Name: simple lithography-free single cell micropatterning using laser-cut stencils
Uploaded: 2020-04-03T13:00:00
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Questo lavoro è stato sostenuto da una borsa di studio post-dottorato dello Stanford Child Health Research Institute (CHRI) e del National Institute of Health (1F32HL142205-01) a S.L, il NIH Office of Director's Pioneer Award (LM012179-03), l'American Heart Association Established Investigator Award (17EIA33410923), lo Stanford Cardiovascular Institute, la Hoffmann and Schroepfer Foundation, e la Stanford Division of Cardiovascular Medicine, Department of Medicine to S.M.W , premi del National Institute of Health (UG3 TR002588, P01 HL141084, R01 HL126527, R01 HL113006, R01 HL123968) e Il Tobacco-related Disease Research Program (TRDRP 27IR-0012) a J.C.W, l'American Heart Association (AHA) Postdoctoral Fellowship Award (18POST34030106) a H.Y, e il fellowbergership Hengst a T.S. Ringraziamo il Dr. Andrew Olsen di Stanford Neuroscience Microscopy Service per il supporto dell'imaging confocale dell'hiPSC-CM micromodellato. Ringraziamo H.Y. per la prima progettazione di stencil, la fabbricazione, micropatterning a singola cellula di iPSC-CM sulla coverslip rivestita di idrogel in poliacrilamina e l'imaging confocale preliminare della struttura sarcomeda degli iPSC-CM a singola cellula.

1. Fabbricazione di stencil a base di poliimide a modello negativo
<ol><li>Generare un pattern (Figura 2A) in formato .dxf utilizzando software di progettazione assistita da computer (ad esempio, AutoCAD, SolidWorks, Onshape, Adobe Illustrator).<ol>
<li>Generare un cerchio (diametro 22 mm) per delineare il bordo dello stencil.</li>
		<li>Disegnare una forma piena di pieni o il motivo desiderato.</li>
		<li>Includere una lettera chirale (ad esempio, R) per contrassegnare il lato anteriore d...

<ol>
	<li>Burridge, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+Defined+and+Small+Molecule-Based+Generation+of+Human+Cardiomyocytes.">Chemically Defined and Small Molecule-Based Generation of Human Cardiomyocytes.</a> Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).</li><li>Sayed, N., Liu, C., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translation+of+Human-Induced+Pluripotent+Stem+Cells:+From+Clinical+Trial+in+a+Dish+to+Precision+Medicine.">Translation of Human-Induced Pluripotent Stem Cells: From Clinical Trial in a Dish to Precision Medicine.</a> Journal of the American College of Cardiology. 67 (18), 2161-2176 (2016).</li><li>Ribeiro, A. J. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PDMS+absorption+of+small+molecules+and+consequences+in+microfluidic+applications.">PDMS absorption of small molecules and consequences in microfluidic applications.</a> Lab on a Chip. 6 (12), 1484-1486 (2006).</li><li>Seeger, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Premature+Termination+Codon+Mutation+in+MYBPC3+Causes+Hypertrophic+Cardiomyopathy+via+Chronic+Activation+of+Nonsense-Mediated+Decay.">A Premature Termination Codon Mutation in MYBPC3 Causes Hypertrophic Cardiomyopathy via Chronic Activation of Nonsense-Mediated Decay.</a> Circulation. 139 (6), 799-811 (2019).</li><li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+PDGF+pathway+links+LMNA+mutation+to+dilated+cardiomyopathy.">Activation of PDGF pathway links LMNA mutation to dilated cardiomyopathy.</a> Nature. 572 (7769), 335-340 (2019).</li><li>Wu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+diastolic+dysfunction+in+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+from+hypertrophic+cardiomyopathy+patients.">Modelling diastolic dysfunction in induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes from hypertrophic cardiomyopathy patients.</a> European Heart Journal. 40 (45), 3685-3695 (2019).</li><li>Fischer, R. S., Myers, K. A., Gardel, M. L., Waterman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stiffness-controlled+three-dimensional+extracellular+matrices+for+high-resolution+imaging+of+cell+behavior.">Stiffness-controlled three-dimensional extracellular matrices for high-resolution imaging of cell behavior.</a> Nature Protocols. 7 (11), 2056-2066 (2012).</li><li>Lee, S., Stanton, A. E., Tong, X., Yang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogels+with+enhanced+protein+conjugation+efficiency+reveal+stiffness-induced+YAP+localization+in+stem+cells+depends+on+biochemical+cues.">Hydrogels with enhanced protein conjugation efficiency reveal stiffness-induced YAP localization in stem cells depends on biochemical cues.</a> Biomaterials. 202, 26-34 (2019).</li><li>Th&#233;ry, M., P&#233;pin, A., Dressaire, E., Chen, Y., Bornens, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+distribution+of+stress+fibres+in+response+to+the+geometry+of+the+adhesive+environment.">Cell distribution of stress fibres in response to the geometry of the adhesive environment.</a> Cell Motility. 63 (6), 341-355 (2006).</li><li>Kilian, K. A., Bugarija, B., Lahn, B. T., Mrksich, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geometric+cues+for+directing+the+differentiation+of+mesenchymal+stem+cells.">Geometric cues for directing the differentiation of mesenchymal stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (11), 4872-4877 (2010).</li></ol>

