Name: simple lithography-free single cell micropatterning using laser-cut stencils
Uploaded: 2020-04-03T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Simple Lithography-Free Single Cell Micropatterning using Laser-Cut Stencils at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av postdoktorstipend fra Stanford Child Health Research Institute (CHRI) og National Institute of Health (1F32HL142205-01) til S.L, NIH Office of Director's Pioneer Award (LM012179-03), American Heart Association Etablert Investigator Award (17EIA33410923), Stanford Cardiovascular Institute, Hoffmann og Schroepfer Foundation, og Stanford Division of Cardiovascular Medicine, Institutt for medisin til S.M.W , priser fra National Institute of Health (UG3 TR002588, P01 HL141084, R01 HL126527, R01 HL113006, R01 HL123968) og Tobacco-related Disease Research Program (TRDRP 27IR-0012) til J.C.W, American Heart Association (AHA) Postdoctoral Fellowship Award (18POST34030106) til H.Y, og Hengstberger fellesskap til T.S. Vi takker Dr. Andrew Olsen fra Stanford Neuroscience Microscopy Service på støtte fra konfokal avbildning av mikromønstret hiPSC-CM. Vi takker H.Y. for første sjablongdesign, fabrikasjon, mikromønster av iPSC-CM på polyakrylamidhydrogelbelagt coverslip, og foreløpig konfokal avbildning av sarkofamerstrukturen til encellede mikromønstrede iPSC-CMs.

1. Fabrikasjon av negativt mønster polyimidbaserte sjablonger
<ol><li>Generer et mønster (Figur 2A) i .dxf-format ved hjelp av dataassistert designprogramvare (f.eks. AutoCAD, SolidWorks, Onshape, Adobe Illustrator).<ol>
<li>Generer en sirkel (diameter = 22 mm) for å avgrense grensen til sjablongen.</li>
		<li>Tegn en heldekkende form eller ønsket mønster.</li>
		<li>Ta med en kiralbokstav (f.eks. r) for å merke forsiden av sjablongene. MERK: Som et eksempel genereres en rekke fir...

