Name: simple lithography-free single cell micropatterning using laser-cut stencils
Uploaded: 2020-04-03T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Simple Lithography-Free Single Cell Micropatterning using Laser-Cut Stencils at JoVE.com

Эта работа была поддержана постдокторской стипендией от Стэнфордского научно-исследовательского института здоровья детей (CHRI) и Национального института здравоохранения (1F32HL142205-01) в S.L. NIH Офис Директора Pioneer Award (LM012179-03), Американская ассоциация сердца учрежденных следователя премии (17EIA33410923), Стэнфордский сердечно-сосудистый институт, Хоффманн и Шрёпфер Фонда, и Стэнфордский отдел сердечно-сосудистой медицины, Департамент медицины S.M.W , Награды От Национального института здравоохранения (UG3 TR002588, P01 HL141084, R01 HL126527, R01 HL113006, R01 HL123968) и программа исследований заболеваний, связанных с табаком (TRDRP 27IR-0012) в J.C.W, Американская ассоциация сердца (AHA) Постдокторская стипендиальная премия (18POST3030106) в H.Y. Мы благодарим д-ра Эндрю Олсена из Стэнфордской службы микроскопии неврологии за поддержку конфокальной визуализации микрошаблона hiPSC-CM. Мы благодарим H.Y. за первый дизайн трафарета, изготовление, одноклеточный микропаттерн iPSC-CM на полиакриламидном гидрогеле с покрытием крышкой, а также предварительное конфоковое изображение саркомерной структуры одноклеточных микрошаблонов iPSC-CMs.

1. Изготовление отрицательного шаблона полиимидных трафаретов
<ol><li>Создайте шаблон(рисунок 2A) в формате .dxf с помощью программного обеспечения для проектирования с помощью компьютера (например, AutoCAD, SolidWorks, Onshape, Adobe Illustrator).<ol>
<li>Создайте круг (диаметр ю 22 мм) для разгранич?...

<ol>
	<li>Burridge, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+Defined+and+Small+Molecule-Based+Generation+of+Human+Cardiomyocytes.">Chemically Defined and Small Molecule-Based Generation of Human Cardiomyocytes.</a> Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).</li><li>Sayed, N., Liu, C., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translation+of+Human-Induced+Pluripotent+Stem+Cells:+From+Clinical+Trial+in+a+Dish+to+Precision+Medicine.">Translation of Human-Induced Pluripotent Stem Cells: From Clinical Trial in a Dish to Precision Medicine.</a> Journal of the American College of Cardiology. 67 (18), 2161-2176 (2016).</li><li>Ribeiro, A. J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contractility+of+single+cardiomyocytes+differentiated+from+pluripotent+stem+cells+depends+on+physiological+shape+and+substrate+stiffness.">Contractility of single cardiomyocytes differentiated from pluripotent stem cells depends on physiological shape and substrate stiffness.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (41), 12705-12710 (2015).</li><li>Kumar, A., Biebuyck, H. A., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterning+Self-Assembled+Monolayers:+Applications+in+Materials+Science.">Patterning Self-Assembled Monolayers: Applications in Materials Science.</a> Langmuir. 10 (5), 1498-1511 (1994).</li><li>Wilbur, J. L., Kumar, A., Kim, E., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfabrication+by+microcontact+printing+of+self-assembled+monolayers.">Microfabrication by microcontact printing of self-assembled monolayers.</a> Advanced Materials. 6 (7-8), 600-604 (1994).</li><li>Th&#233;ry, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micropatterning+as+a+tool+to+decipher+cell+morphogenesis+and+functions.">Micropatterning as a tool to decipher cell morphogenesis and functions.</a> Journal of Cell Science. 123 (24), 4201-4213 (2010).</li><li>Toepke, M. W., Beebe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PDMS+absorption+of+small+molecules+and+consequences+in+microfluidic+applications.">PDMS absorption of small molecules and consequences in microfluidic applications.</a> Lab on a Chip. 6 (12), 1484-1486 (2006).</li><li>Seeger, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Premature+Termination+Codon+Mutation+in+MYBPC3+Causes+Hypertrophic+Cardiomyopathy+via+Chronic+Activation+of+Nonsense-Mediated+Decay.">A Premature Termination Codon Mutation in MYBPC3 Causes Hypertrophic Cardiomyopathy via Chronic Activation of Nonsense-Mediated Decay.</a> Circulation. 139 (6), 799-811 (2019).</li><li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+PDGF+pathway+links+LMNA+mutation+to+dilated+cardiomyopathy.">Activation of PDGF pathway links LMNA mutation to dilated cardiomyopathy.</a> Nature. 572 (7769), 335-340 (2019).</li><li>Wu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+diastolic+dysfunction+in+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+from+hypertrophic+cardiomyopathy+patients.">Modelling diastolic dysfunction in induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes from hypertrophic cardiomyopathy patients.</a> European Heart Journal. 40 (45), 3685-3695 (2019).</li><li>Fischer, R. S., Myers, K. A., Gardel, M. L., Waterman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stiffness-controlled+three-dimensional+extracellular+matrices+for+high-resolution+imaging+of+cell+behavior.">Stiffness-controlled three-dimensional extracellular matrices for high-resolution imaging of cell behavior.</a> Nature Protocols. 7 (11), 2056-2066 (2012).</li><li>Lee, S., Stanton, A. E., Tong, X., Yang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogels+with+enhanced+protein+conjugation+efficiency+reveal+stiffness-induced+YAP+localization+in+stem+cells+depends+on+biochemical+cues.">Hydrogels with enhanced protein conjugation efficiency reveal stiffness-induced YAP localization in stem cells depends on biochemical cues.</a> Biomaterials. 202, 26-34 (2019).</li><li>Th&#233;ry, M., P&#233;pin, A., Dressaire, E., Chen, Y., Bornens, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+distribution+of+stress+fibres+in+response+to+the+geometry+of+the+adhesive+environment.">Cell distribution of stress fibres in response to the geometry of the adhesive environment.</a> Cell Motility. 63 (6), 341-355 (2006).</li><li>Kilian, K. A., Bugarija, B., Lahn, B. T., Mrksich, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geometric+cues+for+directing+the+differentiation+of+mesenchymal+stem+cells.">Geometric cues for directing the differentiation of mesenchymal stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (11), 4872-4877 (2010).</li></ol>