Descriviamo un metodo di micropatterning basato su stencil privo di litografia che consente un patterning efficace delle cellule aderenti. In questo protocollo, dimostriamo la modellazione di hiPSC-CMs in diversi rapporti lunghezza-larghezza micropatternndo le isole proteiche della matrice della membrana seminterrato su idrogel di policritilmide con rigidità dei tessuti fisiologicamente o patologicamente rilevanti o substrati elastomeri a base di silicio. Questo metodo è relativamente semplice e altamente accessibile a...

L'avvento degli hiPSC e il successivo sviluppo di protocolli per la loro differenziazione diretta in diversi tipi di cellule hanno permesso di studiare lo sviluppo e la malattia a livello molecolare e specifico del paziente, in particolare utilizzando cardiomiociti iPSC derivati dal paziente (iPSC-CMs) per modellare cardiomiopatie1,2. Tuttavia, una delle principali limitazioni allo studio dello sviluppo e della fisiologia utilizzando il sistema iPSC e altri modelli in vitro è l'assenza di un microambiente strutturato. In situ, le cellule sono soggette ai vincoli della matrice extracellulare (ECM), così come le cellule vicine. La particolare composizione biochimica e la rigidità di questi microambienti dettano la distribuzione spaziale delle cellule e i fattori disponibili per l'adesione cellulare. Questo, a sua volta, influenza le vie di segnalazione intracellulare, l'espressione genica e la determinazione del destino cellulare. Ad esempio, iPSC-CM micromodellato in una forma di asta simile a un adulto ha una capacità contrattile significativamente migliore, flusso di calcio, organizzazione mitocondriale, elettrofisiologia e formazione trasversa-tubulo3. Pertanto, le proprietà del microambiente sono parte integrante della regolazione delle funzioni cellulari.
Le precedenti tecniche di micromodellazione si basavano fortemente sulla fotolitografia (Figura 1A). In questa tecnica, uno strato di polimero fotosensibile, o fotoresist, viene filato su un substrato piatto dalla soluzione per formare una pellicola sottile di circa 1 m di spessore. Successivamente, la luce ultravioletta (UV) viene applicata al fotoresist attraverso una maschera contenente il modello desiderato. L'esposizione alla luce ultravioletta (UV) altera chimicamente il fotoresist modificandone la solubilità nella rispettiva soluzione per sviluppatori, trasferendo il modello desiderato dalla maschera al substrato. Molti metodi di micropatterning incorporano la fotolitografia, in quanto conferisce il nanometro al controllo a livello di micrometro sulla progettazione dei modelli cellulari. Tuttavia, la rotazione del fotoresist è altamente sensibile alle impurità, perché le particelle di polvere più piccole interromperanno la diffusione della soluzione in una pellicola sottile. La fotolitografia deve pertanto essere effettuata in strutture non contaminate, che sono costose da mantenere e richiedono particolari competenze da utilizzare. Inoltre, le sostanze chimiche utilizzate nella fotolitografia sono spesso tossiche per le cellule e possono denaturare importanti biomolecole. Pertanto, la fotolitografia pone notevoli ostacoli alla fabbricazione di micromodelli per pratiche applicazioni biologiche.
Nel 1994, Whitesides e colleghi4 hanno superato alcune delle sfide associate alla fotolitografia aprendo la strada a una raccolta di tecniche chiamate litografia morbida. Nella litografia morbida, una superficie microstrutturata realizzata con polidimetilsiloxane (PDMS), un materiale trasparente, simile alla gomma, viene utilizzata per generare un modello di proteine ECM4. Le tecniche litografiche morbide comuni includono la stampa a microcontatto e la modellazione microfluidica. Nella stampa a microcontatto, attualmente il metodo litografico morbido più diffuso, un timbro PDMS rivestito con proteine ECM trasferisce il materiale su una superficie alle aree contattate dal francobollo (Figura 1B). Nel patterning microfluidico, le microstrutture sono progettate su una superficie PDMS in modo che quando il timbro viene premuto su un substrato, viene creata una rete di microcanali, attraverso i quali i fluidi possono essere consegnati alle aree desiderate (Figura 1C)5. La litografia soft offre diversi vantaggi rispetto alla fotolitografia. Una volta che un wafer master è microfabbricato, i francobolli PDMS possono essere facilmente replicati senza ulteriore impiego di strutture per camere pulite. Inoltre, l'assenza