Name: simple lithography-free single cell micropatterning using laser-cut stencils
Uploaded: 2020-04-03T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Simple Lithography-Free Single Cell Micropatterning using Laser-Cut Stencils at JoVE.com

Bu çalışma Stanford Çocuk Sağlığı Araştırma Enstitüsü (CHRI) ve Ulusal Sağlık Enstitüsü'nden (1F32HL142205-01) S.L.'ye doktora sonrası burs ile desteklenmiştir. NIH Direktör Öncü Ödülü Ofisi (LM012179-03), Amerikan Kalp Derneği Araştırmacı Ödülü (17EIA33410923), Stanford Kardiyovasküler Enstitüsü, Hoffmann ve Schroepfer Vakfı ve Stanford Kardiyovasküler Tıp Bölümü, S.M.W. Tıp Bölümü , Ulusal Sağlık Enstitüsü'nden ödüller (UG3 TR002588, P01 HL141084, R01 HL126527, R01 HL113006, R01 HL123968) ve Tütünle ilgili Hastalık Araştırma Programı (TRDRP 27IR-0012) J.C.W,Amerikan Kalp Derneği (AHA) Doktora Sonrası Burs Ödülü (18POST34030106) H.Y ve Henbergergstgst bursu.T.T.'ye. Stanford Nörobilim Mikroskopi Servisi'nden Dr. Andrew Olsen'e mikrodesenli hiPSC-CM konfokal görüntüleme desteği için teşekkür ederiz. H.Y.'ye ilk şablon tasarımı, imalatı, poliakrilamid hidrojel kaplı kapak üzerinde iPSC-CM'nin tek hücreli mikrodesenlenmesi ve tek hücreli mikrodesenli iPSC-CM'lerin sarcomere yapısının ön konfokal görüntülemesi için teşekkür ederiz.

1. Negatif desen poliimid bazlı şablonların imalatı
<ol><li>Bilgisayar destekli tasarım yazılımı (örneğin, AutoCAD, SolidWorks, Onshape, Adobe Illustrator) kullanarak .dxf formatında bir desen(Şekil 2A)oluşturun.<ol>
<li>Şablonun kenarlığı nı genişletmek için bir daire (çap = 22 mm) oluşturun.</li>
		<li>Katı dolu bir şekil veya istenilen desen çizin.</li>
		<li>Şablonların ön tarafını işaretlemek için bir chiral harfi (örneğin, R) ekleyin. NOT: Örnek ...

