Name: simple lithography-free single cell micropatterning using laser-cut stencils
Uploaded: 2020-04-03T13:00:00
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Este trabalho foi apoiado por bolsa de pós-doutorado do Stanford Child Health Research Institute (CHRI) e National Institute of Health (1F32HL142205-01) para S.L, o NIH Office of Director's Pioneer Award (LM012179-03), o American Heart Association Established Investigator Award (17EIA3410923), o Stanford Cardiovascular Institute, a Hoffmann and Schroepfer Foundation, e a Divisão de Medicina Cardiovascular de Stanford, Departamento de Medicina da S.M.W. , prêmios do Instituto Nacional de Saúde (UG3 TR002588, P01 HL141084, R01 HL126527, R01 HL113006, R01 HL123968) e Programa de Pesquisa de Doenças Relacionadas ao Tabaco (TRDRP 27IR-0012) para J.C.W, o American Heart Association (AHA) Postdoctoral Fellowship Award (18POST34030106) para H.Y, e a bolsa Hengstberger para T.S. Agradecemos ao Dr. Andrew Olsen do Serviço de Microscopia da Neurociência de Stanford pelo apoio à imagem confocal do hiPSC-CM micropadronizado. Agradecemos a H.Y. pelo primeiro desenho de estêncil, fabricação, micropadronização de células únicas de iPSC-CM na cobertura revestida de hidrogel poliacrilamida, e imagem confocal preliminar da estrutura sarcomere de células únicas micropadronizadas iPSC-CMs.

1. Fabricação de estêncil à base de poliimida padrão negativo
<ol><li>Gerar um padrão(Figura 2A)no formato .dxf usando software de design auxiliado por computador (por exemplo, AutoCAD, SolidWorks, Onshape, Adobe Illustrator).<ol>
<li>Gerar um círculo (diâmetro = 22 mm) para delinear a borda do estêncil.</li>
		<li>Desenhe uma forma sólida ou o padrão desejado.</li>
		<li>Inclua uma letra quiral (por exemplo, R) para marcar o lado frontal dos estêncil. NOTA: Como exemplo, um...

<ol>
	<li>Burridge, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+Defined+and+Small+Molecule-Based+Generation+of+Human+Cardiomyocytes.">Chemically Defined and Small Molecule-Based Generation of Human Cardiomyocytes.</a> Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).</li><li>Sayed, N., Liu, C., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translation+of+Human-Induced+Pluripotent+Stem+Cells:+From+Clinical+Trial+in+a+Dish+to+Precision+Medicine.">Translation of Human-Induced Pluripotent Stem Cells: From Clinical Trial in a Dish to Precision Medicine.</a> Journal of the American College of Cardiology. 67 (18), 2161-2176 (2016).</li><li>Ribeiro, A. J. 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S., Myers, K. A., Gardel, M. L., Waterman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stiffness-controlled+three-dimensional+extracellular+matrices+for+high-resolution+imaging+of+cell+behavior.">Stiffness-controlled three-dimensional extracellular matrices for high-resolution imaging of cell behavior.</a> Nature Protocols. 7 (11), 2056-2066 (2012).</li><li>Lee, S., Stanton, A. E., Tong, X., Yang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogels+with+enhanced+protein+conjugation+efficiency+reveal+stiffness-induced+YAP+localization+in+stem+cells+depends+on+biochemical+cues.">Hydrogels with enhanced protein conjugation efficiency reveal stiffness-induced YAP localization in stem cells depends on biochemical cues.</a> Biomaterials. 202, 26-34 (2019).</li><li>Th&#233;ry, M., P&#233;pin, A., Dressaire, E., Chen, Y., Bornens, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+distribution+of+stress+fibres+in+response+to+the+geometry+of+the+adhesive+environment.">Cell distribution of stress fibres in response to the geometry of the adhesive environment.</a> Cell Motility. 63 (6), 341-355 (2006).</li><li>Kilian, K. A., Bugarija, B., Lahn, B. T., Mrksich, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geometric+cues+for+directing+the+differentiation+of+mesenchymal+stem+cells.">Geometric cues for directing the differentiation of mesenchymal stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (11), 4872-4877 (2010).</li></ol>

Descrevemos um método de micropadronização baseado em estêncil livre de litografia que permite padronização eficaz de células aderentes. Neste protocolo, demonstramos a padronização de hiPSC-CMs em diferentes relações comprimento-largura por micropadronização de ilhas de proteína de membrana de porão em hidrogéis de poliacrilamida com rigidez tecidual fisiologicamente ou patologicamente relevante ou substratos de elastômeros à base de silício. Este método é relativamente simples e altamente acessíve...