di solventi organici nel processo di litografia morbida consente l'utilizzo di materiali polimerici come il polistirolo, tipicamente utilizzato nella coltura cellulare. Infine, la micropatterning con metodi litografici morbidi non è limitata alle superfici piatte. Così, la litografia morbida aumenta l'accessibilità e la funzionalità della fabbricazione di micropattern rispetto alla fotolitografia6. Tuttavia, la litografia morbida presenta svantaggi significativi. Ad esempio, una fase iniziale di incisione, utilizzando la fotolitografia, è ancora necessaria per microfabbricare il timbro. Inoltre, la micromodellazione con un timbro PDMS è soggetta a variazioni nella qualità del trasferimento di proteine sul substrato6. Evitare queste discrepanze richiede ottimizzazione e consistenza nella pressione applicata al timbro PDMS durante il trasferimento di proteine, altrimenti la deformazione e la distorsione delle dimensioni delle feature degli stampi PDMS possono verificarsi6. C'è anche una grande preoccupazione di utilizzare ripetutamente il PDMS a causa dell'assorbimento di piccole molecole7.
Per evitare l'uso di fotolitografia morbida e timbri PDMS, descriviamo un metodo di micropatterning a singola cellula basato su stencil e litografia che supera molti degli ostacoli associati alla fotolitografia e alla litografia morbida. In questo metodo, un idrogel di poliacrilammide viene utilizzato come substrato per l'incorporazione di proteine ECM a base di stencil, consentendo la placcatura selettiva di singoli hiPSC-CM. Questa tecnica è altamente compatibile con i materiali polimerici utilizzati nelle classiche condizioni di coltura cellulare. Inoltre, con una corretta pulizia e manutenzione, gli stencil sono riutilizzabili e resistenti alla degradazione e all'assorbimento delle proteine durante il processo di microfabbricazione. Infine, il processo di modellazione è tecnicamente robusto, economico, personalizzabile e accessibile a coloro che non hanno competenze di bioingegneria specializzate. Questa tecnica di micropatterning basato su stencil è stata ampiamente utilizzata nelle nostre recenti pubblicazioni modellando varie cardiomiopatie8,9,10.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Aminoethyl methacrylate hydrochloride (powder)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>516155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide solution 40% (solution)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A-4058-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bench UV lamp 365 nm</td>
			<td>UVP</td>
			<td>UVP 95-0042-07, XX-15L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioFlex culture plate</td>
			<td>FLEXCELL INTERNATIONAL CORPORATION, Burlington, NC</td>
			<td></td>
			<td>6-well plate with silicon elastomer substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bis-acrylamide solution 2% (solution)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1533-25mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning cover glasses square, No. 2, W &#215; L 22 mm &#215; 22 mm</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CLS285522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Irgacure (2-Hydroxy-4&#8242;-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone) (powder)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>410896</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td>basement membrane matrix protein solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl sulfoxide, 99.7+%, Extra Dry, AcroSeal, ACROS Organics</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>326881000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex (13mm) filter unit with Durapore Membrane</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGV013SL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millipore 50mL Steriflip (0.22 &#181;m)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SCGP00525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stencils</td>
			<td>Potomac</td>
			<td>custom design</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfo-SANPAH</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>22589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Select 10x</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A1217702</td>
			<td>Enzyme used for stencil cleaning</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simple lithography-free single cell micropatterning using laser-cut stencils