<ol>
	<li>Burridge, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+Defined+and+Small+Molecule-Based+Generation+of+Human+Cardiomyocytes.">Chemically Defined and Small Molecule-Based Generation of Human Cardiomyocytes.</a> Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).</li><li>Sayed, N., Liu, C., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translation+of+Human-Induced+Pluripotent+Stem+Cells:+From+Clinical+Trial+in+a+Dish+to+Precision+Medicine.">Translation of Human-Induced Pluripotent Stem Cells: From Clinical Trial in a Dish to Precision Medicine.</a> Journal of the American College of Cardiology. 67 (18), 2161-2176 (2016).</li><li>Ribeiro, A. J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contractility+of+single+cardiomyocytes+differentiated+from+pluripotent+stem+cells+depends+on+physiological+shape+and+substrate+stiffness.">Contractility of single cardiomyocytes differentiated from pluripotent stem cells depends on physiological shape and substrate stiffness.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (41), 12705-12710 (2015).</li><li>Kumar, A., Biebuyck, H. A., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterning+Self-Assembled+Monolayers:+Applications+in+Materials+Science.">Patterning Self-Assembled Monolayers: Applications in Materials Science.</a> Langmuir. 10 (5), 1498-1511 (1994).</li><li>Wilbur, J. L., Kumar, A., Kim, E., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfabrication+by+microcontact+printing+of+self-assembled+monolayers.">Microfabrication by microcontact printing of self-assembled monolayers.</a> Advanced Materials. 6 (7-8), 600-604 (1994).</li><li>Th&#233;ry, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micropatterning+as+a+tool+to+decipher+cell+morphogenesis+and+functions.">Micropatterning as a tool to decipher cell morphogenesis and functions.</a> Journal of Cell Science. 123 (24), 4201-4213 (2010).</li><li>Toepke, M. W., Beebe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PDMS+absorption+of+small+molecules+and+consequences+in+microfluidic+applications.">PDMS absorption of small molecules and consequences in microfluidic applications.</a> Lab on a Chip. 6 (12), 1484-1486 (2006).</li><li>Seeger, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Premature+Termination+Codon+Mutation+in+MYBPC3+Causes+Hypertrophic+Cardiomyopathy+via+Chronic+Activation+of+Nonsense-Mediated+Decay.">A Premature Termination Codon Mutation in MYBPC3 Causes Hypertrophic Cardiomyopathy via Chronic Activation of Nonsense-Mediated Decay.</a> Circulation. 139 (6), 799-811 (2019).</li><li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+PDGF+pathway+links+LMNA+mutation+to+dilated+cardiomyopathy.">Activation of PDGF pathway links LMNA mutation to dilated cardiomyopathy.</a> Nature. 572 (7769), 335-340 (2019).</li><li>Wu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+diastolic+dysfunction+in+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+from+hypertrophic+cardiomyopathy+patients.">Modelling diastolic dysfunction in induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes from hypertrophic cardiomyopathy patients.</a> European Heart Journal. 40 (45), 3685-3695 (2019).</li><li>Fischer, R. S., Myers, K. A., Gardel, M. L., Waterman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stiffness-controlled+three-dimensional+extracellular+matrices+for+high-resolution+imaging+of+cell+behavior.">Stiffness-controlled three-dimensional extracellular matrices for high-resolution imaging of cell behavior.</a> Nature Protocols. 7 (11), 2056-2066 (2012).</li><li>Lee, S., Stanton, A. E., Tong, X., Yang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogels+with+enhanced+protein+conjugation+efficiency+reveal+stiffness-induced+YAP+localization+in+stem+cells+depends+on+biochemical+cues.">Hydrogels with enhanced protein conjugation efficiency reveal stiffness-induced YAP localization in stem cells depends on biochemical cues.</a> Biomaterials. 202, 26-34 (2019).</li><li>Th&#233;ry, M., P&#233;pin, A., Dressaire, E., Chen, Y., Bornens, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+distribution+of+stress+fibres+in+response+to+the+geometry+of+the+adhesive+environment.">Cell distribution of stress fibres in response to the geometry of the adhesive environment.</a> Cell Motility. 63 (6), 341-355 (2006).</li><li>Kilian, K. A., Bugarija, B., Lahn, B. T., Mrksich, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geometric+cues+for+directing+the+differentiation+of+mesenchymal+stem+cells.">Geometric cues for directing the differentiation of mesenchymal stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (11), 4872-4877 (2010).</li></ol>

Vi beskriver en litografifri sjablongbasert mikromønstermetode som muliggjør effektiv mønster av tilhengerceller. I denne protokollen viser vi mønster av hiPSC-CMs i forskjellige lengde-til-bredde-forhold ved mikromønster i kjellermembranmatriseproteinøyer på polyakrylamidhydrogeler med fysiologisk- eller patologisk relevante vevsstivheter eller silisiumbaserte elastomersubstrater. Denne metoden er relativt enkel og svært tilgjengelig for alle forskere, inkludert de som har liten bakgrunn i fotolittografi og mikr...

