Name: assembly and characterization of polyelectrolyte complex micelles
Uploaded: 2020-03-02T14:00:00
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我们分别感谢芝加哥大学软物质特征处理设施和高级电子显微镜设施的菲尔·格里芬和泰拉·拉沃伊。我们还感谢阿贡国家实验室和NIST分层材料设计中心（CHiMaD）高级光子源的左小兵和森克·塞弗特的支持。我们感谢杰夫·丁和迈克尔·吕克海德对这项工作的贡献。

1. 材料准备
<ol><li>称重冻干二块聚合物，并添加水到接近10mg/mL最终浓度的库存溶液所需的体积。最大速度为 2 分钟。</li>
	<li>声波5分钟。非常长的二块可能需要额外的声波。库存解决方案应完全透明且均匀。</li>
	<li>根据需要使用 NaOH 或 HCl 将 pH 调整到 7.4。将水添加到最终体积中。pLys-PEG溶液相当稳定，但应冷藏以进行长期储存，使用前必须检查pH值。冻血比冷冻更可取。</li>
	<li>在所需的库存?...

如上所述，本文提出的协议以寡核苷酸作为聚烷基成分和pLys-PEG作为阳离子中性块共聚物，但我们用各种聚合物，如聚（丙烯酸）、聚谷氨酸和PEG-Poly（乙烯基苯基三甲基铵）进行了测试，并相信它们通常适用于大多数聚电解质对。可能需要优化的一个参数是用于退火的盐浓度，因为它应该足够高，以至于 PCM 在退火开始时不会形成。这可以通过DLS进行实验检查，或者与仅用聚电解质（无中性块）?...

当相反的带电聚电解质混合在水溶液中时，其反离子释放产生的熵增益会导致溶液被解混合成聚合物富浓缩相和聚合物耗尽的上清液1、2、3、4、5，这种现象称为聚电解质复合物。如果中性亲水区块与一种或两种聚电解质结合，则改为纳米级相分离（图1A）。由此产生的自组装芯壳纳米粒子被各种称为聚电解质复合云母（PCMs）、多离子复合云母、块离子体复合体或coacervate-core云母，通过类比到表面活性剂模细胞化，即使系统的所有成分都是亲水性6，7。PCM能够封装亲水分子，如蛋白质和核酸，以及块共聚载体结构提供的广泛可调性，使它们成为在体内8、9、10、11、12、13中传递治疗性分子的诱人候选者。
向细胞靶提供治疗性核酸是一项特别重要的挑战，PCM 具有以下几个优势。治疗核酸（遗传DNA，mRNA，和寡核苷酸，如siRNA）具有巨大的潜力，以改善人类健康，但必须克服许多生物和物理障碍，以实现潜在的14，15，16。裸核酸被血清和细胞核酸降解，迅速从循环中清除，其强烈的负电荷使它们难以在没有帮助的情况下穿透细胞膜。目前克服这些障碍的方法包括昂贵的化学改性，以防止核酸酶和/或封装成各种脂质纳米粒子，通过疏水相互作用组装15，17，18。虽然这些方法已被证明对局部注射和肝脏靶向有效，但系统使用在毒性、免疫原性和有限的生物分布方面存在显著限制16。相比之下，PCM使用核酸的负电荷在相分离的核心内冷凝它们，而中性电晕提供了防止降解的硬质屏障，以及一个平台，用于结合配体增强靶向或内化11，19。体外和动物研究表明，PCM可以有效地提供各种核酸有效载荷20，21，22，23，24，但我们预测PCM特性的能力，如大小，形状和稳定性，从成分聚合物的性质，阻碍了他们更广泛的采用。
我们小组和该领域的其他人最近的工作已经开始解决这个问题，通过开发结构-特性，在某些情况下，由核酸和各种阳离子中性聚合物7、25、26、27形成的PCM的结构-属性-功能关系。这些研究产生的两个一致主题是，为PCM组装开发控制良好、可重复的协议的重要性，以及使用多种技术来描述产生的纳米粒子的好处。多晶石，尤其是高电荷密度（如核酸）的聚电解质，相互作用非常强，在混合后似乎很容易产生动能，导致PCM制剂对程序的微小变化高度敏感，并且表现出高多分散度和多分不重复性。PCM 还已被证明采用各种形状和大小，具体取决于其组件的原子级配置，并且使用任何单独的表征技术捕获这种多样性是非常困难的，特别是因为一些常见的技术（如动态光散射 （DLS））需要对粒子形状进行假设才能进行解释。
在本文中，我们将讨论 PCM 的材料设计和选择，重点是寡核苷酸和阳离子中性二块共聚物。然后，我们描述了一个盐退火协议，该协议使用高盐浓度，然后进行缓慢的透析，以避免PCM组装过程中的动力学陷阱。聚电解质在高盐条件下混合，在静电聚光处进行筛选，然后盐浓度缓慢降低，使聚电解质进入其最有利的配置，类似于热退火的缓慢冷却过程。使用该协议，我们定期能够实现极低的多分散度和高重复性寡核苷酸PCMs7，26。最后，我们描述了如何使用四种独立的测量技术来描述从外部形态到内部结构（从外部形态到内部结构）的非常广泛的长度尺度的PCM特征：DLS、多角度光散射（MALS）、小角度X射线散射（SAXS）和透射电子显微镜（TEM）。我们希望这些协议将使更多的研究人员能够有效地探索这些有趣的纳米粒子的能力。