Le tecniche di micromodellazione sono state ampiamente utilizzate nella biologia cellulare per studiare gli effetti del controllo della forma e delle dimensioni delle cellule sulla determinazione del destino cellulare a risoluzione cellulare singola. Le attuali tecniche di micromodellazione a singola cellula all'avanguardia coinvolgono la litografia morbida e la stampa a microcontatto, che è una tecnologia potente, ma richiede competenze ingegneristiche addestrate e il supporto di alcune strutture nella microfabbricazione. Queste limitazioni richiedono una tecnica più accessibile. Qui, descriviamo un semplice metodo alternativo senza litografia: modellazione a cella singola basata su stencil. Forniamo procedure passo-passo tra cui la progettazione di stencil, la fabbricazione di idrogel poliacrilammide, l'incorporazione di proteine basate su stencil e la placcatura e la coltura cellulare. Questo semplice metodo può essere utilizzato per creare una matrice di ben 2.000 celle. Dimostriamo il modello di cardiomiociti derivati da singole cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo (hiPSC) con forme cellulari distinte, da un quadrato 1:1 a un rettangolo adulto 7:1 cardiomiocito-come. Questo patterning a cella singola basato su stencil è privo di litografia, tecnicamente robusto, conveniente, poco costoso e, soprattutto, accessibile a coloro che hanno un background di bioingegneria limitato.

È stata dimostrata la fabbricazione di stencil contenenti una matrice di quadrati o rettangoli (Figura 4A). Seguendo questo protocollo, abbiamo ottenuto isole di proteine a matrice modellata (Figura 4B e Figura 5A) e celle (Figura 4C). La concentrazione di soluzione proteica a matrice non ottimale ha portato a patterning non ottimale (Figura 5B). È fondamentale utilizzare...

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Simple Lithography-Free Single Cell Micropatterning using Laser-Cut Stencils

Questo protocollo introduce un metodo di micromodellazione senza litografia che è semplice e accessibile a coloro che hanno un background di bioingegneria limitato. Questo metodo utilizza stencil personalizzati tagliati al laser per micropattern proteine a matrice extracellulare in una forma di interesse per la modulazione delle morfologie cellulari. La procedura per la micropatterning è dimostrata utilizzando cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotti.

Micropatterning a cella singola semplice senza litografia con stencil laser-cut

Micropatterning techniques have been widely used in cell biology to study effects of controlling cell shape and size on cell fate determination at single ...

