Name: simple lithography-free single cell micropatterning using laser-cut stencils
Uploaded: 2020-04-03T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Simple Lithography-Free Single Cell Micropatterning using Laser-Cut Stencils at JoVE.com

Detta arbete stöddes av postdoktorala stipendium från Stanford Child Health Research Institute (CHRI) och National Institute of Health (1F32HL1422205-01) till S.L, Director's Pioneer Award (LM012179-03), American Heart Association Established Investigator Award (17EIA33410923), Stanford Cardiovascular Institute, Hoffmann och Schroepfer Foundation och Stanford Division of Cardiovascular Medicine, Department of Medicine till S.M.W , utmärkelser från National Institute of Health (UG3 TR002588, P01 HL141084, R01 HL126527, R01 HL113006, R01 HL123968) och tobaksrelaterat sjukdomsforskningsprogram (TRDRP 27IR-0012) till J.C.W, American Heart Association (AHA) Postdoc Fellowship Award (18POST34030106) till H.Y och Hengstberger-stipendiet till TS. Vi tackar Dr Andrew Olsen från Stanford Neuroscience Microscopy Service på stöd av konfokal avbildning av micropatterned hiPSC-CM. Vi tackar H.Y. för första stencil design, tillverkning, single cell micropatterning av iPSC-CM på polyacrylamide hydrogel belagda coverslip, och preliminära confocal imaging av sarkomerstrukturen av encelliga micropatterned iPSC-CMs.

1. Tillverkning av negativa mönster polyimidbaserade stenciler
<ol><li>Generera ett mönster(bild 2A)i .dxf-format med hjälp av datorstödd designprogramvara (t.ex.<ol>
<li>Generera en cirkel (diameter = 22 mm) för att avgränsa stencilens kant.</li>
		<li>Rita en heldragen form eller det önskade mönstret.</li>
		<li>Inkludera en kiral bokstav (t.ex. R) för att markera stencilernas framsida. Som ett exempel genereras en matris med fyrkanter och rektanglar för att mönstra iPSC-CM...