Мы описываем метод микропаттернирования на основе литографии, который позволяет эффективно узорить клетки адептов. В этом протоколе мы демонстрируем узорство hiPSC-CMs в различных соотношений длины и ширины путем микропаттернинга подвальной мембранной матрицы белковых островов на гидр?...

Появление hiPSCs и последующее развитие протоколов для их направленной дифференциации на различные типы клеток позволили изучить развитие и болезни на молекулярном и пациент-специфическом уровне, в частности, с использованием кардиомиоцитов iPSC (iPSC-CMs) для моделирования кардиомиопатий1,2. Однако основным ограничением для изучения развития и физиологии с использованием системы iPSC и других моделей in vitro является отсутствие структурированной микросреды. На месте клетки подвергаются ограничениям внеклеточной матрицы (ECM), а также соседних клеток. Особый биохимический состав и жесткость этих микросред диктуют пространственное распределение клеток, а также факторы, доступные для участия в стеге клеточной печении. Это, в свою очередь, влияет на внутриклеточные сигнальные пути, экспрессию генов и определение судьбы клеток. Например, микропаттернированный iPSC-CM в взрослой форме стержня имеет значительно лучшую сократительную способность, кальцийпоток, митохондриальную организацию, электрофизиологию и поперечное образование3. Таким образом, свойства микросреды являются неотъемлемой частью регулирования клеточных функций.
Предыдущие методы микропаттернинга в значительной степени опирались на фотолитографию(рисунок 1A). В этом методе, слой фоточувствительного полимера, или photoresist, вращается на плоском субстрате из раствора, чтобы сформировать тонкую пленку толщиной около 1 мкм. Далее ультрафиолетовый (УФ) свет наносится на фотоустойчивость через маску, содержащую желаемый узор. Воздействие ультрафиолетового (УФ) света химически изменяет фотоустойчивость, изменяя его растворимость в соответствующем решении разработчика, перенося желаемый узор из маски на субстрат. Многие методы микропаттернов включают фотолитографию, поскольку она наделяет нанометр микрометровым контролем над конструкцией клеточных узоров. Тем не менее, спиннинг фоторезиста очень чувствителен к примесям, так как мельчайшие частицы пыли нарушит распространение раствора в тонкую пленку. Поэтому фотолитография должна осуществляться на незагрязненных объектах, которые являются дорогостоящими в обслуживании и требуют специальных знаний для использования. Кроме того, химические вещества, используемые в фотолитографии часто токсичны для клеток и могут денатурировать важные биомолекулы. Таким образом, фотолитография создает значительные препятствия для изготовления микрошаблонов для удобного биологического применения.
В 1994 году Whitesides и его коллеги4 преодолели некоторые проблемы, связанные с фотолитографией, впервые в ней собрал коллекцию методов, называемых мягкой литографией. В мягкой литографии, микроструктурированная поверхность сделанная с polydimethylsiloxane (PDMS), прозрачным, резиноподобным материалом, использована для того чтобы произвести картину протеинов ECM4. Общие мягкие литографические методы включают микроконтактную печать и микрофлюидный узор. В микроконтактной печати, в настоящее время наиболее популярным мягким литографическим методом, штамп PDMS, покрытый белками ECM, передает материал на поверхность в районах, с которыми контактирует марка(рисунок 1B). При микрофлюидном узоре микроструктуры проектируются на поверхности PDMS таким образом, что при нажатии на подтекст штамп создается сеть микроканалов, через которые жидкости могут доставляться в нужные области (рисунок 1С)5. Мягкая литография предлагает несколько преимуществ по сравнению с фотолитографией. После того, как мастер пластины microfabricated, PDMS марки могут быть легко воспроизведены без дальнейшего трудоустройства чистых помещений. Кроме того, отсутствие органических растворителей в процессе мягкой литографии позволяет использовать полимерные материалы, такие как полистирол, обычно используемые в клеточной культуре. Наконец, микропаттернирование с использованием мягких литографических методов не ограничивается плоскими поверхностями. Таким образом, мягкая литография повышает доступность и функциональность изготовления микрошаблона по сравнению с фотолитографией6. Однако мягкая литография имеет существенные недостатки. Например, начальный шаг травления, с помощью фотолитографии, по-прежнему требуется для микрофабриката марки. Кроме того, микропаттернирование с использованием штампа PDMS подвержено изменениям в качестве переноса белка на субстрат6. Избежание этих расхождений требует оптимизации и согласованности давления, применяемого к штампу PDMS во время переноса белка, в противном случае деформация и искажение размеров функций форм PDMS может произойти6. Существует также серьезная озабоченность неоднократно госиспользованием PDMS из-за поглощения малых молекул7.
Чтобы избежать использования мягкой фотолитографии и штампов PDMS, мы описываем метод микропатии на основе трафаретных элементов, свободных от литографических одноклеточных элементов, который преодолевает многие препятствия, связанные с фотолитографией и мягкой литографией. В этом методе, гидрогель полиакриламид используется в качестве субстрата для ввода белка eCM на основе трафаретов, что позволяет селективное покрытие одного hiPSC-CMs. Этот метод очень совместим с полимерными материалами, используемыми в классических условиях клеточной культуры. Кроме того, при надлежащей очистке и обслуживании трафареты многоразовые и устойчивы к деградации и поглощению белка в процессе микрофабрикации. Наконец, процесс шаблонирования является технически надежным, недорогим, настраиваемым и доступным для тех, кто не имеет специализированных навыков биоинженерии. Этот трафарет на основе микропаттернинга техника была широко использована в наших последних публикациях моделирования разнообразных кардиомиопатий8,9,10.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Aminoethyl methacrylate hydrochloride (powder)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>516155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide solution 40% (solution)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A-4058-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bench UV lamp 365 nm</td>
			<td>UVP</td>
			<td>UVP 95-0042-07, XX-15L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioFlex culture plate</td>
			<td>FLEXCELL INTERNATIONAL CORPORATION, Burlington, NC</td>
			<td></td>
			<td>6-well plate with silicon elastomer substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bis-acrylamide solution 2% (solution)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1533-25mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning cover glasses square, No. 2, W &#215; L 22 mm &#215; 22 mm</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CLS285522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Irgacure (2-Hydroxy-4&#8242;-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone) (powder)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>410896</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td>basement membrane matrix protein solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl sulfoxide, 99.7+%, Extra Dry, AcroSeal, ACROS Organics</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>326881000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex (13mm) filter unit with Durapore Membrane</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGV013SL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millipore 50mL Steriflip (0.22 &#181;m)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SCGP00525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stencils</td>
			<td>Potomac</td>
			<td>custom design</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfo-SANPAH</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>22589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Select 10x</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A1217702</td>
			<td>Enzyme used for stencil cleaning</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simple lithography-free single cell micropatterning using laser-cut stencils