Descriveremo un metodo di micropattern a singola cella privo di litografia basato su stencil che supera molti ostacoli associati alla fotolitografia e alla litografia morbida. Gli stencil sono riutilizzabili e il processo è economico e personalizzabile. Questo metodo ha aperto una nuova strada per i ricercatori non ingegneri per studiare la forma cellulare e la meccanotraduzione indotta dall'area in vari contesti fisiologici e patologici.Inoltre, questo protocollo consente la micropatterning di migliaia di cellule che possono essere utilizzate per lo screening dei farmaci ad alta produttività e la modellazione delle malattie in un piatto. La dimostrazione visiva faciliterà l'impianto di due passaggi cruciali: distacco di coverslip dall'idrogel, essiccazione dell'idrogel sufficientemente prima di posizionare lo stencil. Preparare la soluzione di idrogel di poliacrilammide in un nuovo tubo di centrifuga di propilene da 50 millilitri come descritto nel manoscritto.Successivamente, per preparare la soluzione di fotoinizio del 5%, sciogliere gli ingredienti in 700 microlitri di etanolo al 100%. Gli ingredienti non sono solubili in acqua, quindi assicurati di dissolversi completamente con il vortice. Aggiungere 300 microlitri di PBS per un volume finale di un millilitro.Lavorando su ghiaccio, diluire la soluzione di stock proteico della matrice di membrana basale con supporti DMEM F12 ghiacciati o 1X PBS al rapporto di diluizione ottimizzato. Tenere sul ghiaccio per un uso successivo. Quando si lavora con la matrice a membrana basale, assicurarsi di lavorare sempre sul ghiaccio e utilizzare soluzioni di freddo ghiaccio in punte e tubi di pipetta refrigerati.Posizionare una lampada da banco UV in una cappa di sicurezza biologica. Quindi, posizionare i film di paraffina sterilizzati preparati in precedenza. Se le pellicole di paraffina non sono completamente asciutte, utilizzare un sistema di aspirazione sottovuoto per rimuovere eventuali liquidi residui.Usando le forcep autoclavate, posiziona sei coverlips autoclavate sul film di paraffina sei in ogni piastra di Petri. Per preparare la soluzione finale di poliacrilammide cross-linkable UV, diluire la soluzione fotoiniziatore con la soluzione precursore dell'idrogel di poliacrilammide. Sterilizzare la soluzione utilizzando un'unità filtrante da 50 millilitri con una dimensione dei pori di 0,22 micrometri.Quindi erogare 200 microlitri di soluzione finale in poliacrilammide retibile UV su ciascuno dei sei coprispacchi in vetro nelle piastre di Petri. Utilizzando le forcep autoclavate, coprire con cura ogni coverlip con un secondo coverslip intrappolando uno strato della soluzione tra i due copripavimenti. Posizionare le piastre di Petri contenenti i copripacchi sotto la lampada da banco UV con il coperchio chiuso.La copertura del white paper sulla superficie non bianca è importante per ridurre al minimo la perdita di intensità UV. Per la protezione dalle radiazioni UV, coprire la lampada con un foglio di alluminio. Fotopolimerizzare gli idrogel di poliacrilammide per cinque minuti.Utilizzare una lama di rasoio per separare accuratamente ogni paio di coverlips. Riempire il serbatoio contenente sei compositi di coverslip idrogel con PBS. Dopo il risciacquo per cinque minuti, riportare i compositi di coverlip dell'idrogel al film di paraffina nella piastra di Petri.Ottenere un tubo di Sulfo-SANPAH dallo stoccaggio a meno 80 gradi Celsius. Aggiungere 1.200 microlitri di PBS pre-refrigerato al tubo e mescolare tubazione su e giù. Distribuire 200 microlitri del Sulfo-SANPAH diluito sul film di paraffina nella piastra di Petri.Posizionare un composito di coverslip idrogel sul Sulfo-SANPAH con l'idrogel che contatta il Sulfo-SANPAH. Quindi, posizionare i compositi di copertura dell'idrogel sotto la lampada UV ed esporli per cinque minuti per attivare il Sulfo-SANPAH. Se il Sulfo-SANPAH passa dall'arancione al marrone indicando l'attivazione e l'incorporazione di successo, procedere ai passaggi successivi entro 10 minuti.Reintegrare il serbatoio monouso in polipropilene con PBS fresco. Trasferire i compositi di frantoio attivati nel serbatoio e sciacquarli brevemente per rimuovere il Sulfo-SANPAH non