<ol>
	<li>Burridge, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+Defined+and+Small+Molecule-Based+Generation+of+Human+Cardiomyocytes.">Chemically Defined and Small Molecule-Based Generation of Human Cardiomyocytes.</a> Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).</li><li>Sayed, N., Liu, C., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translation+of+Human-Induced+Pluripotent+Stem+Cells:+From+Clinical+Trial+in+a+Dish+to+Precision+Medicine.">Translation of Human-Induced Pluripotent Stem Cells: From Clinical Trial in a Dish to Precision Medicine.</a> Journal of the American College of Cardiology. 67 (18), 2161-2176 (2016).</li><li>Ribeiro, A. J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contractility+of+single+cardiomyocytes+differentiated+from+pluripotent+stem+cells+depends+on+physiological+shape+and+substrate+stiffness.">Contractility of single cardiomyocytes differentiated from pluripotent stem cells depends on physiological shape and substrate stiffness.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (41), 12705-12710 (2015).</li><li>Kumar, A., Biebuyck, H. A., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterning+Self-Assembled+Monolayers:+Applications+in+Materials+Science.">Patterning Self-Assembled Monolayers: Applications in Materials Science.</a> Langmuir. 10 (5), 1498-1511 (1994).</li><li>Wilbur, J. L., Kumar, A., Kim, E., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfabrication+by+microcontact+printing+of+self-assembled+monolayers.">Microfabrication by microcontact printing of self-assembled monolayers.</a> Advanced Materials. 6 (7-8), 600-604 (1994).</li><li>Th&#233;ry, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micropatterning+as+a+tool+to+decipher+cell+morphogenesis+and+functions.">Micropatterning as a tool to decipher cell morphogenesis and functions.</a> Journal of Cell Science. 123 (24), 4201-4213 (2010).</li><li>Toepke, M. W., Beebe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PDMS+absorption+of+small+molecules+and+consequences+in+microfluidic+applications.">PDMS absorption of small molecules and consequences in microfluidic applications.</a> Lab on a Chip. 6 (12), 1484-1486 (2006).</li><li>Seeger, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Premature+Termination+Codon+Mutation+in+MYBPC3+Causes+Hypertrophic+Cardiomyopathy+via+Chronic+Activation+of+Nonsense-Mediated+Decay.">A Premature Termination Codon Mutation in MYBPC3 Causes Hypertrophic Cardiomyopathy via Chronic Activation of Nonsense-Mediated Decay.</a> Circulation. 139 (6), 799-811 (2019).</li><li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+PDGF+pathway+links+LMNA+mutation+to+dilated+cardiomyopathy.">Activation of PDGF pathway links LMNA mutation to dilated cardiomyopathy.</a> Nature. 572 (7769), 335-340 (2019).</li><li>Wu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+diastolic+dysfunction+in+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+from+hypertrophic+cardiomyopathy+patients.">Modelling diastolic dysfunction in induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes from hypertrophic cardiomyopathy patients.</a> European Heart Journal. 40 (45), 3685-3695 (2019).</li><li>Fischer, R. S., Myers, K. A., Gardel, M. L., Waterman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stiffness-controlled+three-dimensional+extracellular+matrices+for+high-resolution+imaging+of+cell+behavior.">Stiffness-controlled three-dimensional extracellular matrices for high-resolution imaging of cell behavior.</a> Nature Protocols. 7 (11), 2056-2066 (2012).</li><li>Lee, S., Stanton, A. E., Tong, X., Yang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogels+with+enhanced+protein+conjugation+efficiency+reveal+stiffness-induced+YAP+localization+in+stem+cells+depends+on+biochemical+cues.">Hydrogels with enhanced protein conjugation efficiency reveal stiffness-induced YAP localization in stem cells depends on biochemical cues.</a> Biomaterials. 202, 26-34 (2019).</li><li>Th&#233;ry, M., P&#233;pin, A., Dressaire, E., Chen, Y., Bornens, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+distribution+of+stress+fibres+in+response+to+the+geometry+of+the+adhesive+environment.">Cell distribution of stress fibres in response to the geometry of the adhesive environment.</a> Cell Motility. 63 (6), 341-355 (2006).</li><li>Kilian, K. A., Bugarija, B., Lahn, B. T., Mrksich, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geometric+cues+for+directing+the+differentiation+of+mesenchymal+stem+cells.">Geometric cues for directing the differentiation of mesenchymal stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (11), 4872-4877 (2010).</li></ol>

Vi beskriver en litografifri stencilbaserad mikromönstermetod som möjliggör effektiv mönstring av vidhäftande celler. I detta protokoll visar vi mönstring av hiPSC-CMs i olika längd-till-bredd nyckeltal av micropatterning källaren membran matris protein öar på polyacrylamide hydrogels med fysiologiskt- eller patologiskt relevanta vävnad stelheter eller kisel-baserade elastomer substrat. Denna metod är relativt enkel och mycket tillgänglig för alla forskare, inklusive de som har liten bakgrund inom fotolitog...