O advento dos hiPSCs e o subsequente desenvolvimento de protocolos para sua diferenciação direcionada em diferentes tipos celulares permitiram estudar o desenvolvimento e a doença em nível molecular e específico do paciente, especificamente utilizando cardiomiócitos iPSC derivados do paciente (iPSC-CMs) para modelar cardiomiopatias1,2. No entanto, uma grande limitação ao estudo do desenvolvimento e fisiologia utilizando o sistema iPSC e outros modelos in vitro é a ausência de um microambiente estruturado. In situ, as células são submetidas às restrições da matriz extracelular (ECM), bem como das células vizinhas. A composição bioquímica particular e a rigidez desses microambientes ditam a distribuição espacial das células, bem como os fatores disponíveis para o engajamento na adesão celular. Isso, por sua vez, influencia caminhos de sinalização intracelular, expressão genética e determinação do destino celular. Por exemplo, o iPSC-CM micropadronizado em forma de haste adulta tem uma capacidade de contração significativamente melhor, fluxo de cálcio, organização mitocondrial, eletrofisiologia e formação transversal-túbula3. Assim, as propriedades do microambiente são integrais na regulação das funções celulares.
As técnicas anteriores de micropadronização se baseavam fortemente na fotolitografia (Figura 1A). Nesta técnica, uma camada de polímero fotossensível, ou fotoresist, é girada sobre um substrato plano da solução para formar uma película fina de cerca de 1 μm de espessura. Em seguida, a luz ultravioleta (UV) é aplicada na fotoresiste através de uma máscara contendo o padrão desejado. A exposição à luz ultravioleta (UV) altera quimicamente a fotoresiste modificando sua solubilidade em sua respectiva solução de desenvolvedor, transferindo o padrão desejado da máscara para o substrato. Muitos métodos de micropadronização incorporam a fotolitografia, pois confere nanômetro ao controle de nível de micrômetro sobre o design dos padrões celulares. No entanto, o giro da fotoresistência é altamente sensível às impurezas, porque as menores partículas de poeira interromperão a propagação da solução em um filme fino. A fotolitografia deve, portanto, ser realizada em instalações não contaminadas, que são caras para manter e requerem especial perícia para utilizar. Além disso, os produtos químicos usados na fotolitografia são muitas vezes tóxicos para as células e podem desnaturar biomoléculas importantes. Assim, a fotolitografia coloca obstáculos significativos à fabricação de micropadrões para aplicações biológicas convenientes.
Em 1994, Whitesides e colegas4 superaram alguns dos desafios associados à fotolitografia ao pioneirismo de uma coleção de técnicas chamada litografia suave. Na litografia macia, uma superfície microestruturada feita com polidimetilsiloxano (PDMS), um material transparente, semelhante à borracha, é usada para gerar um padrão de proteínas ECM4. Técnicas litográficas macias comuns incluem impressão de microcontato e padronização microfluida. Na impressão por microcontato, atualmente o método litográfico macio mais popular, um selo PDMS revestido com proteínas ECM transfere o material para uma superfície nas áreas contatadas pelo selo(Figura 1B). Na padronização microfluida, as microestruturas são projetadas em uma superfície PDMS de tal forma que quando o selo é pressionado para um substrato, uma rede de microcanais, através da qual os fluidos podem ser entregues às áreas desejadas, é criada (Figura 1C)5. A litografia suave oferece vários benefícios sobre a fotolitografia. Uma vez que um wafer mestre é microfabricado, os selos PDMS podem ser facilmente replicados sem maior emprego de instalações de quarto limpo. Além disso, a ausência de solventes orgânicos no processo de litografia macia permite a utilização de materiais poliméricos como o poliestireno, normalmente utilizado na cultura celular. Finalmente, a micropadronização usando métodos litográficos macios não se restringe a superfícies planas. Assim, a litografia suave aumenta a acessibilidade e funcionalidade da fabricação de micropadrões sobre a fotolitografia6. No entanto, a litografia suave tem desvantagens significativas. Por exemplo, um passo inicial de gravação, usando fotolitografia, ainda é necessário para microfabricar o selo. Além disso, a micropadronização utilizando um selo PDMS está sujeita a variações na qualidade da transferência de proteínas para o substrato6. Evitar essas discrepâncias requer otimização e consistência na pressão aplicada ao selo PDMS durante a transferência de proteínas, caso contrário, a deformação e distorção dos tamanhos de recurso dos moldes PDMS podem ocorrer6. Há também uma grande preocupação em usar repetidamente o PDMS devido à absorção de pequenas moléculas7.
Para evitar o uso de selos de fotolitografia macia e PDMS, descrevemos um método de micropadronização de células únicas sem litografia, baseado em estêncil, livre de litografia, que supera muitos dos obstáculos associados à fotolitografia e à litografia suave. Neste método, um hidrogel de poliacrilamida é usado como substrato para incorporação de proteína stencil à base de ECM, permitindo o revestimento seletivo de hº-CMs únicos. Esta técnica é altamente compatível com materiais poliméricos usados em condições clássicas de cultura celular. Além disso, com a limpeza e manutenção adequadas, os estêncil são reutilizáveis e resistentes à degradação e absorção de proteínas durante o processo de microfabricação. Finalmente, o processo de padronização é tecnicamente robusto, barato, personalizável e acessível àqueles sem habilidades especializadas em bioengenharia. Esta técnica de micropadronização baseada em estêncil tem sido amplamente utilizada em nossas publicações recentes modelando cardiomiopatias variadas8,9,10.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Aminoethyl methacrylate hydrochloride (powder)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>516155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide solution 40% (solution)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A-4058-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bench UV lamp 365 nm</td>
			<td>UVP</td>
			<td>UVP 95-0042-07, XX-15L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioFlex culture plate</td>
			<td>FLEXCELL INTERNATIONAL CORPORATION, Burlington, NC</td>
			<td></td>
			<td>6-well plate with silicon elastomer substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bis-acrylamide solution 2% (solution)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1533-25mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning cover glasses square, No. 2, W &#215; L 22 mm &#215; 22 mm</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CLS285522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Irgacure (2-Hydroxy-4&#8242;-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone) (powder)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>410896</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td>basement membrane matrix protein solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl sulfoxide, 99.7+%, Extra Dry, AcroSeal, ACROS Organics</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>326881000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex (13mm) filter unit with Durapore Membrane</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGV013SL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millipore 50mL Steriflip (0.22 &#181;m)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SCGP00525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stencils</td>
			<td>Potomac</td>
			<td>custom design</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfo-SANPAH</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>22589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Select 10x</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A1217702</td>
			<td>Enzyme used for stencil cleaning</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simple lithography-free single cell micropatterning using laser-cut stencils