Методы микрошаблонирования широко использовались в клеточной биологии для изучения влияния контроля формы и размера клеток на определение судьбы клеток при разрешении одной клетки. Современные современные методы микропаттернирования одноклеточных элементов включают мягкую литографию и микроконтактную печать, которая является мощной технологией, но требует подготовленных инженерных навыков и определенной поддержки объектов в микрофабрикации. Эти ограничения требуют более доступной техники. Здесь мы описываем простой альтернативный метод, свободный от литографии: шаблон на основе трафаретов на основе одной ячейки. Мы предоставляем пошаговые процедуры, включая конструкцию трафарета, изготовление гидрогеля полиакриламидов, внеся белковое включение на основе трафаретов, а также клеточное покрытие и культуру. Этот простой метод можно использовать для шаблона массива до 2000 ячеек. Мы демонстрируем узор кардиомиоцитов, полученных из одного человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (hiPSC) с различными формами клеток, от 1:1 квадрата до 7:1 взрослых кардиомиоцитов, как прямоугольник. Этот трафаретный одноклеточный узор без литографии, технически прочный, удобный, недорогой и, самое главное, доступный для тех, кто имеет ограниченный биоинженерный опыт.

Было продемонстрировано изготовление трафаретов, содержащих массив квадратов или прямоугольников(рисунок 4A). Следуя этому протоколу, мы получили узорчатые матричные протеиновые острова(рисунок 4B и рисунок 5A)и клетки(рисунок...

Watch this Scientific Journal Video about Simple Lithography-Free Single Cell Micropatterning using Laser-Cut Stencils at JoVE.com

Simple Lithography-Free Single Cell Micropatterning using Laser-Cut Stencils

Этот протокол вводит метод микропаттернирования без литографии, который прост и доступен для тех, кто имеет ограниченный биоинженерный опыт. Этот метод использует индивидуальные лазерно-вырезанные трафареты для микропаттернвальных внеклеточных матричных белков в форме, представляющих интерес для модуляции морфологии клеток. Процедура микропаттернирования продемонстрирована с использованием индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, полученных кардиомиоцитами.

Простой литографии-бесплатно одноклеточных микропаттернинга с помощью лазерной-Cut stencils

Micropatterning techniques have been widely used in cell biology to study effects of controlling cell shape and size on cell fate determination at single ...