Tillkomsten av hiPSCs och den efterföljande utvecklingen av protokoll för deras riktade differentiering till olika celltyper har gjort det möjligt att studera utveckling och sjukdom på molekylär och patientspecifik nivå, särskilt med hjälp av patient-härledda iPSC kardiomyocyter (iPSC-CMs) för att modellera kardiomyopatier1,2. En stor begränsning till att studera utveckling och fysiologi med hjälp av iPSC-systemet och andra in vitro-modeller är dock avsaknaden av en strukturerad mikromiljö. På plats utsätts celler för begränsningarna i den extracellulära matrisen (ECM), liksom angränsande celler. Den särskilda biokemiska sammansättningen och styvheten hos dessa mikromiljöer dikterar den rumsliga fördelningen av celler samt faktorer som finns tillgängliga för att delta i cellvidhäftning. Detta påverkar i sin tur intracellulära signalvägar, genuttryck och cellödsbesehet. Till exempel, micropatterned iPSC-CM i en vuxen-liknande stav form har en betydligt bättre kontraktil förmåga, kalcium flöde, mitokondriell organisation, elektrofysiologi, och tvärgående-tubule bildning3. Således är egenskaperna hos mikromiljön integrerade i regleringen av cellulära funktioner.
Tidigare mikromönstertekniker är starkt beroende av fotolitografi (figur 1A). I denna teknik, ett lager av ljuskänslig polymer, eller fotoresist, snurras på ett platt substrat från lösning för att bilda en tunn film ca 1 μm tjock. Därefter appliceras ultraviolett (UV) ljus på fotoresistensen genom en mask som innehåller önskat mönster. Exponering för ultraviolett (UV) ljus förändrar kemiskt fotoresistensen genom att ändra dess löslighet i dess respektive utvecklarlösning och överför önskat mönster från masken till substratet. Många mikromönster metoder innehåller fotolitografi, eftersom det ger nanometer till mikrometer-nivå kontroll över utformningen av cellen mönster. Men spinning av fotoresistens är mycket känslig för föroreningar, eftersom de minsta dammpartiklar kommer att störa spridningen av lösningen i en tunn film. Fotolitografi måste därför utföras i oförorenade anläggningar, som är kostsamma att underhålla och kräver särskild expertis att utnyttja. Dessutom är de kemikalier som används i fotolitografi ofta giftiga för celler och kan denaturera viktiga biomolekyler. Således utgör fotolitografi betydande hinder för tillverkning av mikromönster för bekväma biologiska tillämpningar.
År 1994 övervann Whitesides och kollegor4 några av de utmaningar som förknippas med fotolitografi genom att bana väg för en samling tekniker som kallas mjuk litografi. I mjuk litografi används en mikrostrukturerad yta gjord med polydimetylsiloxan (PDMS), ett transparent, gummiliknande material, för att generera ett mönster av ECM-proteiner4. Vanliga mjuka litografiska tekniker inkluderar mikrokontakt utskrift och mikrofluidiska mönster. Vid mikrokontaktstryck, för närvarande den mest populära mjuka litografiska metoden, överför en PDMS-stämpel belagd med ECM-proteiner materialet till en yta vid de områden som kontaktas av stämpeln (figur 1B). I mikrofluidiska mönster är mikrostrukturer utformade på en PDMS-yta så att när stämpeln pressas till ett substrat skapas ett nätverk av mikrokanaler, genom vilket vätskor kan levereras till önskade områden (figur 1C)5. Mjuk litografi erbjuder flera fördelar jämfört med fotolitografi. När en huvudrån är mikrofabricerad kan PDMS-stämplarna enkelt replikeras utan ytterligare anställning av renrumsfaciliteter. Dessutom möjliggör frånvaron av organiska lösningsmedel i processen för mjuk litografi för användning av polymera material som polystyren, som vanligtvis används i cellodling. Slutligen är mikromönster med mjuka litografiska metoder inte begränsad till plana ytor. Således ökar mjuk litografi tillgängligheten och funktionaliteten hos mikromönster tillverkning över fotolitografi6. Men mjuk litografi har betydande nackdelar. Till exempel krävs fortfarande ett första etsningssteg, med hjälp av fotolitografi, för att mikrofabritera stämpeln. Dessutom är mikromönster med hjälp av en PDMS-stämpel föremål för variationer i kvaliteten på proteinöverföringen till substratet6. Undvika dessa avvikelser kräver optimering och konsekvens i trycket tillämpas på PDMS stämpel under proteinöverföring, annars deformation och snedvridning av funktionen storlekar pdms formar kan uppstå6. Det finns också en stor oro för att upprepade gånger använda PDMS på grund av liten molekylabsorption7.
För att undvika att använda mjuk fotolitografi och PDMS-frimärken beskriver vi en stencilbaserad litografifri mikromönstermetod med en cell som övervinner många av de hinder som är förknippade med fotolitografi och mjuk litografi. I denna metod används en polyakrylamidhydrogel som substrat för stencilbaserad ECM-proteinbildning, vilket möjliggör selektiv plätering av enskilda hiPSC-CMs. Denna teknik är mycket kompatibel med polymera material som används i klassiska cellodlingsförhållanden. Dessutom, med korrekt rengöring och underhåll, stencilerna är återanvändbara och resistenta mot nedbrytning och proteinabsorption under mikrotillverkningsprocessen. Slutligen är mönstringsprocessen tekniskt robust, billig, anpassningsbar och tillgänglig för dem som inte har några specialiserade bioengineering färdigheter. Denna stencil-baserade mikromönster teknik har i stort sett utnyttjats i våra senaste publikationer modellering olika kardiomyopatier8,9,10.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Aminoethyl methacrylate hydrochloride (powder)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>516155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide solution 40% (solution)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A-4058-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bench UV lamp 365 nm</td>
			<td>UVP</td>
			<td>UVP 95-0042-07, XX-15L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioFlex culture plate</td>
			<td>FLEXCELL INTERNATIONAL CORPORATION, Burlington, NC</td>
			<td></td>
			<td>6-well plate with silicon elastomer substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bis-acrylamide solution 2% (solution)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1533-25mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning cover glasses square, No. 2, W &#215; L 22 mm &#215; 22 mm</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CLS285522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Irgacure (2-Hydroxy-4&#8242;-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone) (powder)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>410896</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td>basement membrane matrix protein solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl sulfoxide, 99.7+%, Extra Dry, AcroSeal, ACROS Organics</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>326881000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex (13mm) filter unit with Durapore Membrane</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGV013SL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millipore 50mL Steriflip (0.22 &#181;m)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SCGP00525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stencils</td>
			<td>Potomac</td>
			<td>custom design</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfo-SANPAH</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>22589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Select 10x</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A1217702</td>
			<td>Enzyme used for stencil cleaning</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simple lithography-free single cell micropatterning using laser-cut stencils

