Name: simple lithography-free single cell micropatterning using laser-cut stencils
Uploaded: 2020-04-03T13:00:00
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Este trabajo fue apoyado por becas postdoctorales del Stanford Child Health Research Institute (CHRI) y el Instituto Nacional de Salud (1F32HL142205-01) a S.L, el NIH Office of Director's Pioneer Award (LM012179-03), el American Heart Association Established Investigator Award (17EIA33410923), el Stanford Cardiovascular Institute, la Hoffmann and Schroepfer Foundation, y la División de Medicina Cardiovascular de Stanford, el Departamento de Medicina a S.M.W , premios del Instituto Nacional de Salud (UG3 TR002588, P01 HL141084, R01 HL126527, R01 HL113006, R01 HL123968) y el Programa de Investigación de Enfermedades Relacionadas con el Tabaco (TRDRP 27IR-0012) a J.C.W, el Premio de Becas Postdoctorales de la Asociación Americana del Corazón (AHA) (18POST34030106) a H.Y, y la beca Hengstberger a T.S. Agradecemos al Dr. Andrew Olsen, del Servicio de Microscopía de Neurociencia de Stanford, el apoyo a las imágenes confocales del hiPSC-CM micropatrónizado. Agradecemos a H.Y. por el primer diseño de plantilla, fabricación, micropatrón de célula única de iPSC-CM en el cubreobjetos recubiertos de hidrogel de poliacrilamida, y la imagen confocal preliminar de la estructura sarcomere de iPSC-CM micropatrónizados de una sola célula.

1. Fabricación de plantillas basadas en poliimida de patrón negativo
<ol><li>Genere un patrón(figura 2A) en formato .dxf utilizando software de diseño asistido por ordenador (por ejemplo, AutoCAD, SolidWorks, Onshape, Adobe Illustrator).<ol>
<li>Genere un círculo (diámetro de 22 mm) para delinear el borde de la plantilla.</li>
		<li>Dibuje una forma llena de sólido o el patrón deseado.</li>
		<li>Incluya una letra quiral (por ejemplo, R) para marcar la parte frontal de las plantill...