<ol>
	<li>Burridge, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+Defined+and+Small+Molecule-Based+Generation+of+Human+Cardiomyocytes.">Chemically Defined and Small Molecule-Based Generation of Human Cardiomyocytes.</a> Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).</li><li>Sayed, N., Liu, C., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translation+of+Human-Induced+Pluripotent+Stem+Cells:+From+Clinical+Trial+in+a+Dish+to+Precision+Medicine.">Translation of Human-Induced Pluripotent Stem Cells: From Clinical Trial in a Dish to Precision Medicine.</a> Journal of the American College of Cardiology. 67 (18), 2161-2176 (2016).</li><li>Ribeiro, A. J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contractility+of+single+cardiomyocytes+differentiated+from+pluripotent+stem+cells+depends+on+physiological+shape+and+substrate+stiffness.">Contractility of single cardiomyocytes differentiated from pluripotent stem cells depends on physiological shape and substrate stiffness.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (41), 12705-12710 (2015).</li><li>Kumar, A., Biebuyck, H. A., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterning+Self-Assembled+Monolayers:+Applications+in+Materials+Science.">Patterning Self-Assembled Monolayers: Applications in Materials Science.</a> Langmuir. 10 (5), 1498-1511 (1994).</li><li>Wilbur, J. L., Kumar, A., Kim, E., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfabrication+by+microcontact+printing+of+self-assembled+monolayers.">Microfabrication by microcontact printing of self-assembled monolayers.</a> Advanced Materials. 6 (7-8), 600-604 (1994).</li><li>Th&#233;ry, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micropatterning+as+a+tool+to+decipher+cell+morphogenesis+and+functions.">Micropatterning as a tool to decipher cell morphogenesis and functions.</a> Journal of Cell Science. 123 (24), 4201-4213 (2010).</li><li>Toepke, M. W., Beebe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PDMS+absorption+of+small+molecules+and+consequences+in+microfluidic+applications.">PDMS absorption of small molecules and consequences in microfluidic applications.</a> Lab on a Chip. 6 (12), 1484-1486 (2006).</li><li>Seeger, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Premature+Termination+Codon+Mutation+in+MYBPC3+Causes+Hypertrophic+Cardiomyopathy+via+Chronic+Activation+of+Nonsense-Mediated+Decay.">A Premature Termination Codon Mutation in MYBPC3 Causes Hypertrophic Cardiomyopathy via Chronic Activation of Nonsense-Mediated Decay.</a> Circulation. 139 (6), 799-811 (2019).</li><li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+PDGF+pathway+links+LMNA+mutation+to+dilated+cardiomyopathy.">Activation of PDGF pathway links LMNA mutation to dilated cardiomyopathy.</a> Nature. 572 (7769), 335-340 (2019).</li><li>Wu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+diastolic+dysfunction+in+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+from+hypertrophic+cardiomyopathy+patients.">Modelling diastolic dysfunction in induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes from hypertrophic cardiomyopathy patients.</a> European Heart Journal. 40 (45), 3685-3695 (2019).</li><li>Fischer, R. S., Myers, K. A., Gardel, M. L., Waterman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stiffness-controlled+three-dimensional+extracellular+matrices+for+high-resolution+imaging+of+cell+behavior.">Stiffness-controlled three-dimensional extracellular matrices for high-resolution imaging of cell behavior.</a> Nature Protocols. 7 (11), 2056-2066 (2012).</li><li>Lee, S., Stanton, A. E., Tong, X., Yang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogels+with+enhanced+protein+conjugation+efficiency+reveal+stiffness-induced+YAP+localization+in+stem+cells+depends+on+biochemical+cues.">Hydrogels with enhanced protein conjugation efficiency reveal stiffness-induced YAP localization in stem cells depends on biochemical cues.</a> Biomaterials. 202, 26-34 (2019).</li><li>Th&#233;ry, M., P&#233;pin, A., Dressaire, E., Chen, Y., Bornens, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+distribution+of+stress+fibres+in+response+to+the+geometry+of+the+adhesive+environment.">Cell distribution of stress fibres in response to the geometry of the adhesive environment.</a> Cell Motility. 63 (6), 341-355 (2006).</li><li>Kilian, K. A., Bugarija, B., Lahn, B. T., Mrksich, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geometric+cues+for+directing+the+differentiation+of+mesenchymal+stem+cells.">Geometric cues for directing the differentiation of mesenchymal stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (11), 4872-4877 (2010).</li></ol>

Yapışık hücrelerin etkili desenlemesini sağlayan litografiiçermeyen şablon bazlı mikro desenleme yöntemini tanımlıyoruz. Bu protokolde, fizyolojik veya patolojik olarak ilgili doku sertlikleri veya silikon bazlı elastomer substratları ile poliakrilamid hidrojeller üzerinde mikrodesenli bazal membran matris protein adaları mikrodesenleme tarafından farklı uzunluk-genişlik oranlarında hiPSC-CMs desenleme göstermektedir. Bu yöntem, fotolitografi ve mikrofabrikasyon teknikleri konusunda çok az geçmişe...