Bruk av hiPSCer og den påfølgende utviklingen av protokoller for deres rettet differensiering i forskjellige celletyper har gjort det mulig å studere utvikling og sykdom på molekylært og pasientspesifikt nivå, spesielt ved hjelp av pasientavledede iPSC kardiomyocytter (iPSC-CMs) for å modellere kardiomyopatier1,2. En stor begrensning for å studere utvikling og fysiologi ved hjelp av iPSC-systemet og andre in vitro-modeller er imidlertid fraværet av et strukturert mikromiljø. I situ blir celler utsatt for begrensningene i den ekstracellulære matrisen (ECM), samt nærliggende celler. Den spesielle biokjemiske sammensetningen og stivheten i disse mikromiljøene dikterer den romlige fordelingen av celler, samt faktorer som er tilgjengelige for å engasjere seg i cellevedhesjon. Dette påvirker i sin tur intracellulære signalveier, genuttrykk og celleskjebnebestemmelse. For eksempel har mikromønstret iPSC-CM i en voksen-lignende stangform en betydelig bedre kontraktile evne, kalsiumstrøm, mitokondrieorganisasjon, elektrofysiologi og tverrgående tubuleformasjon3. Dermed er mikromiljøets egenskaper integrert i reguleringen av cellulære funksjoner.
Tidligere mikromønsterteknikker var sterkt avhengige av fotolitografi (Figur 1A). I denne teknikken er et lag med fotosensitiv polymer, eller fotoresist, spunnet på et flatt substrat fra løsning for å danne en tynn film ca 1 μm tykk. Deretter påføres ultrafiolett (UV) lys på fotoresist gjennom en maske som inneholder ønsket mønster. Eksponering for ultrafiolett (UV) lys endrer kjemisk fotoresist ved å endre sin løselighet i sin respektive utviklerløsning, overføre ønsket mønster fra masken til substratet. Mange mikromønstermetoder inneholder fotolitografi, da den gir nanometer til mikrometernivåkontroll over utformingen av cellemønstrene. Imidlertid er spinningen av fotoresist svært følsom for urenheter, fordi de minste støvpartiklene vil forstyrre spredningen av løsningen til en tynn film. Fotolitografi må derfor utføres i uforurensede anlegg, som er kostbare å vedlikeholde og kreve spesiell kompetanse å utnytte. I tillegg er kjemikaliene som brukes i fotolitografi ofte giftige for celler og kan denature viktige biomolekyler. Dermed utgjør fotolitografi betydelige hindringer for fabrikasjon av mikromønstre for praktiske biologiske applikasjoner.
I 1994 overvant Whitesides og kolleger4 noen av utfordringene knyttet til fotolitografi ved å banebryte en samling teknikker kalt myk litografi. I myk litografi brukes en mikrostrukturert overflate laget med polydimethylsiloxane (PDMS), et gjennomsiktig, gummilignende materiale, til å generere et mønster av ECM-proteiner4. Vanlige myke littografiske teknikker inkluderer mikrokontaktutskrift og mikrofluidisk mønster. I mikrokontaktutskrift, for tiden den mest populære myke littografiske metoden, overfører et PDMS-stempel belagt med ECM-proteiner materialet til en overflate på områdene som kontaktes av stempelet (Figur 1B). I mikrofluidisk mønster er mikrostrukturer utformet på en PDMS-overflate slik at når stempelet trykkes til et substrat, opprettes et nettverk av mikrokanaler, der væsker kan leveres til ønskede områder, (Figur 1C)5. Myk litografi gir flere fordeler over fotolitografi. Når en master wafer er mikrofabrikkert, pdms frimerker kan lett replikeres uten videre sysselsetting av rene rom fasiliteter. I tillegg tillater fraværet av organiske løsemidler i prosessen med myk litografi for utnyttelse av polymere materialer som polystyren, vanligvis brukt i cellekultur. Til slutt er mikromønster ved hjelp av myke littografiske metoder ikke begrenset til flate overflater. Dermed øker myk litografi tilgjengeligheten og funksjonaliteten til mikromønsterfabrikasjon over fotolittografi6. Imidlertid har myk litografi betydelige ulemper. For eksempel er et innledende etsningstrinn, ved hjelp av fotolitografi, fortsatt nødvendig for å mikrofabrikkere stempelet. I tillegg er mikromønster ved hjelp av et PDMS-stempel gjenstand for variasjoner i kvaliteten på proteinoverføring på substratet6. Unngå disse avvikene krever optimalisering og konsistens i trykket som brukes på PDMS-stempelet under proteinoverføring, ellers kan deformasjon og forvrengning av funksjonsstørrelsene til PDMS-formene forekomme6. Det er også en stor bekymring for gjentatte ganger å bruke PDMS på grunn av liten molekylabsorpsjon7.
For å unngå å bruke myk fotolitografi og PDMS-frimerker, beskriver vi en sjablongbasert, litografifri mikromønstermetode for én celle som overvinner mange av hindringene forbundet med fotolitografi og myk litografi. I denne metoden brukes en polyakrylamidhydrogel som et substrat for sjablongbasert ECM-proteininkorporering, noe som muliggjør selektiv plating av enkelthiPSC-CMs. Denne teknikken er svært kompatibel med polymere materialer som brukes i klassiske cellekulturforhold. Videre, med riktig rengjøring og vedlikehold, er sjablongene gjenbrukbare og motstandsdyktige mot nedbrytning og proteinabsorpsjon under mikrofabrikasjonsprosessen. Til slutt er mønsterprosessen teknisk robust, billig, tilpassbar og tilgjengelig for de uten spesialiserte biotekniske ferdigheter. Denne sjablongbaserte mikromønsterteknikken har blitt bredt benyttet i våre nyere publikasjoner modellering varierte kardiomyopatier8,9,10.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Aminoethyl methacrylate hydrochloride (powder)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>516155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide solution 40% (solution)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A-4058-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bench UV lamp 365 nm</td>
			<td>UVP</td>
			<td>UVP 95-0042-07, XX-15L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioFlex culture plate</td>
			<td>FLEXCELL INTERNATIONAL CORPORATION, Burlington, NC</td>
			<td></td>
			<td>6-well plate with silicon elastomer substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bis-acrylamide solution 2% (solution)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1533-25mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning cover glasses square, No. 2, W &#215; L 22 mm &#215; 22 mm</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CLS285522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Irgacure (2-Hydroxy-4&#8242;-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone) (powder)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>410896</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td>basement membrane matrix protein solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl sulfoxide, 99.7+%, Extra Dry, AcroSeal, ACROS Organics</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>326881000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex (13mm) filter unit with Durapore Membrane</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGV013SL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millipore 50mL Steriflip (0.22 &#181;m)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SCGP00525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stencils</td>
			<td>Potomac</td>
			<td>custom design</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfo-SANPAH</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>22589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Select 10x</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A1217702</td>
			<td>Enzyme used for stencil cleaning</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simple lithography-free single cell micropatterning using laser-cut stencils