<ol>
	<li>Burridge, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+Defined+and+Small+Molecule-Based+Generation+of+Human+Cardiomyocytes.">Chemically Defined and Small Molecule-Based Generation of Human Cardiomyocytes.</a> Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).</li><li>Sayed, N., Liu, C., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translation+of+Human-Induced+Pluripotent+Stem+Cells:+From+Clinical+Trial+in+a+Dish+to+Precision+Medicine.">Translation of Human-Induced Pluripotent Stem Cells: From Clinical Trial in a Dish to Precision Medicine.</a> Journal of the American College of Cardiology. 67 (18), 2161-2176 (2016).</li><li>Ribeiro, A. J. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfabrication+by+microcontact+printing+of+self-assembled+monolayers.">Microfabrication by microcontact printing of self-assembled monolayers.</a> Advanced Materials. 6 (7-8), 600-604 (1994).</li><li>Th&#233;ry, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micropatterning+as+a+tool+to+decipher+cell+morphogenesis+and+functions.">Micropatterning as a tool to decipher cell morphogenesis and functions.</a> Journal of Cell Science. 123 (24), 4201-4213 (2010).</li><li>Toepke, M. W., Beebe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PDMS+absorption+of+small+molecules+and+consequences+in+microfluidic+applications.">PDMS absorption of small molecules and consequences in microfluidic applications.</a> Lab on a Chip. 6 (12), 1484-1486 (2006).</li><li>Seeger, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Premature+Termination+Codon+Mutation+in+MYBPC3+Causes+Hypertrophic+Cardiomyopathy+via+Chronic+Activation+of+Nonsense-Mediated+Decay.">A Premature Termination Codon Mutation in MYBPC3 Causes Hypertrophic Cardiomyopathy via Chronic Activation of Nonsense-Mediated Decay.</a> Circulation. 139 (6), 799-811 (2019).</li><li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+PDGF+pathway+links+LMNA+mutation+to+dilated+cardiomyopathy.">Activation of PDGF pathway links LMNA mutation to dilated cardiomyopathy.</a> Nature. 572 (7769), 335-340 (2019).</li><li>Wu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+diastolic+dysfunction+in+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+from+hypertrophic+cardiomyopathy+patients.">Modelling diastolic dysfunction in induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes from hypertrophic cardiomyopathy patients.</a> European Heart Journal. 40 (45), 3685-3695 (2019).</li><li>Fischer, R. S., Myers, K. A., Gardel, M. L., Waterman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stiffness-controlled+three-dimensional+extracellular+matrices+for+high-resolution+imaging+of+cell+behavior.">Stiffness-controlled three-dimensional extracellular matrices for high-resolution imaging of cell behavior.</a> Nature Protocols. 7 (11), 2056-2066 (2012).</li><li>Lee, S., Stanton, A. E., Tong, X., Yang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogels+with+enhanced+protein+conjugation+efficiency+reveal+stiffness-induced+YAP+localization+in+stem+cells+depends+on+biochemical+cues.">Hydrogels with enhanced protein conjugation efficiency reveal stiffness-induced YAP localization in stem cells depends on biochemical cues.</a> Biomaterials. 202, 26-34 (2019).</li><li>Th&#233;ry, M., P&#233;pin, A., Dressaire, E., Chen, Y., Bornens, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+distribution+of+stress+fibres+in+response+to+the+geometry+of+the+adhesive+environment.">Cell distribution of stress fibres in response to the geometry of the adhesive environment.</a> Cell Motility. 63 (6), 341-355 (2006).</li><li>Kilian, K. A., Bugarija, B., Lahn, B. T., Mrksich, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geometric+cues+for+directing+the+differentiation+of+mesenchymal+stem+cells.">Geometric cues for directing the differentiation of mesenchymal stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (11), 4872-4877 (2010).</li></ol>

Describimos un método de micropatrón basado en plantillas libre de litografía que permite un patrón eficaz de las células adherentes. En este protocolo, demostramos el patrón de hiPSC-CM en diferentes relaciones longitud-anchura mediante el micropatrón de islas de proteína de matriz de membrana de sótano en hidrogeles de poliacrilamida con rigidez tisular fisiológica o patológicamente relevante o sustratos de elastómero a base de silicio. Este método es relativamente simple y altamente accesible para cualqui...