Mikromönster tekniker har använts i stor utsträckning i cellbiologi för att studera effekterna av att kontrollera cellens form och storlek på cellöden bestämning vid single cell resolution. Nuvarande state-of-the-art encelliga mikromönster tekniker innebär mjuk litografi och mikro-kontakt utskrift, som är en kraftfull teknik, men kräver utbildad teknisk kompetens och vissa anläggning stöd i mikrotillverkning. Dessa begränsningar kräver en mer tillgänglig teknik. Här beskriver vi en enkel alternativ litografifri metod: stencilbaserad encellig mönster. Vi erbjuder steg-för-steg-procedurer inklusive stencildesign, polyakrylamidhydrogeltillverkning, stencilbaserad proteinintegration samt cellplätering och kultur. Denna enkla metod kan användas för att mönstra en matris med så många som 2000 celler. Vi visar mönstring av kardiomyocyter som härrör från enstaka mänskliga inducerad pluripotenta stamceller (hiPSC) med distinkta cellformer, från en 1:1 kvadrat till en 7:1 vuxen cardiomyocyte-liknande rektangel. Denna stencil-baserade encelliga mönster är litografi-fri, tekniskt robust, bekväm, billig, och viktigast av allt tillgänglig för dem med en begränsad bioteknik bakgrund.

Tillverkning av stenciler som innehåller en matris med kvadrater eller rektanglar har påvisats (figur 4A). Efter detta protokoll erhöll vi mönstrade matrisproteinöar (figur 4B och figur 5A) och celler (figur 4C). Koncentrationen av suboptimala matrisproteinlösning ledde till suboptimala mönster (figur 5B). Det är viktigt att använda stencilens framsida. Om stencile...