HiPSCs gelişiyle ve farklı hücre tipleri içine yönlendirilmiş farklılaşma için protokollerin sonraki gelişimi mümkün moleküler ve hastaya özgü düzeyde, özellikle hasta kaynaklı iPSC kardiyomiyositler kullanarak (iPSC-CMs) modelleme kardiyomiyopatiler1,2yaptık . Ancak, iPSC sistemi ve diğer in vitro modelleri kullanarak geliştirme ve fizyoloji eğitimi için önemli bir sınırlama yapılandırılmış bir mikroortamın yokluğudur. Yerinde, hücreler hücre dışı matris (ECM) kısıtlamaları yanı sıra komşu hücrelere tabi tutulur. Bu mikroortamların belirli biyokimyasal bileşimi ve sertliği, hücrelerin mekansal dağılımını ve hücre yapışmasını için mevcut faktörleri belirler. Bu da hücre içi sinyal yollarını, gen ekspresyonunu ve hücre kaderinin belirlenmesini etkiler. Örneğin, yetişkin benzeri çubuk şeklinde mikro desenli iPSC-CM önemli ölçüde daha iyi kontraktil yeteneği vardır, kalsiyum akışı, mitokondriyal organizasyon, elektrofizyoloji, ve enine-tübül oluşumu3. Bu nedenle, mikroçevrenin özellikleri hücresel fonksiyonların düzenlenmesinde ayrılmaz bir parçasıdır.
Önceki mikrodesenleme teknikleri yoğun olarak fotolitografiye dayanıyordu (Şekil 1A). Bu teknikte, ışığa duyarlı polimer veya fotodirenç tabakası, çözeltiden düz bir substrat üzerinde yaklaşık 1 μm kalınlığında ince bir film oluşturmak için döndürüldü. Daha sonra, ultraviyole (UV) ışık istenilen desen içeren bir maske ile fotodirenç üzerine uygulanır. Ultraviyole (UV) ışığa maruz kalma, ilgili geliştirici çözümündeki çözünürlüğünü değiştirerek fotodirenç'i kimyasal olarak değiştirir ve maskeden istenilen deseni alt tabakaya aktarabilir. Birçok mikrodesenleme yöntemi fotolitografiiçerir, çünkü hücre desenlerinin tasarımı üzerinde mikrometre düzeyinde kontrol sağlar. Ancak, fotodirenç iplik kirleri son derece duyarlıdır, küçük toz parçacıkları ince bir film içine çözeltinin yayılmasını bozacak çünkü. Bu nedenle fotolitografi, bakımı maliyetli ve kullanımı özel uzmanlık gerektiren kirlenmemiş tesislerde yapılmalıdır. Buna ek olarak, fotolitografide kullanılan kimyasallar genellikle hücreler için toksiktir ve önemli biyomoleküllerden doğaartabilir. Bu nedenle fotolitografi, uygun biyolojik uygulamalar için mikro desenlerin üretilmesinde önemli engeller oluşturmaktadır.
1994'te Whitesides ve meslektaşları4, yumuşak litografi adı verilen bir teknik koleksiyonuna öncülük ederek fotolitografi ile ilgili bazı zorlukların üstesinden geldiler. Yumuşak litografide, şeffaf, kauçuk benzeri bir malzeme olan polidimethylsiloxane (PDMS) ile yapılan mikroyapılı yüzey, ECM proteinlerinin bir deseni oluşturmak için kullanılır4. Yaygın yumuşak litografik teknikler mikrotemas baskı ve mikroakışkan deseniçerir. Şu anda en popüler yumuşak litografik yöntem olan mikrotemaslı baskıda, ECM proteinleri ile kaplanmış bir PDMS damgası, malzemeyi damganın temas ettiği alanlardaki bir yüzeye aktarır(Şekil 1B). Mikroakışkan desenlemede mikroyapılar, pul bir alt tabakaya basıldığında, sıvıların istenilen alanlara ulaştırılabildiği bir mikrokanal ağı oluşturulacak şekilde PDMS yüzeyinde tasarlanır (Şekil 1C)5. Yumuşak litografi fotolitografi üzerinde çeşitli faydalar sunar. Bir kez ana gofret mikrofabrikasyon, PDMS pulları kolayca temiz oda tesisleri daha fazla istihdam olmadan çoğaltılabilir. Buna ek olarak, yumuşak litografi sürecinde organik çözücülerin yokluğu genellikle hücre kültüründe kullanılan polistiren gibi polimerik malzemelerin kullanımına olanak sağlar. Son olarak, yumuşak litografik yöntemler kullanılarak mikrodesen düz yüzeyler ile sınırlı değildir. Böylece yumuşak litografi, mikrodesen üretiminin fotolitografi 6'ya göre6erişilebilirliğini ve işlevselliğini arttırmaktadır. Ancak, yumuşak litografi önemli dezavantajları vardır. Örneğin, fotolitografi kullanarak bir ilk gravür adımı, hala damga mikrofabrikasyon için gereklidir. Buna ek olarak, bir PDMS damgası kullanarak mikrodesen substrat üzerine protein transferi kalitesinde farklılıklar tabidir6. Bu tutarsızlıklardan kaçınmak, protein transferi sırasında PDMS damgasına uygulanan basınçta optimizasyon ve tutarlılık gerektirir, aksi takdirde PDMS kalıplarının özellik boyutlarının deformasyonu ve bozulması6. Küçük molekül emilimi nedeniyle tekrar tekrar PDMS kullanarak önemli bir endişe de vardır7.
Yumuşak fotolitografi ve PDMS pulları kullanmaktan kaçınmak için, fotolitografi ve yumuşak litografi ile ilişkili engellerin çoğunu aşan şablon tabanlı, litografiiçermeyen tek hücreli mikrodesenleme yöntemini tanımlıyoruz. Bu yöntemde, bir poliakrilamid hidrojel şablon bazlı ECM protein dahil için bir substrat olarak kullanılır, tek hiPSC-CMs seçici kaplama için izin. Bu teknik klasik hücre kültürü koşullarında kullanılan polimerik malzemeler ile son derece uyumludur. Ayrıca, uygun temizlik ve bakım ile, şablonlar yeniden kullanılabilir ve mikrofabrikasyon işlemi sırasında bozulma ve protein emilimine karşı dayanıklıdır. Son olarak, desenleme işlemi teknik olarak sağlam, ucuz, özelleştirilebilir ve özel biyomühendislik becerileri olmayanlar için erişilebilir. Bu şablon bazlı mikro desenleme tekniği, çeşitli kardiyomiyopatilerinmodelli8,9,10.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Aminoethyl methacrylate hydrochloride (powder)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>516155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide solution 40% (solution)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A-4058-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bench UV lamp 365 nm</td>
			<td>UVP</td>
			<td>UVP 95-0042-07, XX-15L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioFlex culture plate</td>
			<td>FLEXCELL INTERNATIONAL CORPORATION, Burlington, NC</td>
			<td></td>
			<td>6-well plate with silicon elastomer substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bis-acrylamide solution 2% (solution)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1533-25mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning cover glasses square, No. 2, W &#215; L 22 mm &#215; 22 mm</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CLS285522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Irgacure (2-Hydroxy-4&#8242;-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone) (powder)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>410896</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td>basement membrane matrix protein solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl sulfoxide, 99.7+%, Extra Dry, AcroSeal, ACROS Organics</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>326881000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex (13mm) filter unit with Durapore Membrane</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGV013SL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millipore 50mL Steriflip (0.22 &#181;m)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SCGP00525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stencils</td>
			<td>Potomac</td>
			<td>custom design</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfo-SANPAH</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>22589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Select 10x</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A1217702</td>
			<td>Enzyme used for stencil cleaning</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simple lithography-free single cell micropatterning using laser-cut stencils