Мы опишем метод литографии на основе трафаретной литографии, свободный от одноклеточных микропаттернов, который преодолевает множество препятствий, связанных с фотолитографией и мягкой литографией. Трафареты многоразовые и процесс недорогой и настраиваемый. Этот метод открыл новый путь для неинженерных исследователей для изучения формы клеток и области индуцированной механотрансдукции в различных физиологических и патологических контекстах.Кроме того, этот протокол позволяет для микропаттернирования тысяч клеток, которые могут быть использованы для высокой пропускной способности скрининга наркотиков и моделирования заболеваний в блюде. Визуальная демонстрация облегчит имплантацию двух важнейших шагов: отсоединения крышки от гидрогеля, достаточной сушки гидрогеля перед размещением трафарета. Приготовьте раствор гидрогеля полиакриламина в новой 50-миллилитровой пропиленой центрифуге, как описано в рукописи.Далее, чтобы подготовить 5%фотоинициатор раствор, растворить ингредиенты в 700 микролитров 100% этанола. Ингредиенты не растворимы в воде, поэтому не забудьте полностью раствориться вихрем. Добавьте 300 микролитров PBS для конечного объема одного миллилитра.Работая на льду, разбавляют подвальные мембраны матричным белковым раствором с ледяным холодным DMEM F12 media или 1X PBS к оптимизированному соотношению разбавления. Держите на льду для более длительного использования. При работе с мембранной матрицей подвала, убедитесь, что всегда работать на льду и использовать ледяные растворы в охлажденных пипеток советы и трубки.Поместите УФ-скамейке лампы в биологической безопасности капот. Далее поместите стерилизованные парафиновые пленки, подготовленные ранее. Если парафиновые пленки не полностью сухие, используйте вакуумную систему аспирации для удаления любой остаточной жидкости.Используя автоматические типсы, поместите шесть автоматических крышки на парафиновую пленку по шесть в каждой чашке Петри. Для подготовки УФ-перекрестного связуемого полиакриламинида окончательное решение, разбавить раствор фотоинициатора с раствором гидрогеля полиакриламинида. Стерилизовать раствор с помощью 50-миллилитрового фильтра с размером поры 0,22 микрометра.Затем выпейте 200 микролитров УФ-перекрестного полиакриламинида окончательного раствора на каждый из шести стеклянных крышки в чашках Петри. Используя автоматические типсы, тщательно накройте каждую крышку вторым крышкой, улавлив слой раствора между двумя крышками. Поместите чашки Петри, содержащие крышки, под лампу УФ-скамейки с незамечтой крышкой.Покрытие белой бумаги на небелой поверхности важно, чтобы свести к минимуму потерю УФ-интенсивности. Для защиты от УФ-излучения накройте лампу алюминиевой фольгой. Фотополимеризировать полиакриламид гидрогели в течение пяти минут.Используйте лезвие бритвы, чтобы тщательно отделить каждую пару coverslips. Заполните резервуар, содержащий шесть гидрогелевых композитов с помощью PBS. После полоскания в течение пяти минут, вернуть гидрогель coverslip композитов парафина пленки в чашке Петри.Получить трубку Сульфо-САНПА от хранения при температуре минус 80 градусов по Цельсию. Добавьте 1 200 микролитров предварительно охлажденного PBS в трубку и перемешайте с помощью трубчатых вверх и вниз. Выдавайте 200 микролитров разбавленного Сульфо-САНПА На парафиновую пленку в чашке Петри.Поместите гидрогель охватывает композит над Сульфо-САНПАХ с гидрогелем, контактным с Сульфо-САНПА. Далее поместите гидрогель coverslip композитов под УЛЬТРА лампы и подвергать их в течение пяти минут, чтобы активировать Сульфо-SANPAH. Если Sulfo-SANPAH превращается из оранжевого в коричневый, указывающий на успешную активацию и включение, переходите к следующим шагам в течение 10 минут.