As técnicas de micropadronização têm sido amplamente utilizadas na biologia celular para estudar efeitos do controle da forma e do tamanho das células na determinação do destino celular na resolução de uma única célula. As técnicas atuais de micropadronização de células únicas de última geração envolvem litografia suave e impressão de micro-contato, que é uma tecnologia poderosa, mas requer habilidades de engenharia treinadas e certo suporte de instalações na microfabricação. Essas limitações requerem uma técnica mais acessível. Aqui, descrevemos um método alternativo sem litografia: padronização de células simples baseadas em estêncil. Fornecemos procedimentos passo a passo, incluindo design de estêncil, fabricação de hidrogel de poliacrilamida, incorporação de proteína à base de estêncil e revestimento celular e cultura. Este método simples pode ser usado para padronizar uma matriz de até 2.000 células. Demonstramos a padronização de cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos únicos (hiPSC) com formas celulares distintas, de um quadrado de 1:1 a um retângulo adulto semelhante a cardiomiócitos de 7:1. Esta padronização de células únicas baseada em estêncil é livre de litografia, tecnicamente robusta, conveniente, barata e, mais importante, acessível àqueles com um fundo de bioengenharia limitado.

Foi demonstrada a fabricação de estêncil contendo uma matriz de quadrados ou retângulos (Figura 4A). Seguindo este protocolo, obtivemos ilhas de proteína matricial padronizadas (Figura 4B e Figura 5A) e células(Figura 4C). A concentração de solução de proteína matricial subótima levou a uma padronização subótima(Figura 5B). É fundamental usar a parte frontal...