La llegada de los hiPSC y el posterior desarrollo de protocolos para su diferenciación dirigida en diferentes tipos de células han hecho posible el estudio del desarrollo y la enfermedad a nivel molecular y específico del paciente, utilizando específicamente cardiomiocitos iPSC derivados del paciente (iPSC-CM) para modelar cardiomiopatías1,,2. Sin embargo, una limitación importante para estudiar el desarrollo y la fisiología utilizando el sistema iPSC y otros modelos in vitro es la ausencia de un microambiente estructurado. In situ, las celdas se someten a las restricciones de la matriz extracelular (ECM), así como de las celdas vecinas. La composición bioquímica particular y la rigidez de estos microambientes dictan la distribución espacial de las células, así como los factores disponibles para participar en la adhesión celular. Esto, a su vez, influye en las vías de señalización intracelular, la expresión génica y la determinación del destino celular. Por ejemplo, el iPSC-CM micropatrónizado en una forma de varilla similar a un adulto tiene una capacidad contráctile, flujo de calcio, organización mitocondrial, electrofisiología y formación de túbulostransversales 3. Por lo tanto, las propiedades del microambiente son integrales en la regulación de las funciones celulares.
Las técnicas anteriores de micropatrones se basaban en gran medida en la fotolitografía(Figura 1A). En esta técnica, una capa de polímero fotosensible, o fotorresistente, se hila sobre un sustrato plano de la solución para formar una película delgada de aproximadamente 1 m de espesor. A continuación, la luz ultravioleta (UV) se aplica sobre el fotorresistente a través de una máscara que contiene el patrón deseado. La exposición a la luz ultravioleta (UV) altera químicamente el fotorresistente modificando su solubilidad en su respectiva solución de desarrollo, transfiriendo el patrón deseado de la máscara al sustrato. Muchos métodos de micropatrones incorporan fotolitografía, ya que confiere nanómetro al control a nivel de micrómetro sobre el diseño de los patrones celulares. Sin embargo, el giro del fotorresistente es muy sensible a las impurezas, ya que las partículas de polvo más pequeñas interrumpirán la propagación de la solución en una película delgada. Por lo tanto, la fotolitografía debe llevarse a cabo en instalaciones no contaminadas, que son costosas de mantener y requieren conocimientos especializados especiales para su uso. Además, los productos químicos utilizados en la fotolitografía son a menudo tóxicos para las células y pueden desnaturalizar biomoléculas importantes. Por lo tanto, la fotolitografía plantea obstáculos significativos a la fabricación de micropatrones para aplicaciones biológicas convenientes.
En 1994, Whitesides y sus colegas4 superaron algunos de los desafíos asociados con la fotolitografía al ser pioneros en una colección de técnicas llamadas litografía blanda. En la litografía blanda, se utiliza una superficie microestructurada hecha con polidimetilsiloxano (PDMS), un material transparente similar al caucho, para generar un patrón de proteínas ECM4. Las técnicas litográficas suaves comunes incluyen impresión de microcontacto sin patrones microfluídicos. En la impresión de microcontactos, actualmente el método litográfico suave más popular, un sello PDMS recubierto con proteínas ECM transfiere el material a una superficie en las áreas contactadas por el sello(Figura 1B). En el patrón microfluídico, las microestructuras se diseñan sobre una superficie PDMS de tal manera que cuando el sello se presiona a un sustrato, se crea una red de microcanales, a través de los cuales se pueden suministrar fluidos a las áreas deseadas (Figura 1C)5. La litografía suave ofrece varios beneficios sobre la fotolitografía. Una vez que una oblea maestra está microfabricada, los sellos PDMS se pueden replicar fácilmente sin más empleo de instalaciones de salas limpias. Además, la ausencia de disolventes orgánicos en el proceso de litografía blanda permite la utilización de materiales poliméricos como el poliestireno, normalmente utilizado en el cultivo celular. Por último, el micropatrón mediante métodos litográficos suaves no se limita a superficies planas. Por lo tanto, la litografía suave aumenta la accesibilidad y la funcionalidad de la fabricación de micropatrones sobre la fotolitografía6. Sin embargo, la litografía blanda tiene inconvenientes significativos. Por ejemplo, todavía se requiere un paso inicial de grabado, utilizando fotolitografía, para microfabricar el sello. Además, el micropatrón mediante un sello PDMS está sujeto a variaciones en la calidad de la transferencia de proteínas en el sustrato6. Evitar estas discrepancias requiere optimización y coherencia en la presión aplicada al sello PDMS durante la transferencia de proteínas, de lo contrario la deformación y distorsión de los tamaños de entidad de los moldes PDMS pueden ocurrir6. También existe una gran preocupación de utilizar repetidamente PDMS debido a la absorción de moléculas pequeñas7.
Para evitar el uso de fotolitografías blandas y sellos PDMS, describimos un método de micropatrón de células únicas basado en plantillas y libre de litografía que supera muchos de los obstáculos asociados con la fotolitografía y la litografía suave. En este método, un hidrogel de poliacrilamida se utiliza como sustrato para la incorporación de proteínas ECM a base de plantillas, lo que permite el chapado selectivo de hiPSC-CM únicos. Esta técnica es altamente compatible con materiales poliméricos utilizados en condiciones clásicas de cultivo celular. Además, con una limpieza y un mantenimiento adecuados, las plantillas son reutilizables y resistentes a la degradación y absorción de proteínas durante el proceso de microfabricación. Por último, el proceso de patrón es técnicamente robusto, económico, personalizable y accesible para aquellos que no tienen habilidades especializadas de bioingeniería. Esta técnica de micropatrón basada en plantillas ha sido ampliamente utilizada en nuestras publicaciones recientes modelando cardiomiopatías variadas8,,9,10.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Aminoethyl methacrylate hydrochloride (powder)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>516155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide solution 40% (solution)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A-4058-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bench UV lamp 365 nm</td>
			<td>UVP</td>
			<td>UVP 95-0042-07, XX-15L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioFlex culture plate</td>
			<td>FLEXCELL INTERNATIONAL CORPORATION, Burlington, NC</td>
			<td></td>
			<td>6-well plate with silicon elastomer substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bis-acrylamide solution 2% (solution)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1533-25mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning cover glasses square, No. 2, W &#215; L 22 mm &#215; 22 mm</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CLS285522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Irgacure (2-Hydroxy-4&#8242;-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone) (powder)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>410896</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td>basement membrane matrix protein solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl sulfoxide, 99.7+%, Extra Dry, AcroSeal, ACROS Organics</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>326881000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex (13mm) filter unit with Durapore Membrane</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGV013SL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millipore 50mL Steriflip (0.22 &#181;m)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SCGP00525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stencils</td>
			<td>Potomac</td>
			<td>custom design</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfo-SANPAH</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>22589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Select 10x</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A1217702</td>
			<td>Enzyme used for stencil cleaning</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simple lithography-free single cell micropatterning using laser-cut stencils