Пополнить одноразовый полипропиленовый резервуар свежим PBS. Перенесите активированные гидрогелевые композиты в резервуар и прополощите их на короткое время, чтобы удалить несвехую Сульфо-САНПАХ. Поместите гидрогель coverslip композитов на парафиновой пленки в чашках Петри и тщательно мазок их стерильной ворсинки без салфеток.Поместите трафарет поверх каждого гидрогеля coverslip композитных. Для обеспечения плотного уплотнения между трафаретом и композитом, удалить избыток влаги путем dabbing с автоклавом ворса без салфеток. Тщательно обойтись разбавленной мембраны мембраны белковый раствор размещения 200 микролитров на вершине каждого гидрогеля coverslip композитных.Инкубировать конструкции на ночь при 37 градусах по Цельсию. На следующий день перенесите композиты на тарелку из шести колодец. Плотное уплотнение между гидрогелем и трафаретом может быть легко проверено, наблюдая, сохранился ли раствор матричного белка поверх трафарета.Неспособность сформировать плотный уплотнитель приводит к быстрой утечке белкового раствора через отверстия. Полностью погрузите композиты в PBS. Используя автоклавный пинцет, тщательно отделяйте трафареты от гидрогелей, не разрывая гидрогели.Удалите PBS из скважин и пополнить скважины с DMEM. Инкубировать пластину на ночь при 37 градусах по Цельсию. После удаления пластины из инкубатора, изучить DMEM.Если DMEM не облачно, гидрогель coverslip композиты готовы к использованию для покрытия клеток. Стенсилы были изготовлены, содержащий массивы квадратов и прямоугольников. Из трафаретов были получены микропаттерновые гидрогелевые субстраты и острова матричного белка.Были также получены сотовые острова. Например, острова выведенных человеком плюрипотентных стволовых клеток, полученных кардиомиоцитами. Концентрация белка матрицы сыграла важную роль в создании надлежащих моделей.Оптимальная концентрация привела к однородному распределению белков. Концентрации субоптимального матричного белкового раствора привели к неоптимальной картине. Очень важно использовать переднюю сторону трафарета.При использовании задней стороны трафарета размер матричных белковых островов увеличивается за счет направления лазерной резки. При использовании задней стороны трафарета существенно не влияет на ширину прямоугольных узоров, высота значительно увеличилась, что привело к снижению предполагаемого соотношения сторон. Узор на основе стенцилей применялся к подстратам кремниевых еластомера.Узорчатые кардиомиоциты на подложке кремния были визуализированы иммуноцитохимией сердечного тропонина Т при низком увеличении и саркомерным белком альфа-актинин при высоком увеличении. Трафарет на основе шаблона был также применен к шаблону два кардиомиоцитов бок о бок на гидрогели с различными жесткости. Открытие плюрипотентных стволовых клеток и соответствующих протоколов дифференциации человека сделало эту модель человека в пробирке идеальной для изучения онкогенеза и патогенеза.Однако основным ограничением использования системы IPS является отсутствие структуры микроокнироники, которая имеет особый биохимический состав и жесткость взаимодействия с клетками. Узор можно комбинировать с микроскопией силы тяги и анализами иммуноцитохимии для характеристики структуры и функции кардиомиоцитов. Анализ типов клеток, полученных IPS, в нашем случае кардиомиоцитов, в более физиологической морфологии открывает возможности для изучения сложных кардиомиоцитов в культуре блюдо.Этот метод также может быть применен ко многим другим системам, таким как и высокое содержание скрининговых пластин. Форма и субстрат могут быть легко приспособлены к приложению.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos

Выделение и характеристика отдельных клеток из эмбрионов данио рерио

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been ...

Epigenetic Conversion as a Safe and Simple Method to Obtain Insulin-secreting Cells from Adult Skin Fibroblasts

Эпигенетическое преобразования как безопасный и простой метод получения секретирующих инсулин клеток из фибробластов кожи взрослых

Regenerative medicine requires new, fully functional cells that are delivered to patients in order to repair degenerated or damaged tissues. When such ...

Stencil Micropatterning of Human Pluripotent Stem Cells for Probing Spatial Organization of Differentiation Fates

Трафарет Micropatterning человеческих плюрипотентных стволовых клеток для исследования пространственной организации дифференциации Судеб

Human pluripotent stem cells (hPSCs), including embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells, have the intrinsic ability to differentiate into ...

Imaging Cleared Embryonic and Postnatal Hearts at Single-cell Resolution

Очищенные визуализации эмбрионального и постнатального Сердца в одноклеточные Разрешение

Single clonal tracing and analysis at the whole-heart level can determine cardiac progenitor cell behavior and differentiation during cardiac development, ...

A Simple Method to Identify Kinases That Regulate Embryonic Stem Cell Pluripotency by High-throughput Inhibitor Screening

Простой метод для идентификации киназ, которые регулируют плюрипотентность эмбриональных стволовых клеток посредством высокопроизводительного скрининга ингибиторов

Embryonic stem cells (ESCs) can self-renew or differentiate into all cell types, a phenomenon known as pluripotency. Distinct pluripotent states have been ...

High-resolution Episcopic Microscopy (HREM) - Simple and Robust Protocols for Processing and Visualizing Organic Materials

High-resolution Episcopic Microscopy HREM - Simple and Robust Protocols for Processing and Visualizing Organic Materials

Епископская микроскопия высокого разрешения (HREM) - Простые и надежные протоколы для обработки и визуализации органических материалов

We provide simple protocols for generating digital volume data with the high-resolution episcopic microscopy (HREM) method. HREM is capable of imaging ...

Single-Cell Quantification of Protein Degradation Rates by Time-Lapse Fluorescence Microscopy in Adherent Cell Culture

Количественная оценка одноклеточных темпы деградации белка с покадровой флуоресцентной микроскопии в культуре адэрентных клеток

Proteins are in a dynamic state of synthesis and degradation and their half-lives can be adjusted under various circumstances. However, most commonly used ...

Clonal Analysis of Embryonic Hematopoietic Stem Cell Precursors Using Single Cell Index Sorting Combined with Endothelial Cell Niche Co-culture

Клональный анализ прекурсоров эмбриональных гемопоэтических стволовых клеток с использованием индекса одну ячейку Сортировка в сочетании с эндотелиальных клеток нишу Сопредседатель культуры

The ability to study hematopoietic stem cell (HSC) genesis during embryonic development has been limited by the rarity of HSC precursors in the early ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

Photoconversion одноклеточных в живых нетронутыми данио рерио

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

Single-cell Transcriptomic Analyses of Mouse Pancreatic Endocrine Cells

Анализ одной ячейки транскриптомики эндокринных клеток поджелудочной железы мыши

Pancreatic endocrine cells, which are clustered in islets, regulate blood glucose stability and energy metabolism. The distinct cell types in islets, ...