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Simple Lithography-Free Single Cell Micropatterning using Laser-Cut Stencils

Este protocolo introduz um método de micropadronização livre de litografia que é simples e acessível para aqueles com um fundo de bioengenharia limitado. Este método utiliza estêncil personalizado de corte a laser para micropadrão proteínas de matriz extracelular em uma forma de interesse para modulação de morfologias celulares. O procedimento de micropadronização é demonstrado usando cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidas.

Micropadronização simples de células únicas sem litografia usando estêncil cortado a laser

Micropatterning techniques have been widely used in cell biology to study effects of controlling cell shape and size on cell fate determination at single ...

Descreveremos um método de micropatteria unicelular sem litografia à base de estêncil que supera muitos obstáculos associados à fotolitografia e à litografia macia. Os estêncil são reutilizáveis e o processo é barato e personalizável. Este método abriu um novo caminho para pesquisadores não-engenheiros estudarem a forma celular e a mecanotransdução induzida pela área em diversos contextos fisiológicos e patológicos.Além disso, este protocolo permite a micropatterning de milhares de células que podem ser utilizadas para rastreamento de medicamentos de alto rendimento e modelagem de doenças em um prato. A demonstração visual facilitará a implantação de duas etapas cruciais: o desprendimento do deslizamento de cobertura do hidrogel, secando hidrogel suficientemente antes de colocar o estêncil. Prepare a solução de hidrogel de poliacrilamida em um novo tubo de centrífuga de propileno de 50 mililitros, conforme descrito no manuscrito.Em seguida, para preparar a solução 5% fotoinitiador, dissolva os ingredientes em 700 microliters de 100% etanol. Os ingredientes não são solúveis em água, por isso certifique-se de dissolver totalmente por vórtice. Adicione 300 microliters de PBS para um volume final de um mililitro.Trabalhando em gelo, diluir a solução de proteína de matriz de membrana do porão com mídia DMEM F12 gelada ou 1X PBS para a relação de diluição otimizada. Mantenha o gelo para uso posterior. Ao trabalhar com matriz de membrana de porão, certifique-se de sempre trabalhar no gelo e usar soluções geladas em pontas e tubos de pipeta refrigerados.Coloque uma lâmpada de banco UV em um capô de segurança biológica. Em seguida, coloque os filmes de parafina esterilizados preparados anteriormente. Se os filmes de parafina não estiverem completamente secos, use um sistema de aspiração de vácuo para remover qualquer líquido residual.Usando fórceps autoclavados, coloque seis tampas autoclaved no filme de parafina seis em cada placa de Petri. Para preparar a solução final de poliacrilamida transversal UV, diluir a solução fotoinitiadora com a solução precursora do hidrogel de poliacrilamida. Esterilize a solução usando uma unidade de filtro de 50 mililitros com um tamanho de poro de 0,22 micrômetro.Em seguida, distribua 200 microliters de solução final de poliacrilamida cruzada UV em cada uma das seis tampas de vidro nas placas de Petri. Usando fórceps autoclavados, cubra cuidadosamente cada deslizamento de cobertura com um segundo deslizamento de tampa prendendo uma camada da solução entre as duas tampas. Coloque as placas de Petri contendo as tampas sob a lâmpada do banco UV com a tampa desfetada.A cobertura do white paper na superfície não branca é importante para minimizar a perda de intensidade UV. Para proteção contra radiação UV, cubra a lâmpada com papel alumínio. Fotopolimerizar os hidrânis de poliacrilamida por cinco minutos.Use uma lâmina de barbear para separar cuidadosamente cada par de tampas. Encha o reservatório contendo seis compostos de deslizamento de hidrogel com PBS. Depois de enxaguar por cinco minutos, devolva os compósitos de deslizamento de hidrogel para o filme de parafina na placa de Petri.Obtenha um tubo de Sulfo-SANPAH a partir do armazenamento a menos 80 graus Celsius. Adicione 1.200 microliters de PBS pré-refrigerado ao tubo e misture por pipetação para cima e para baixo. Dispense 200 microliters do Sulfo-SANPAH diluído no filme de parafina na placa de Petri.Coloque um