Watch this Scientific Journal Video about Simple Lithography-Free Single Cell Micropatterning using Laser-Cut Stencils at JoVE.com

Simple Lithography-Free Single Cell Micropatterning using Laser-Cut Stencils

Detta protokoll introducerar en litografifri mikromönstermetod som är enkel och tillgänglig för dem med en begränsad bioengineering bakgrund. Denna metod använder anpassade laser-cut stenciler till micropattern extracellulära matrisproteiner i en form av intresse för modulerande cell morfoologier. Förfarandet för micropatterning visas med hjälp av inducerad pluripotenta stamceller härledda kardiomyocyter.

Enkel litografifri encellig mikromönster med laserskurna stenciler

Micropatterning techniques have been widely used in cell biology to study effects of controlling cell shape and size on cell fate determination at single ...

Vi ska beskriva en stencil-baserade litografi-fri single-cell micropattern metod som övervinner många hinder som är associerade med photolithography och mjuk litografi. Schablonerna är återanvändbara och processen är billig och anpassningsbar. Denna metod öppnade en ny väg för icke-ingenjör forskare att studera cellform och område-inducerad mechanotransduction i olika fysiologiska och patologiska sammanhang.Dessutom, detta protokoll möjliggör mikromönster av tusentals celler som kan utnyttjas för hög genomströmning läkemedelsscreening och sjukdom modellering i en maträtt. Visuell demonstration kommer att underlätta implantation av två avgörande steg:lossnar av coverslip från hydrogel, torkning hydrogel tillräckligt innan du placerar stencilen. Bered polyakrylamidhydrogellösningen i ett nytt propyencentrifugerör på 50 milliliter enligt beskrivningen i manuskriptet.Nästa, för att förbereda 5%photoinitiatorlösningen, lös ingredienserna i 700 mikroliter av 100%etanol. Ingredienserna är inte vattenlösliga så se till att helt lösa upp genom att vortexa. Tillsätt 300 mikroliter PBS för en slutvolym på en milliliter.Arbeta på is, späda källaren membran matris protein stamlösning med iskall DMEM F12 media eller 1X PBS till den optimerade utspädningsförhållandet. Håll på is för senare användning. När du arbetar med källarmembranmatris, se till att alltid arbeta på is och använd iskalla lösningar i kylda pipettspetsar och rör.Placera en UV-bänklampa i en biologisk säkerhetshuva. Därefter placerar du de steriliserade paraffinfilmerna som förberetts tidigare. Om paraffinfilmerna inte är helt torra, använd ett vakuumaspirationssystem för att avlägsna eventuell kvarvarande vätska.Med hjälp av autoklaverade tlysnare, placera sex autoklaverade täcken på paraffinfilmen sex i varje petriskål. För att förbereda den UV-korslänkbara slutlösningen polyakrylamid, späda ut fotoinitiatorlösningen med polyakrylamiden hydrogelprekursorlösningen. Sterilisera lösningen med hjälp av en 50 milliliter filterenhet med en 0,22 mikrometer porstorlek.Sedan dispensera 200 mikroliter av UV-korslänkbar polyakrylamid slutlig lösning på var och en av de sex glasöverdrag i Petri-rätter. Med hjälp av autoklaverade tlys, täck noggrant varje täckskydd med en andra täckskydd svällning ett lager av lösningen mellan de två täcken. Placera Petrisdiskarna som innehåller täcken under UV-bänklampan med locket oskärmat.Täckningen av vitt papper på den icke-vita ytan är viktigt för att minimera UV-intensiteten förlust. För skydd mot UV-strålning, täck lampan med aluminiumfolie. Fotopolymerisera polyakrylamidhydrogelerna i fem minuter.Använd ett rakblad för att noggrant separera varje par av täcken. Fyll reservoaren som innehåller sex hydrogelöverdragskompositer med PBS. Efter sköljning i fem minuter, returnera hydrogelens täckkompositer till paraffinfilmen i petriskålen.Erhåll ett rör av Sulfo-SANPAH från lagring vid minus 80 grader Celsius. Tillsätt 1, 200 mikroliter av förkylda PBS till röret och blanda genom pipettering upp och ner. Dispensera 200 mikroliter av den utspädda Sulfo-SANPAH på