Las técnicas de micropatrón se han utilizado ampliamente en la biología celular para estudiar los efectos del control de la forma y el tamaño de las células en la determinación del destino celular a una sola resolución de celda. Las técnicas actuales de micropatrón de una sola célula de última generación implican litografía suave e impresión de microcontacto, que es una tecnología poderosa, pero requiere habilidades de ingeniería entrenadas y cierto soporte de instalaciones en microfabricación. Estas limitaciones requieren una técnica más accesible. Aquí, describimos un método simple y libre de litografía alternativo: patrón de células únicas basado en plantillas. Proporcionamos procedimientos paso a paso que incluyen diseño de plantillas, fabricación de hidrogel de poliacrilamida, incorporación de proteínas a base de plantillas y chapado y cultivo celular. Este método simple se puede utilizar para patrones de una matriz de hasta 2.000 celdas. Demostramos el patrón de cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas por humanos únicos (hiPSC) con formas celulares distintas, de un cuadrado 1:1 a un rectángulo adulto similar a 7:1. Este patrón de una sola célula basado en plantillas es libre de litografía, técnicamente robusto, conveniente, barato y, lo que es más importante, accesible para aquellos con un fondo de bioingeniería limitado.

Se ha demostrado la fabricación de plantillas que contienen una matriz de cuadrados o rectángulos (Figura 4A). Siguiendo este protocolo, obtuvimos islas proteicas de matriz de patrones(Figura 4B y Figura 5A)y células (Figura 4C). La concentración de la solución de proteína de matriz subóptima dio lugar a patrones subóptimos(Figura 5B). Es fundamental utilizar la par...

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Simple Lithography-Free Single Cell Micropatterning using Laser-Cut Stencils

Este protocolo introduce un método de micropatrón libre de litografía que es simple y accesible para aquellos con un fondo de bioingeniería limitado. Este método utiliza plantillas de corte láser personalizadas para proteínas de matriz extracelular micropatrón en una forma de interés para la modulación de morfologías celulares. El procedimiento para el micropatrón se demuestra utilizando cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas.

Micropatrón simple de células únicas sin litografía con plantillas de corte láser

Micropatterning techniques have been widely used in cell biology to study effects of controlling cell shape and size on cell fate determination at single ...