legato. Posizionare i compositi di coverlip dell'idrogel sul film di paraffina nelle piastre di Petri e tamponarli con cura con salviette sterili senza pelucchi.Posizionare uno stencil sopra ogni idrogel coverslip composito. Per garantire una tenuta stretta tra lo stencil e il composito, rimuovere l'umidità in eccesso tamponando con salviette autoclavate senza pelucchi. Erogare con cura la soluzione proteica della matrice di membrana basale diluita posizionando 200 microlitri sopra ogni composito di coprisciuma idrogel.Incubare i costrutti durante la notte a 37 gradi Celsius. Il giorno dopo, trasferire i compositi su una piastra a sei pozza. Una tenuta stretta tra idrogel e stencil può essere facilmente convalidata osservando se la soluzione proteica della matrice è stata mantenuta sopra lo stencil.La mancata formare una tenuta stretta porta a una rapida perdita della soluzione proteica attraverso i fori. Immergere completamente i compositi in PBS. Utilizzando pinzette in autoclave, staccare accuratamente gli stencil dagli idrogel senza strappare gli idrogel.Rimuovere il PBS dai pozzi e riempire i pozzi con DMEM. Incubare il piatto durante la notte a 37 gradi Celsius. Dopo aver rimosso la piastra dall'incubatore, esaminare il DMEM.Se il DMEM non è torbido, i compositi idrogel coverslip sono pronti per essere utilizzati per la placcatura cellulare. Gli stencil erano fabbricati contenenti matrici di quadrati e rettangoli. Substrati idrogel micropatterned sono stati creati dagli stencil e sono state ottenute isole di proteine matrici.Sono state ottenute anche isole cellulari. Ad esempio, isole di cardiomiociti pluripotenti derivati da cellule staminali indotte dall'uomo. La concentrazione di proteine matriciali ha svolto un ruolo essenziale nel generare modelli propri.Una concentrazione ottimale ha portato ad una distribuzione omogenea delle proteine. Le concentrazioni di soluzione proteica a matrice non ottimale hanno portato a modelli non ottimale. È fondamentale utilizzare il lato anteriore dello stencil.Se viene utilizzato il lato posteriore dello stencil, la dimensione delle isole proteiche della matrice aumenta a causa della direzione del taglio laser. Mentre l'uso del lato posteriore dello stencil non influisce in modo significativo sulla larghezza dei motivi rettangolari, l'altezza è aumentata significativamente portando a una riduzione delle proporzioni desiderate. La modelliatura a base di stencil è stata applicata ai substrati di elastomero di silicio.I cardiomiociti modellati sui substrati di elastomero di silicio sono stati visualizzati dall'immunocitochimica della troponina cardiaca T a basso ingrandimento e dalla proteina sarcomerica alfa-actina ad alto ingrandimento. Il modello a base di stencil è stato anche applicato al modello di due cardiomiociti fianco a fianco su idrogel con rigidità diverse. La scoperta di cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo e dei corrispondenti protocolli di differenziazione ne ha fatto un modello umano ideale in vitro per lo studio dell'oncogenesi e della patogenesi.Tuttavia, una delle principali limitazioni all'uso del sistema IPS è l'assenza di struttura al microambiente che ha particolare composizione biochimica e rigidità per interagire con le cellule. Il patterning può essere combinato con microscopia a forza di trazione e test immunocitochimica per caratterizzare la struttura e la funzione dei cardiomiociti. L'analisi dei tipi cellulari derivati dall'IPS, nel nostro caso cardiomiocita, in una morfologia più fisiologica apre opportunità per studiare cardiomiociti impegnativi nel piatto di coltura.La tecnica può anche essere applicata a molti altri sistemi come e piastre di screening ad alto contenuto. La forma e il substrato possono essere facilmente adattati all'applicazione.

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Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

Single-cell Transcriptomic Analyses of Mouse Pancreatic Endocrine Cells

Analisi trascrittomica unicellulare delle cellule Endocrine del pancreas del Mouse

Pancreatic endocrine cells, which are clustered in islets, regulate blood glucose stability and energy metabolism. The distinct cell types in islets, ...