Mikromønsterteknikker har blitt mye brukt i cellebiologi for å studere effekter av å kontrollere celleform og størrelse på celleskjebnebestemmelse ved encelleoppløsning. Dagens toppmoderne mikromønsterteknikker for én celle innebærer myk litografi og mikrokontaktutskrift, som er en kraftig teknologi, men krever opplærte ingeniørferdigheter og visse anleggsstøtte i mikrofabrikasjon. Disse begrensningene krever en mer tilgjengelig teknikk. Her beskriver vi en enkel alternativ litografifri metode: sjablongbasert enkeltcellemønster. Vi tilbyr trinnvise prosedyrer, inkludert sjablongdesign, polyakrylamidhydrogelfabrikasjon, sjablongbasert proteininkorporering og celleplating og kultur. Denne enkle metoden kan brukes til å mønstre en rekke så mange som 2000 celler. Vi demonstrerer mønsteret av kardiomyocytter avledet fra enkelt humant indusert pluripotente stamceller (hiPSC) med forskjellige celleformer, fra en 1:1 kvadrat til et 7:1 voksen kardiomyocyte-lignende rektangel. Denne sjablongbaserte enkeltcellemønsteret er litografifri, teknisk robust, praktisk, billig og viktigst tilgjengelig for de med begrenset bioingeniørbakgrunn.

Fabrikasjon av sjablonger som inneholder en rekke firkanter eller rektangler er demonstrert (figur 4A). Etter denne protokollen fikk vi mønstrede matriseproteinøyer (Figur 4B og figur 5A) og celler (Figur 4C). Suboptimal matriseproteinløsningskonsentrasjon førte til suboptimal mønster (figur 5B). Det er viktig å bruke forsiden av sjablongen. Hvis baksiden av sjablonge...