Mikro desenleme teknikleri hücre biyolojisinde hücre şekil ve boyutunu kontrol eden etkilerin tek hücre çözünürlüğünde hücre kader intibakları üzerine etkisini incelemek için yaygın olarak kullanılmıştır. Mevcut state-of-the-art tek hücreli mikrodesen teknikleri yumuşak litografi ve mikro temas baskı, güçlü bir teknolojidir içerir, ancak mikrofabrikasyon eğitimli mühendislik becerileri ve belirli tesis desteği gerektirir. Bu sınırlamalar daha erişilebilir bir teknik gerektirir. Burada basit bir alternatif litografisiz yöntemi tanımlıyoruz: şablon bazlı tek hücreli desenleme. Biz şablon tasarımı, poliakrilamid hidrojel imalatı, şablon bazlı protein birleşme ve hücre kaplama ve kültür dahil olmak üzere adım adım prosedürleri sağlar. Bu basit yöntem, 2.000 kadar hücreden oluşan bir diziyi desenlemek için kullanılabilir. 1:1 kareden 7:1 erişkin kardiyomiyosit benzeri dikdörtgeniçin farklı hücre şekillerine sahip tek bir insan kaynaklı pluripotent kök hücreden (hiPSC) elde edilen kardiyomiyositlerin desenlenmelerini gösteriyoruz. Bu şablon tabanlı tek hücre lisali, litografisiz, teknik olarak sağlam, kullanışlı, ucuz ve en önemlisi sınırlı biyomühendislik geçmişi olanlar için erişilebilir.

Bir dizi kare veya dikdörtgen içeren şablonların imalatı gösterilmiştir (Şekil 4A). Bu protokolü takiben, desenli matris protein adaları (Şekil 4B ve Şekil 5A) ve hücreler (Şekil 4C)elde ettik. Suboptimal matris protein çözeltisi konsantrasyonu suboptimal desenleme yol açtı(Şekil 5B). Şablonun ön tarafını kullanmak çok önemlidir. Şablonun arka yüz...