聚合物选择和制备 PCM 特性受到成分聚合物的物理和化学特性的强烈影响，使聚合物选择成为设计过程中的关键步骤。核酸PCM中分子结构最良好的块共聚物是线性二块，如聚（盐）-聚（乙二醇）（pLys-PEG），但五氯苯酚可以在聚电解质和各种亲水中性电荷聚合物之间形成，这些聚合物可以以高通量方式产生28。带电组的选择对电团的稳定性和云母26的形状有强烈的影响，而PCM尺寸已证明会随着带电块5、7、26的长度而增加（图2），从而使PCM特性能够适应所需应用的要求。对于线性 diblock，我们发现带电块应至少充电 10 次，并在所需的 pH 下进行强充电。较长的带电块可能促进PCM的形成与寡核苷酸，如siRNA，这是很难复杂与较短的块21。我们已经成功地观察到了块长度达200的PCM形成，文献描述了更长的聚合物。在选择中性块24时，具有更大的灵活性，但经验表明，极短的中性块会导致聚合而不是纳米粒子的形成，最小中性长度随带电块长度的增加而增加。对于 pLys-PEG，PLYs 长度低于 +50 时至少需要 3，000 到 5，000 的 PEG MW，并且随着带电块的进一步增加，需要更长的长度。由于中性聚合物的块状拥挤，中性块长度的增加导致 PCM 尺寸增加，尤其是壳体厚度。
本手稿提供了一个协议，用于从冻干高纯度PLys-PEG和已知数量的寡核苷酸制备PCM，但也应易于适应其他系统。我们已经成功地用几种带电多肽，包括聚精氨酸和聚谷氨酸，以及几种合成聚电解质，如聚丙烯酸和聚苯乙烯（乙烯基三甲基胺）。我们还描述了制备具有聚电解质电荷的化学计量比的PCM，但这很容易修改。我们发现在电荷浓度单位（c.c.）中工作是最容易的，该单位也自然地容纳了未充满电的聚合物。如果任一聚合物的特性不良好，应注意准确确定聚合物长度/质量，并确保超过透析电荷中和所需的过量盐。在计算浓度时，也应说明任何保留水的存在。核酸浓度可以通过260nm的吸光度方便地量化，在计算c.c时应考虑终端磷酸盐的存在或不存在。
当使用寡核苷酸作为聚苯乙烯时，杂交状态和化学结构有助于确定自组装的倾向和产生的PCM5、7、26的特性。如果使用 PCM 进行交付，在生物功效要求范围内优化这些结构将增加形成所需结构的可能性。分析杂交的有用工具包括用于核酸的MATLAB函数、NUPACK29和IDT OligoAnalyzer。我们建议分析候选序列，以了解在发夹形成中绑定到 1 本身的强度;2） 同一序列的另一个副本（自二分法）;和3）到系统中存在的其他寡核苷酸。DNA和RNA的熔融温度也可用于使用最近邻法30，31计算。核酸的热退火（步骤2.3）使单个核苷酸中的任何残余二级结构变性，并促进平衡折叠。
PCM 特征和分析 纳米粒子的特征技术范围广泛，包括静态和动态光散射、电子或中子的小角度散射和电子显微镜。在本文中，我们提供了两种光散射技术、小角度X射线散射和两个电子显微镜技术的协议。
DLS测量散射强度中的时间波动与样品布朗运动在一个角度的自相关。拟合此数据可为球形云母提供流体动力学半径和多分散度（图3）。多角度光散射 （MALS） 以多个角度测量静态散射强度。这种角度依赖性描述纳米粒子的形状，但可见光的长度范围大于 ±50 nm，这限制了其对较小纳米粒子的有效性。这两种技术都基于折射率不匹配，主要描述纳米粒子的外部尺寸。
小角度 X 射线散射 （SAXS） 使用 X 射线作为散射探头，其较短的波长允许在 ±0.1~100 nm 范围内进行测量。拟合观察到的散射强度与角度（通常表示为动量传递q）可提供有关 PCM 形态（即大小和形状）以及内部结构的信息。如果提供绝对强度校准，并且散射强度可以外推为零角，PCM 质量和聚合数也可以估计为32，使 SAXS 成为一种用途极其广泛且有价值的方法。小角中子散射（SANS）在类似的长度尺度范围内是敏感的，但仅在专门设施中可用，并且不会在本条第33、34、35条中明确讨论。
近年来，台式 SAXS 仪器的出现，但我们发现同步加速器源更适合 PCM 表征，因为它们的较高强度使得这些低对比度样品的数据收集速度更快。我们提供一个简短的协议，从用户的角度在高级光子源（美国阿贡国家实验室）的Beamline 12-ID-B获取PCM SAXS数据。该协议应适用于大多数同步辐射源，但强烈建议在提出实验之前咨询当地工作人员。我们还提供了一个数据缩减和分析协议，使用Irena36，一套为Igor Pro编写的免费宏。Irena 包括一组用于对 SAXS 数据建模的通用外形规格，并允许构建能够描述 PCM 复杂散射剖面的多组件模型（参见代表性结果，图 4）。Irena 还提供全面的文档和教程在线。在尝试以下过程之前，我们建议熟悉这些过程，特别是教程"具有两个主要散射群体的 SAXS 数据的建模"。