Watch this Scientific Journal Video about Simple Lithography-Free Single Cell Micropatterning using Laser-Cut Stencils at JoVE.com

Simple Lithography-Free Single Cell Micropatterning using Laser-Cut Stencils

Denne protokollen introduserer en litografifri mikromønstermetode som er enkel og tilgjengelig for de med begrenset bioingeniørbakgrunn. Denne metoden benytter tilpassede laserkuttede sjablonger til mikromønster ekstracellulære matriseproteiner i en form av interesse for modulerende cellemorfologier. Prosedyren for mikromønster er demonstrert ved hjelp av indusert pluripotent stamcelle avledet kardiomyocytter.

Enkel litografifri mikromønster med én celle ved hjelp av laserkuttede sjablonger

Micropatterning techniques have been widely used in cell biology to study effects of controlling cell shape and size on cell fate determination at single ...

Vi vil beskrive en sjablongbasert litografifri encellede mikrokremmetode som overvinner mange hindringer forbundet med fotolitografi og myk litografi. Sjablongene kan brukes på nytt og prosessen er billig og tilpassbar. Denne metoden åpnet en ny vei for ikke-ingeniør forskere å studere celleform og områdeindusert mekanotransduksjon i ulike fysiologiske og patologiske sammenhenger.Videre, Denne protokollen gjør det mulig for mikropattering av tusenvis av celler som kan benyttes for høy gjennomstrømning narkotika screening og sykdom modellering i en tallerken. Visuell demonstrasjon vil lette implantasjonen av to avgjørende trinn: løsrivelse av dekkglass fra hydrogel, tørking hydrogel tilstrekkelig før du plasserer sjablongen. Forbered polyakrylamhydrogelløsningen i et nytt 50 milliliter propylen sentrifugerør som beskrevet i manuskriptet.Deretter, for å forberede 5% fotoinitiatorløsning, oppløs ingrediensene i 700 mikroliter på 100% etanol. Ingrediensene er ikke vannløselige, så sørg for å oppløses helt ved å virvle. Tilsett 300 mikroliter PBS for et endelig volum på én milliliter.Arbeid på is, fortynne kjeller membran matrise protein lager løsning med iskald DMEM F12 media eller 1X PBS til optimalisert fortynning forholdet. Oppbevars på is til senere bruk. Når du arbeider med kjellermembranmatrise, må du alltid jobbe med is og bruke iskalde løsninger i kjølte pipettespisser og rør.Plasser en UV-benklampe i en biologisk sikkerhetshette. Deretter plasserer du de steriliserte parafinfilmene som er forberedt tidligere. Hvis parafinfilmene ikke er helt tørre, bruk et vakuumaspirasjonssystem for å fjerne eventuell gjenværende væske.Bruk autoklavert tang, plasser seks autoklaverde dekkslepper på parafinfilmen seks i hver petriskål. For å forberede UV-kryss-linkable polyakrylamid endelig løsning, fortynne fotoinitiatorløsningen med polyakrylamhydrogel forløperløsning. Steriliser oppløsningen ved hjelp av en 50 milliliter filterenhet med en 0,22 mikrometerporstørrelse.Deretter dispensere 200 mikroliter uv kryss-linkable polyakrylamid endelig løsning på hver av de seks glass dekkerlips i Petri retter. Bruk autoklavet tang, dekk forsiktig hver dekkslipp med en ekstra dekkslips fange et lag av løsningen mellom de to dekkslips. Plasser Petri-rettene som inneholder dekkglassene under UV-benklampen med lokket lukket.Dekningen av hvitt papir på den ikke-hvite overflaten er viktig for å minimere UV-intensitetstapet. For beskyttelse mot UV-stråling, dekk lampen med aluminiumsfolie. Fotopolymerize polyakrylamid hydrogels i fem minutter.Bruk et barberblad til å skille hvert par dekkglass forsiktig. Fyll beholderen som inneholder seks hydrogeldeksler med PBS. Etter skylling i fem minutter, returnerer hydrogel dekkerslip kompositter til parafin filmen i Petri parabolen.Få et rør med Sulfo-SANPAH fra lagring ved minus 80 grader Celsius. Tilsett 1200 mikroliter forhåndskjølte PBS i røret og bland ved å pipetter opp og ned. Dispenser 200 mikroliter av fortynnet Sulfo-SANPAH på parafinfilmen i petriskålen.Plasser en hydrogeldekslers