Watch this Scientific Journal Video about Simple Lithography-Free Single Cell Micropatterning using Laser-Cut Stencils at JoVE.com

Simple Lithography-Free Single Cell Micropatterning using Laser-Cut Stencils

Bu protokol, sınırlı biyomühendislik geçmişi olanlar için basit ve erişilebilir bir litografi içermeyen mikrodesenleme yöntemini tanıtır. Bu yöntem, hücre morfolojilerini modüle etmek için ilgi çekici bir şekilde hücre dışı matris proteinleri mikrodesen için özelleştirilmiş lazer kesim şablonlar kullanır. Mikro desenleme prosedürü indüklenmiş pluripotent kök hücre kaynaklı kardiyomiyositler kullanılarak gösterilmiştir.

Lazer Kesim Şablonlar Kullanılarak Basit Litografisiz Tek Hücreli Mikrodesenleme

Micropatterning techniques have been widely used in cell biology to study effects of controlling cell shape and size on cell fate determination at single ...

Fotolitografi ve yumuşak litografi ile ilişkili birçok engeli aşan şablon bazlı litografisiz tek hücreli mikrodesen yöntemini açıklayacağız. Şablonlar yeniden kullanılabilir ve süreç ucuz ve özelleştirilebilir. Bu yöntem, mühendis olmayan araştırmacıların çeşitli fizyolojik ve patolojik bağlamlarda hücre şekli ve alana bağlı mekanotransdüksiyonu incelemeleri için yeni bir yol açmıştır.Ayrıca, bu protokol bir çanak yüksek iş itimi ilaç tarama ve hastalık modelleme için kullanılabilir hücrelerin binlerce mikrodesenleme sağlar. Görsel gösteri iki önemli adımın implantasyonunu kolaylaştıracaktır: kapak kaymasının hidrojelden ayrılması, kalıbı yerleştirmeden önce hidrojelin yeterince kurutulması. El yazmasında açıklandığı gibi yeni bir 50 mililitrelik propilen santrifüj tüp poliakrilamid hidrojel çözeltisi hazırlayın.Daha sonra, %5 fotoinatör çözeltisini hazırlamak için, malzemeleri %100 etanolün 700 mikrolitresinde çözün. Malzemeler suda çözünür değildir bu yüzden girdap tarafından tamamen çözülür emin olun. Bir mililitrelik son hacim için 300 mikrolitre PBS ekleyin.Buz üzerinde çalışma, buz soğuk DMEM F12 medya veya 1X PBS ile seyreltik bodrum membran matris protein stok çözeltisi optimize seyreltme oranı. Daha sonra kullanmak için buz üzerinde tutun. Bodrum membran matrisi ile çalışırken, her zaman buz üzerinde çalışmak ve soğutulmuş pipet ipuçları ve tüpler buz soğuk çözeltiler kullandığınızdan emin olun.Biyolojik bir güvenlik kaputuna uv tezgah lambası yerleştirin. Daha sonra, daha önce hazırlanmış steril parafin filmleri yerleştirin. Parafin filmleri tamamen kuru değilse, artık sıvıyı çıkarmak için bir vakum aspirasyon sistemi kullanın.Otoklavlı forceps kullanarak, parafin film altı her Petri çanak altı otoklavlı kapakları yerleştirin. UV çapraz bağlanabilir poliakrilamid nihai çözeltisini hazırlamak için, fotoinitiatatör çözeltisini poliakrilamid hidrojel öncül çözeltisi ile seyreltin. 0,22 mikrometre gözenek boyutuna sahip 50 mililitrelik filtre ünitesi ni kullanarak çözeltiyi sterilize edin.Sonra Petri kaplarında altı cam kapaklarıher üzerine UV çapraz bağlanabilir poliakrilamid nihai çözüm 200 mikrolitre dağıtmak. Otoklavlı forsepskullanarak, her coverslip'i iki kapak arasında çözeltinin bir tabakasını kaplayan ikinci bir kapak kaymasıyla dikkatlice kaplayın. Kapakları içeren Petri kaplarını UV tezgah lambasının altına kapağı kapalı olarak yerleştirin.Beyaz olmayan yüzeyde beyaz kağıt kapsama UV yoğunluğu kaybını en aza indirmek için önemlidir. UV ışınlarından korunmak için lambayı alüminyum folyo ile kaplayın. Poliakrilamid hidrojelleri beş dakika fotopolimerize edin.Her bir kapak çiftini dikkatlice ayırmak için bir jilet kullanın. Altı hidrojel coverslip kompozit içeren rezervuarı PBS ile doldurun. Beş dakika durulama sonra, Petri kabındaki parafin filmine hidrojel coverslip kompozitleri geri verin.Eksi 80 santigrat derecede depodan bir tüp Sulfo-SANPAH alın. Tüpe 1, 200 mikrolitre önceden soğutulmuş PBS ekleyin ve yukarı ve aşağı borular oluşturarak karıştırın. Petri