Describiremos un método de micropatrón de células únicas sin litografía basada en plantillas que supera muchos obstáculos asociados con la fotolitografía y la litografía suave. Las plantillas son reutilizables y el proceso es barato y personalizable. Este método abrió una nueva vía para que los investigadores no ingenieros estudiaran la forma celular y la mecanotransducción inducida por el área en diversos contextos fisiológicos y patológicos.Además, este protocolo permite la micropatrnografía de miles de células que se pueden utilizar para el cribado de fármacos de alto rendimiento y el modelado de enfermedades en un plato. La demostración visual facilitará la implantación de dos pasos cruciales: desprendimiento de cubreobjetos del hidrogel, secado del hidrogel lo suficiente antes de colocar la plantilla. Preparar la solución de hidrogel de poliacrilamida en un nuevo tubo de centrífuga de propileno de 50 mililitros como se describe en el manuscrito.A continuación, para preparar la solución 5%fotoiniciador, disolver los ingredientes en 700 microlitros de 100% etanol. Los ingredientes no son solubles en agua, así que asegúrese de disolver completamente por vórtice. Añadir 300 microlitros de PBS para un volumen final de un mililitro.Trabajando en hielo, diluir la solución de proteína de matriz de membrana sótano con medios DMEM F12 fríos o 1X PBS a la relación de dilución optimizada. Mantener sobre hielo para su uso posterior. Cuando trabaje con la matriz de membrana del sótano, asegúrese de trabajar siempre en hielo y utilice soluciones heladas en puntas y tubos de pipeta refrigerados.Coloque una lámpara de banco UV en una campana de seguridad biológica. A continuación, coloque las películas de parafina esterilizadas preparadas previamente. Si las películas de parafina no están completamente secas, utilice un sistema de aspiración al vacío para eliminar cualquier líquido residual.Usando fórceps autoclavados, coloca seis cubreobjetos autoclaves en la película de parafina seis en cada plato de Petri. Para preparar la solución final de poliacrilamida reticulable UV, diluya la solución de fotoiniciador con la solución precursora de hidrogel de poliacrilamida. Esterilice la solución utilizando una unidad de filtro de 50 mililitros con un tamaño de poro de 0,22 micrómetros.A continuación, dispensar 200 microlitros de solución final de poliacrilamida reticulable UV en cada uno de los seis cubreobjetos de vidrio en los platos Petri. Usando fórceps autoclavados, cubra cuidadosamente cada cubreobjetos con un segundo cubreobjetos que atrapa una capa de la solución entre los dos cubreobjetos. Coloque los platos Petri que contengan los cubreobjetos debajo de la lámpara de banco UV con la tapa sin cerrar.La cobertura del papel blanco en la superficie no blanca es importante para minimizar la pérdida de intensidad UV. Para la protección contra la radiación UV, cubra la lámpara con papel de aluminio. Fotopolimerizar los hidrogeles de poliacrilamida durante cinco minutos.Utilice una cuchilla de afeitar para separar cuidadosamente cada par de cubreobjetos. Llene el depósito que contiene seis compuestos de cubierta de hidrogel con PBS. Después de enjuagar durante cinco minutos, devuelva los compuestos de cubierta de hidrogel a la película de parafina en el plato Petri.Obtenga un tubo de Sulfo-SANPAH del almacenamiento a menos 80 grados centígrados. Agregue 1.200 microlitros de PBS preenfriado al tubo y mezcle pipeteando hacia arriba y hacia abajo. Dispensar 200 microlitros del Sulfo-SANPAH diluido en la película de parafina en el plato Petri.Coloque un compuesto de cubierta de hidrogel sobre el Sulfo-SANPAH con el hidrogel en contacto con el Sulfo-SANPAH. A continuación, coloque los compuestos de cubierta de hidrogel bajo la lámpara UV y exponga durante cinco minutos para activar el Sulfo-SANPAH. Si el Sulfo-SANPAH pasa de naranja a marrón indicando la activación y la incorporación correctas, continúe con los siguientes pasos en 10 minutos.Reponer el depósito de polipropileno desechable con PBS fresco. Transfiera los