kompositt over Sulfo-SANPAH med hydrogelen som kommer i kontakt med Sulfo-SANPAH. Deretter plasserer du hydrogeldekslers kompositter under UV-lampen og eksponerer dem i fem minutter for å aktivere Sulfo-SANPAH. Hvis Sulfo-SANPAH går fra oransje til brun som indikerer vellykket aktivering og inkorporering, fortsett til de neste trinnene innen 10 minutter.Etterfyll engangspolypropylenreservoaret med fersk PBS. Overfør de aktiverte hydrogeldekslekompossene til reservoaret og skyll dem kort for å fjerne ubundet Sulfo-SANPAH. Legg hydrogeldekselipkompositter på parafinfilmen i Petri-rettene og dab dem forsiktig med sterile lofrie kluter.Plasser en sjablong på toppen av hver hydrogel dekkerlip kompositt. For å sikre en tett forsegling mellom sjablongen og kompositten, fjern overflødig fuktighet ved å dabbe med autoklavert lofrie kluter. Dispenser forsiktig den fortynnede kjellermembranmatriksproteinløsningen som plasserer 200 mikroliter på toppen av hver hydrogeldekslers kompositt.Inkuber konstruksjonene over natten ved 37 grader Celsius. Neste dag, overføre komposittene til en seks-brønns plate. En tett forsegling mellom hydrogel og sjablong kan enkelt valideres ved å observere om matriseproteinløsningen er beholdt på toppen av sjablongen.Unnlatelse av å danne en tett forsegling fører til rask lekkasje av proteinoppløsningen gjennom hullene. Dypp komposittene helt ned i PBS. Bruk autoklavet pinsett, koble forsiktig sjablongene fra hydrogelene uten å rive hydrogelene.Fjern PBS fra brønnene og fyll på brønnene med DMEM. Inkuber platen over natten ved 37 grader Celsius. Etter at du har fjernet platen fra inkubatoren, må du undersøke DMEM.Hvis DMEM ikke er overskyet, er hydrogeldeksleglasskompositter klare til bruk til celleplating. Sjablonger ble fabrikkert som inneholder matriser av firkanter og rektangler. Mikropatterned hydrogel underlag ble opprettet fra sjablonger og øyene av matrise protein ble oppnådd.Celleøyer ble også innhentet. For eksempel, øyer av menneske-indusert pluripotente stamcelle-avledede kardiomyocytter. Matrix protein konsentrasjon spilte en viktig rolle i å generere riktige mønstre.En optimal konsentrasjon førte til en homogen fordeling av proteiner. Suboptimale matriseproteinoppløsningskonsentrasjoner førte til suboptimalt mønster. Det er viktig å bruke forsiden av sjablongen.Hvis baksiden av sjablongen brukes, øker størrelsen på matriseproteinøyene på grunn av retningen på laserskjæringen. Mens du bruker baksiden av sjablongen ikke signifikant påvirke bredden av rektangulære mønstre, høyden betydelig økt fører til en reduksjon i det tiltenkte sideforholdet. Sjablongbasert mønster ble brukt på silisium elastomer substrater.De mønstrede kardiomyocytter på silisium elastomer substrater ble visualisert ved immunocytochemistry av hjertetroponin T ved lav forstørrelse og ved sarcomeric protein alfa-actinin ved høy forstørrelse. Den sjablongbaserte mønsteret ble også brukt på mønster to kardiomyocytter side om side på hydrogeler med forskjellige stivheter. Oppdagelsen av menneskeindusert pluripotente stamceller og tilsvarende differensieringsprotokoller har gjort dette til en ideell in vitro menneskelig modell for å studere onkogenese og patogenese.En stor begrensning av bruk av IPS-systemet er imidlertid fraværet av struktur til mikromiljøet som har spesiell biokjemisk sammensetning og stivhet for å samhandle med celler. Mønsteret kan kombineres med trekkraft kraft mikroskopi og immunocytochemistry analyser for å karakterisere strukturen og funksjonen til kardiomyocytter. Analyse av IPS-avledede celletyper, i vårt tilfelle kardiomyocyte, i en mer fysiologisk morfologi åpner muligheter til å studere utfordrende kardiomyocytter i kulturrett.Teknikken kan også brukes på mange andre systemer som og høyinnhold screening plater. Formen og underlaget kan lett justeres til applikasjonen.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos

Isolering og karakterisering av enkeltceller fra sebrafisk embryo

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been ...

Epigenetic Conversion as a Safe and Simple Method to Obtain Insulin-secreting Cells from Adult Skin Fibroblasts

Epigenetisk konvertering som en trygg og enkel metode for å skaffe insulin-sekresjon celler fra voksne hudfibroblaster

Regenerative medicine requires new, fully functional cells that are delivered to patients in order to repair degenerated or damaged tissues. When such ...

Stencil Micropatterning of Human Pluripotent Stem Cells for Probing Spatial Organization of Differentiation Fates

Stencil Micropatterning of Human Pluripotent stamceller for undersøkelser romlige organiseringen av differensiering Fates

Human pluripotent stem cells (hPSCs), including embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells, have the intrinsic ability to differentiate into ...

Imaging Cleared Embryonic and Postnatal Hearts at Single-cell Resolution

Diagnostikk klarert Embryonic og barsel hjerter på Single-celle Oppløsning

Single clonal tracing and analysis at the whole-heart level can determine cardiac progenitor cell behavior and differentiation during cardiac development, ...

A Simple Method to Identify Kinases That Regulate Embryonic Stem Cell Pluripotency by High-throughput Inhibitor Screening

En enkel metode for å identifisere kinaser som regulerer embryonisk stamcellepluripotens ved høy gjennomstrømningsinhibitor screening

Embryonic stem cells (ESCs) can self-renew or differentiate into all cell types, a phenomenon known as pluripotency. Distinct pluripotent states have been ...

High-resolution Episcopic Microscopy (HREM) - Simple and Robust Protocols for Processing and Visualizing Organic Materials

High-resolution Episcopic Microscopy HREM - Simple and Robust Protocols for Processing and Visualizing Organic Materials

Høyoppløselig episkopisk mikroskopi (HREM) - Enkle og robuste protokoller for behandling og visualisering av organiske materialer

We provide simple protocols for generating digital volume data with the high-resolution episcopic microscopy (HREM) method. HREM is capable of imaging ...

Single-Cell Quantification of Protein Degradation Rates by Time-Lapse Fluorescence Microscopy in Adherent Cell Culture

Encellede kvantifisering av Protein degradering av Time-Lapse fluorescens mikroskopi i tilhenger cellekultur

Proteins are in a dynamic state of synthesis and degradation and their half-lives can be adjusted under various circumstances. However, most commonly used ...

Clonal Analysis of Embryonic Hematopoietic Stem Cell Precursors Using Single Cell Index Sorting Combined with Endothelial Cell Niche Co-culture

Klonal analyse av embryonale stamcelleforskningen blodkreft forløpere bruke enkeltcelle indeks sortering kombinert med endotelial celle nisje co kultur

The ability to study hematopoietic stem cell (HSC) genesis during embryonic development has been limited by the rarity of HSC precursors in the early ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

Encellede Photoconversion i levende intakt sebrafisk

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

Single-cell Transcriptomic Analyses of Mouse Pancreatic Endocrine Cells

Encellede Transcriptomic analyser av musen bukspyttkjertelen endokrine celler

Pancreatic endocrine cells, which are clustered in islets, regulate blood glucose stability and energy metabolism. The distinct cell types in islets, ...