composto de deslizamento de hidrogel sobre o Sulfo-SANPAH com o hidrogel entrando em contato com o Sulfo-SANPAH. Em seguida, coloque os compostos de deslizamento de hidrogel sob a lâmpada UV e exponha-os por cinco minutos para ativar o Sulfo-SANPAH. Se o Sulfo-SANPAH passar de laranja para marrom indicando ativação e incorporação bem sucedidas, proceda para os próximos passos dentro de 10 minutos.Reabastecer o reservatório de polipropileno descartável com PBS fresco. Transfira os compostos de deslizamento de hidrogel ativados para o reservatório e enxágue-os brevemente para remover Sulfo-SANPAH desvinculado. Coloque os compostos de deslizamento de hidrogel no filme de parafina nas placas de Petri e cuidadosamente dab-los com lenços estéreis sem fiapos.Coloque um estêncil em cima de cada composto de cobertura de hidrogel. Para garantir uma vedação apertada entre o estêncil e o composto, remova o excesso de umidade, esfregando com lenços de fiapos autoclavados. Dispense cuidadosamente a solução de proteína de matriz de membrana diluída colocando 200 microliters em cima de cada composto de deslizamento de hidrogel.Incubar as construções durante a noite a 37 graus Celsius. No dia seguinte, transfira os compósitos para uma placa de seis poços. Uma vedação apertada entre hidrogel e estêncil pode ser facilmente validada observando se a solução de proteína matricial foi mantida em cima do estêncil.A não formação de uma vedação apertada leva ao rápido vazamento da solução proteica através dos orifícios. Imerque totalmente os compósitos na PBS. Usando pinças autoclavadas, desprende cuidadosamente os estêncil dos hidrogéis sem rasgar os hidrogéis.Retire o PBS dos poços e reabasteça os poços com DMEM. Incubar a placa durante a noite a 37 graus Celsius. Depois de remover a placa da incubadora, examine o DMEM.Se o DMEM não estiver nublado, os compostos de deslizamento de cobertura de hidrogel estarão prontos para serem usados para chapeamento celular. Estêncil foram fabricados contendo matrizes de quadrados e retângulos. Substratos de hidrogel micropattered foram criados a partir dos estêncil e ilhas de proteína matricial foram obtidos.Também foram obtidas ilhas celulares. Por exemplo, ilhas de cardiomiócitos pluripotentes induzidos pelo homem. A concentração de proteínas matricial desempenhou um papel essencial na geração de padrões adequados.Uma concentração ideal levou a uma distribuição homogênea de proteínas. Concentrações de solução de proteínas de matriz subótida levaram à padronização subótima. É fundamental usar a parte frontal do estêncil.Se o lado de trás do estêncil for usado, o tamanho das ilhas de proteína matricial aumenta devido à direção do corte a laser. Embora o uso do lado traseiro do estêncil não tenha afetado significativamente a largura dos padrões retangulares, a altura aumentou significativamente levando a uma redução na proporção pretendida. A padronização baseada em estêncil foi aplicada a substratos de elastômero de silício.Os cardiomiócitos padronizados nos substratos de elastômero de silício foram visualizados por imunocitoquímica de troponina cardíaca T em baixa ampliação e por proteína sarcomerica alfa-actinina em alta ampliação. A padronização baseada em estêncil também foi aplicada ao padrão dois cardiomiócitos lado a lado em hidrogéis com rigidezs diferentes. A descoberta de células-tronco pluripotentes induzidas pelo homem e protocolos de diferenciação correspondentes tornou este um modelo humano in vitro ideal para estudar oncogênese e patogênese.No entanto, uma grande limitação do uso do sistema IPS é a ausência de estrutura para o microambiente que tem composição bioquímica particular e rigidez para interagir com as células. A padronização pode ser combinada com microscopia de força de tração e ensaios imunocitoquímicos para caracterizar a estrutura e função dos cardiomiócitos. A análise dos tipos de células derivadas do IPS, no nosso caso cardiomiócito, em uma morfologia mais fisiológica abre oportunidades para estudar cardiomiócitos desafiadores no prato de cultura.A técnica também pode ser aplicada a muitos outros sistemas, como placas de triagem de alto conteúdo. A forma e o substrato podem ser prontamente ajustados à aplicação.

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