compuestos de cubierta de hidrogel activado al depósito y enjuáguelos brevemente para eliminar sulfo-SANPAH sin consolidar. Coloque los compuestos de cubierta de hidrogel en la película de parafina en los platos de Petri y délos cuidadosamente con toallitas estériles sin pelusas.Coloque una plantilla encima de cada compuesto de cubierta de hidrogel. Para asegurar un sellado hermético entre la plantilla y el compuesto, elimine el exceso de humedad mediante el uso de toallitas sin pelusas autoclaves. Dispensar cuidadosamente la solución diluida de proteína de matriz de membrana del sótano colocando 200 microlitros encima de cada compuesto de cubierta de hidrogel.Incubar las construcciones durante la noche a 37 grados centígrados. Al día siguiente, transfiera los compuestos a una placa de seis pozos. Un sello hermético entre el hidrogel y la plantilla se puede validar fácilmente observando si la solución proteica de matriz se ha retenido en la parte superior de la plantilla.Si no se forma un sello hermético, se produce una fuga rápida de la solución proteica a través de los orificios. Sumerja completamente los compuestos en PBS. Usando pinzas autoclaves, desenganche cuidadosamente las plantillas de los hidrogeles sin romper los hidrogeles.Retire el PBS de los pozos y rellene los pozos con DMEM. Incubar la placa durante la noche a 37 grados centígrados. Después de retirar la placa de la incubadora, examine el DMEM.Si el DMEM no está turbio, los compuestos de cubierta de hidrogel están listos para ser utilizados para el recubrimiento celular. Se fabricaron plantillas que contenían matrices de cuadrados y rectángulos. Se crearon sustratos de hidrogel micropatrón a partir de las plantillas y se obtuvieron islas de proteína de matriz.También se obtuvieron islas celulares. Por ejemplo, islas de cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas por el hombre. La concentración de proteínas de la matriz desempeñó un papel esencial en la generación de patrones adecuados.Una concentración óptima condujo a una distribución homogénea de proteínas. Las concentraciones subópttimas de la solución de proteína de matriz dieron lugar a un patrón subóptimo. Es fundamental utilizar la parte frontal de la plantilla.Si se utiliza la parte posterior de la plantilla, el tamaño de las islas de proteína de matriz aumenta debido a la dirección del corte por láser. Si bien el uso de la parte posterior de la plantilla no afectó significativamente a la anchura de los patrones rectangulares, la altura aumentó significativamente, lo que llevó a una reducción en la relación de aspecto prevista. El patrón basado en plantillas se aplicó a sustratos de elastómero de silicio.Los cardiomiocitos estampados en sustratos de elastómero de silicio fueron visualizados por inmunocitoquímica de troponina cardiaca T a bajo aumento y por proteína sarcomerica alfa-actinina con alto aumento. El patrón basado en la plantilla también se aplicó para modelar dos cardiomiocitos uno al lado del otro en hidrogeles con diferentes rigidezes. El descubrimiento de células madre pluripotentes inducidas por el hombre y los correspondientes protocolos de diferenciación lo han convertido en un modelo humano in vitro ideal para el estudio de la oncogénesis y la patogénesis.Sin embargo, una limitación importante del uso del sistema IPS es la ausencia de estructura en el microambiente que tiene una composición y rigidez bioquímica particulares para interactuar con las células. El patrón se puede combinar con microscopía de fuerza de tracción y ensayos de inmunocitoquímica para caracterizar la estructura y función de los cardiomiocitos. El análisis de los tipos de células derivadas de IPS, en nuestro caso cardiomiocitos, en una morfología más fisiológica abre oportunidades para estudiar cardiomiocitos desafiantes en el plato de cultivo.La técnica también se puede aplicar a muchos otros sistemas, como las placas de cribado de alto contenido. La forma y el sustrato se pueden ajustar fácilmente a la aplicación.

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