paraffinfilmen i petriskålen.Placera en hydrogel coverslip komposit över Sulfo-SANPAH med hydrogel kontakta Sulfo-SANPAH. Därefter placerar hydrogelens kompositer för överdrag under UV-lampan och exponerar dem i fem minuter för att aktivera Sulfo-SANPAH. Om Sulfo-SANPAH vänder från orange till brun indikerar lyckad aktivering och inkorporering, fortsätt till nästa steg inom 10 minuter.Fyll på engångsbehållaren med polypropylen med färsk PBS. Överför de aktiverade hydrogelöverdragskompositerna till reservoaren och skölj dem kort för att avlägsna obundna Sulfo-SANPAH. Placera hydrogel-täckkompositerna på paraffinfilmen i Petri-rätterna och badda dem försiktigt med sterila luddfria våtservetter.Placera en stencil ovanpå varje hydrogelöverdragskomposit. För att säkerställa en tät förslutning mellan stencilen och kompositen, avlägsna överskottsfukt genom att dabba med autoklaverade luddfria våtservetter. Dispensera försiktigt den utspädda källaren membranmatris proteinlösningen placera 200 mikroliter ovanpå varje hydrogel coverslip komposit.Inkubera konstruktionerna över natten vid 37 grader Celsius. Nästa dag, överför kompositerna till en sex-brunnsplatta. En tät tätning mellan hydrogel och stencil kan enkelt valideras genom att observera om matrisproteinlösningen har behållits ovanpå stencilen.Underlåtenhet att bilda en tät tätning leder till snabb läckage av proteinlösningen genom hålen. Sänk ned kompositerna helt i PBS. Använda autoklaverade pincett, försiktigt lossa schablonerna från hydrogelerna utan att riva hydrogelerna.Ta bort PBS från brunnarna och fyll på brunnarna med DMEM. Inkubera plattan över natten vid 37 grader Celsius. Efter att ha tagit bort plattan från inkubatorn, undersök DMEM.Om DMEM inte är grumlig är hydrogelens kompositer för överdrag färdiga att användas för cellplätering. Stenciler var fabricerade som innehåller matriser av kvadrater och rektanglar. Micropatterned hydrogel substrat skapades från stencilerna och öar av matrisprotein erhölls.Cellöar erhölls också. Till exempel, öar av människa-inducerad pluripotenta stamceller-härledda kardiomyocyter. Matrix proteinkoncentration spelade en viktig roll för att generera rätt mönster.En optimal koncentration ledde till en homogen fördelning av proteiner. Suboptimal matrisproteinlösning koncentrationer ledde till suboptimala mönster. Det är avgörande att använda den främre sidan av stencilen.Om stencilens baksida används ökar storleken på matrisproteinöarna på grund av laserskärningens riktning. Medan du använder baksidan av stencilen inte signifikant påverka bredden på de rektangulära mönster, höjden ökade avsevärt leder till en minskning av den avsedda bildförhållande. Stencil-baserade mönster applicerades på kisel elastomer substrat.De mönstrade kardiomyocyter på kisel elastomer substrat var visualiseras av immunocytochemistry av hjärt troponin T vid låg förstoring och genom sarcomeric protein alpha-aktinin vid hög förstoring. Stencil-baserade mönstring applicerades också på mönster två kardiomyocyter sida vid sida på hydrogels med olika styvheter. Upptäckten av human-inducerad pluripotenta stamceller och motsvarande differentiering protokoll har gjort detta till en idealisk in vitro mänskliga modellen för att studera oncogenesis och patogenes.En stor begränsning av att använda IPS-system är dock frånvaron av struktur till mikromiljö som har särskild biokemisk sammansättning och styvhet att interagera med celler. Mönstring kan kombineras med dragkraft mikroskopi och immuncytokemi assays att karakterisera struktur och funktion av kardiomyocyter. Analys av IPS-härledda celltyper, i vårt fall kardiomyocyte, i en mer fysiologisk morfologi öppnar möjligheter att studera utmanande kardiomyocyter i kultur skålen.Tekniken kan också tillämpas på många andra system såsom och hög halt screening plattor. Formen och substratet kan lätt justeras till applikationen.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos

Isolering och karakterisering av enskilda celler från zebrafiskembryon

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been ...

Epigenetic Conversion as a Safe and Simple Method to Obtain Insulin-secreting Cells from Adult Skin Fibroblasts

Epigenetiska Konvertering som en säker och enkel metod för att få insulinfrisättande cellerna från sex hudfibroblaster

Regenerative medicine requires new, fully functional cells that are delivered to patients in order to repair degenerated or damaged tissues. When such ...

Stencil Micropatterning of Human Pluripotent Stem Cells for Probing Spatial Organization of Differentiation Fates

Stencil Micropatterning av mänskliga pluripotenta stamceller för undersökning fysisk planering av differentiering Fates

Human pluripotent stem cells (hPSCs), including embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells, have the intrinsic ability to differentiate into ...

Imaging Cleared Embryonic and Postnatal Hearts at Single-cell Resolution

Imaging Cleared embryonala och postnatal Hearts vid encelliga Upplösning

Single clonal tracing and analysis at the whole-heart level can determine cardiac progenitor cell behavior and differentiation during cardiac development, ...

A Simple Method to Identify Kinases That Regulate Embryonic Stem Cell Pluripotency by High-throughput Inhibitor Screening

En enkel metod för att identifiera kinaser som reglerar embryonisk stamcellspluripotens genom genomströmningshämmande screening

Embryonic stem cells (ESCs) can self-renew or differentiate into all cell types, a phenomenon known as pluripotency. Distinct pluripotent states have been ...

High-resolution Episcopic Microscopy (HREM) - Simple and Robust Protocols for Processing and Visualizing Organic Materials

High-resolution Episcopic Microscopy HREM - Simple and Robust Protocols for Processing and Visualizing Organic Materials

Högupplösande episkopisk mikroskopi (HREM) - Enkla och robusta protokoll för bearbetning och visualisering av organiska material

We provide simple protocols for generating digital volume data with the high-resolution episcopic microscopy (HREM) method. HREM is capable of imaging ...

Single-Cell Quantification of Protein Degradation Rates by Time-Lapse Fluorescence Microscopy in Adherent Cell Culture

Single-Cell kvantifiering av Protein nedbrytningshastigheten av Time-Lapse fluorescensmikroskopi i vidhäftande cellodling

Proteins are in a dynamic state of synthesis and degradation and their half-lives can be adjusted under various circumstances. However, most commonly used ...

Clonal Analysis of Embryonic Hematopoietic Stem Cell Precursors Using Single Cell Index Sorting Combined with Endothelial Cell Niche Co-culture

Klonal analys av hematopoetiska stamceller från embryon prekursorer använder enstaka Cell Index sortering kombinerade med endotelceller nisch samtidig kultur

The ability to study hematopoietic stem cell (HSC) genesis during embryonic development has been limited by the rarity of HSC precursors in the early ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

Single-cell Photoconversion i levande intakt zebrafiskar

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

Single-cell Transcriptomic Analyses of Mouse Pancreatic Endocrine Cells

Single-cell Transcriptomic analyser av mus bukspottkörtelns endokrina celler

Pancreatic endocrine cells, which are clustered in islets, regulate blood glucose stability and energy metabolism. The distinct cell types in islets, ...