐक्टिनिन द्वारा कल्पना की गई थी। स्टेंसिल आधारित पैटर्निंग को विभिन्न कठोरता के साथ हाइड्रोगेल्स पर दो कार्डियोमायोसाइट्स पक्ष के पैटर्न पर भी लागू किया गया था। मानव-प्रेरित pluripotent स्टेम सेल और इसी भेदभाव प्रोटोकॉल की खोज ने ऑन्कोजेनेसिस और रोगजनन का अध्ययन करने के लिए विट्रो मानव मॉडल में यह एक आदर्श बना दिया है।हालांकि, आईपीएस प्रणाली का उपयोग करने की एक प्रमुख सीमा माइक्रोएनवायरमेंट के लिए संरचना का अभाव है जिसमें कोशिकाओं के साथ बातचीत करने के लिए विशेष जैव रासायनिक संरचना और कठोरता है। पैटर्निंग को कार्डियोमायोसाइट्स की संरचना और कार्य की विशेषता के लिए कर्षण बल माइक्रोस्कोपी और इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री के साथ जोड़ा जा सकता है। आईपीएस-व्युत्पन्न सेल प्रकारों का विश्लेषण, हमारे मामले में कार्डियोमायोसाइट, अधिक शारीरिक आकृति विज्ञान में संस्कृति पकवान में चुनौतीपूर्ण कार्डियोमायोसाइट्स का अध्ययन करने के अवसर खुलते हैं।इस तकनीक को कई अन्य प्रणालियों जैसे और उच्च सामग्री स्क्रीनिंग प्लेटों पर भी लागू किया जा सकता है। आकार और सब्सट्रेट को आसानी से आवेदन में समायोजित किया जा सकता है।

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos

अलगाव और zebrafish भ्रूण से एकल कक्ष की विशेषता

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been ...

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एक सुरक्षित और सरल विधि वयस्क त्वचा fibroblasts से इंसुलिन स्रावित कोशिकाओं को प्राप्त करने के रूप में Epigenetic रूपांतरण

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Stencil Micropatterning of Human Pluripotent Stem Cells for Probing Spatial Organization of Differentiation Fates

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Human pluripotent stem cells (hPSCs), including embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells, have the intrinsic ability to differentiate into ...

Imaging Cleared Embryonic and Postnatal Hearts at Single-cell Resolution

इमेजिंग एकल कोशिका संकल्प पर भ्रूण और प्रसव के बाद दिल को मंजूरी दे दी

Single clonal tracing and analysis at the whole-heart level can determine cardiac progenitor cell behavior and differentiation during cardiac development, ...

A Simple Method to Identify Kinases That Regulate Embryonic Stem Cell Pluripotency by High-throughput Inhibitor Screening

उच्च-थ्रूपुट इन्हिबिटर स्क्रीनिंग द्वारा भ्रूणीय स्टेम सेल प्लूरिपोटेंसी को नियंत्रित करने वाले किनेसेस को पहचानने के लिए एक सरल विधि

Embryonic stem cells (ESCs) can self-renew or differentiate into all cell types, a phenomenon known as pluripotency. Distinct pluripotent states have been ...

High-resolution Episcopic Microscopy (HREM) - Simple and Robust Protocols for Processing and Visualizing Organic Materials

High-resolution Episcopic Microscopy HREM - Simple and Robust Protocols for Processing and Visualizing Organic Materials

उच्च संकल्प एपिस्कोपिक माइक्रोस्कोपी (एचआरईएम) - प्रसंस्करण और दृश्यमान कार्बनिक सामग्री के लिए सरल और मजबूत प्रोटोकॉल

We provide simple protocols for generating digital volume data with the high-resolution episcopic microscopy (HREM) method. HREM is capable of imaging ...

Single-Cell Quantification of Protein Degradation Rates by Time-Lapse Fluorescence Microscopy in Adherent Cell Culture

अनुयाई सेल कल्चर में समय-चूक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा प्रोटीन ह्रास दरों की एकल-कोशिका ठहराव

Proteins are in a dynamic state of synthesis and degradation and their half-lives can be adjusted under various circumstances. However, most commonly used ...

Clonal Analysis of Embryonic Hematopoietic Stem Cell Precursors Using Single Cell Index Sorting Combined with Endothelial Cell Niche Co-culture

भ्रूण टेम के क्लोनल विश्लेषण स्टेम सेल Endothelial सेल आला सह संस्कृति के साथ संयुक्त छंटाई एकल कोशिका सूचकांक का उपयोग कर पुरोगामी

The ability to study hematopoietic stem cell (HSC) genesis during embryonic development has been limited by the rarity of HSC precursors in the early ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

सिंगल सेल Photoconversion में रह Zebrafish बरकरार

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

Single-cell Transcriptomic Analyses of Mouse Pancreatic Endocrine Cells

एकल-कक्ष Transcriptomic विश्लेषण माउस अग्नाशय अंत; स्रावी कोशिकाओं के

Pancreatic endocrine cells, which are clustered in islets, regulate blood glucose stability and energy metabolism. The distinct cell types in islets, ...