kabındaki parafin filminüzerine seyreltilmiş Sulfo-SANPAH'ın 200 mikrolitresini dağıtın.Sulfo-SANPAH'a temas eden hidrojel ile Sulfo-SANPAH üzerine hidrojel coverslip kompozit yerleştirin. Daha sonra, UV lambası altında hidrojel coverslip kompozit yerleştirin ve Sulfo-SANPAH etkinleştirmek için beş dakika maruz. Sulfo-SANPAH başarılı aktivasyon ve birleşme gösteren turuncudan kahverengiye dönerse, 10 dakika içinde sonraki adımlara ilerleyin.Tek kullanımlık polipropilen hazneyi taze PBS ile yeniler. Aktif hidrojel coverslip kompozitleri rezervuara aktarın ve bağlanmamış Sulfo-SANPAH'ı çıkarmak için kısa bir süre durulayın. Petri tabaklarında parafin filminin üzerine hidrojel coverslip kompozitleri yerleştirin ve steril tiftiksiz mendillerle dikkatlice damlayın.Her hidrojel coverslip kompozit üstüne bir şablon yerleştirin. Şablon ve kompozit arasında sıkı bir mühür sağlamak için, otoklavsız mendil ile dabbing tarafından aşırı nem kaldırın. Her hidrojel coverslip kompozit üstüne 200 mikrolitre yerleştirerek seyreltilmiş bazal membran matris protein çözeltisi dikkatle dağıtmak.Yapıları bir gecede 37 derecede kuluçkaya yatırın. Ertesi gün, kompozitleri altı kuyulu bir tabağa aktarın. Hidrojel ve şablon arasındaki sıkı bir mühür, matris protein çözeltisinin şablonun üzerinde tutulup tutulmadığı gözlemlenerek kolayca doğrulanabilir.Sıkı bir sızdırmazlık yapılmaması protein çözeltisinin deliklerden hızlı bir şekilde sızmasına yol açar. Kompozitleri PBS'ye tamamen batırın. Otoklavlı cımbız kullanarak, hidrojelleri yırtmadan şablonları dikkatlice ayırın.PBS'yi kuyulardan çıkarın ve kuyuları DMEM ile doldurun. Tabağı bir gecede 37 derecede kuluçkaya yatırın. Kuvözdeki plakayı çıkardıktan sonra DMEM'i inceleyin.DMEM bulutlu değilse, hidrojel coverslip kompozitler hücre kaplaması için kullanılmaya hazırdır. Şablonlar kareler ve dikdörtgenler dizileri içeren imal edildi. Mikro desenli hidrojel substratları şablonlardan oluşturuldu ve matris proteinin adalarından elde edildi.Hücre adaları da elde edildi. Örneğin, insan kaynaklı pluripotent kök hücre kaynaklı kardiyomiyosit adaları. Matris protein konsantrasyonu uygun desenleri üreten önemli bir rol oynadı.Optimal konsantrasyon proteinlerin homojen bir dağılımına yol açtı. Suboptimal matris protein çözeltisi konsantrasyonları suboptimal desenleme yol açtı. Şablonun ön tarafını kullanmak çok önemlidir.Şablonun arka yüzü kullanılırsa, matris protein adalarının boyutu lazer kesim in yönüne bağlı olarak artar. Şablonun arka tarafını kullanmak dikdörtgen desenlerin genişliğini önemli ölçüde etkilemezken, yükseklik önemli ölçüde artmış ve amaçlanan en boy oranında bir azalmaya yol açmıştır. Silikon elastomer yüzeylere şablon bazlı desenleme uygulandı.Silikon elastomer substratlar üzerindeki desenli kardiyomiyositler düşük büyütmede kardiyak troponin T immünositokimyası ve yüksek büyütmede sarkonik protein alfa-aktinin ile görselleştirildi. Şablon bazlı desenleme de farklı sertlikleri ile hidrojeller yan yana desen iki kardiyomiyosit uygulandı. İnsan kaynaklı pluripotent kök hücrenin keşfi ve buna karşılık gelen farklılaşma protokolleri, onkogenez ve patogenezi incelemek için ideal bir in vitro insan modeli haline getirmiştir.Ancak, IPS sistemi kullanarak önemli bir sınırlama belirli biyokimyasal bileşimi ve hücrelerle etkileşim sertliği olan mikroçevreye yapının yokluğudur. Desenleme kardiyomiyositlerin yapısını ve işlevini karakterize etmek için çekiş kuvveti mikroskobu ve immünositokimya testleri ile kombine edilebilir. Ips kaynaklı hücre tiplerinin analizi, bizim durumumuzda kardiyomiyosit, daha fizyolojik morfolojide kültür çanatositlerinde zorlu kardiyomiyositleri inceleme fırsatları açar.Bu teknik, yüksek içerikli tarama plakaları gibi diğer birçok sistem için de uygulanabilir. Şekil ve substrat uygulamaya kolayca ayarlanabilir.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos

İzolasyon ve Zebra balığı Embriyolar gelen Tek Hücre Karakterizasyonu

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been ...

Epigenetic Conversion as a Safe and Simple Method to Obtain Insulin-secreting Cells from Adult Skin Fibroblasts

Yetişkin Cilt Fibroblastları gelen İnsülin salgılayan hücreler elde edilir Güvenli ve Basit Yöntem olarak epigenetik Dönüşüm

Regenerative medicine requires new, fully functional cells that are delivered to patients in order to repair degenerated or damaged tissues. When such ...

Stencil Micropatterning of Human Pluripotent Stem Cells for Probing Spatial Organization of Differentiation Fates

Farklılaşma Fates Mekansal Organizasyonu Probing İnsan pluripotent kök hücrelerin Stencil micropatterning

Human pluripotent stem cells (hPSCs), including embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells, have the intrinsic ability to differentiate into ...

Imaging Cleared Embryonic and Postnatal Hearts at Single-cell Resolution

Görüntüleme Tek hücreli Çözünürlük embriyonik ve Postnatal Kalpleri Temizlendi

Single clonal tracing and analysis at the whole-heart level can determine cardiac progenitor cell behavior and differentiation during cardiac development, ...

A Simple Method to Identify Kinases That Regulate Embryonic Stem Cell Pluripotency by High-throughput Inhibitor Screening

Embriyonik Kök Hücre Pluripotansını Yüksek Verimli İnhibitör Taramayla Düzenleyen Kinazları Tanımlamak İçin Basit Bir Yöntem

Embryonic stem cells (ESCs) can self-renew or differentiate into all cell types, a phenomenon known as pluripotency. Distinct pluripotent states have been ...

High-resolution Episcopic Microscopy (HREM) - Simple and Robust Protocols for Processing and Visualizing Organic Materials

High-resolution Episcopic Microscopy HREM - Simple and Robust Protocols for Processing and Visualizing Organic Materials

Yüksek Çözünürlüklü Episkopik Mikroskopi (HREM) - Organik Malzemelerin İşlenmesi ve Görselleştirilmesi için Basit ve Sağlam Protokoller

We provide simple protocols for generating digital volume data with the high-resolution episcopic microscopy (HREM) method. HREM is capable of imaging ...

Single-Cell Quantification of Protein Degradation Rates by Time-Lapse Fluorescence Microscopy in Adherent Cell Culture

Tek hücreli miktar Protein yıkımı oranları hızlandırılmış Floresans mikroskobu yapisan hücre kültüründe tarafından

Proteins are in a dynamic state of synthesis and degradation and their half-lives can be adjusted under various circumstances. However, most commonly used ...

Clonal Analysis of Embryonic Hematopoietic Stem Cell Precursors Using Single Cell Index Sorting Combined with Endothelial Cell Niche Co-culture

Embriyonik hematopoetik kök hücre öncüleri endotel hücre niş ortak kültürü ile kombine sıralama tek hücre dizini kullanarak klonal analizi

The ability to study hematopoietic stem cell (HSC) genesis during embryonic development has been limited by the rarity of HSC precursors in the early ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

Yaşam sağlam Zebra balığı tek hücreli Photoconversion

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

Single-cell Transcriptomic Analyses of Mouse Pancreatic Endocrine Cells

Fare pankreatik endokrin hücreleri tek hücre Transcriptomic analizleri

Pancreatic endocrine cells, which are clustered in islets, regulate blood glucose stability and energy metabolism. The distinct cell types in islets, ...