辐射损伤是X射线散射的一个关注点，但可以采用多种措施将其最小化。特别是，我们建议使用带注射器泵和 PCM 样品在数据采集过程中流动的流细胞设置，而不是密封毛细管。这也大大简化了背景减法。我们还建议对流动样品进行多次接触，而不是进行较长的接触，以限制任何单个样本的通量，并允许对比接触数据，以识别任何损坏。
与一般需要进行精密解释的散射技术不同，透射电子显微镜（TEM）通过电子束穿过样品并将图像投射在闪烁屏幕上，从而提供了纳米粒子的真实空间视觉图像（图5）。在本文中，我们将介绍两种 TEM 技术的协议。Cryo TEM 将云母样品冻结成薄薄的葡萄冰层，用最少的异物保持结构构象，最适合云母的半径±10-100 nm。负污渍 TEM 在样品在网格表面干燥后，使用重金属盐（如铀）来环绕样品。致密的污渍会比样品散射更多的电子，从而增加对比度并产生样品的负图像。对于高质量图像，建议使用 Cryo TEM。但是，它的成本更高、耗时，并且可能无法提供足够的对比度。当这是一个问题时，应使用负染色样品。每个示例如图5所示。
每种技术都报道了纳米粒子的略有不同的方面，具有不同的强度和局限性。光散射是现成的，并且通常是最快的方法，但在大小和形状分辨率方面有很大的限制。SAXS 可以在相当高的吞吐量下在较大范围内提供信息，但需要专门的设备来获取数据，以及建模来解释数据。TEM 图像易于解释，但对比度可能有限，而且吞吐量较低。我们的经验表明，使用多种技术进行表征，可大大增加可获得的有关 PCM 属性的信息，并简化了仅从每个数据集中获取的数据集的解释。例如，SAXS 和 TEM 主要检查 PCM 的致密核，而光散射报告纳米粒子的整体尺寸。因此，结合它们可以测量核心和电晕大小。TEM 获取真实空间图像的能力可以提供地面真实数据，以便选择适当的外形规格来建模可能不明确的 SAXS 数据。本文介绍了所有四种技术的协议，并在"讨论"部分中给出了使用它们来描述未知示例的示例过程。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>70 mm circle filter paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1001-070</td>
			<td>Filter paper for wicking during grid prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon Film TEM grid</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>CF200-Cu</td>
			<td>TEM grid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAWN</td>
			<td>Wyatt Technology</td>
			<td>DAWN</td>
			<td>MALS instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA oligonucleotide</td>
			<td>Integrated DNA Nanotechnologies Inc</td>
			<td></td>
			<td>Custom oligonucleotide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lacey Carbon TEM grid</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>LC200-Cu</td>
			<td>TEM grid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methoxy-poly(ethylene glycol)-block-poly(l-lysine hydrochloride) PEG5k - PLKC50</td>
			<td>Alamanda Polymers Inc</td>
			<td>mPEG5K-b-PLKC50</td>
			<td>Example block copolymer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td></td>
			<td>Ultrapure water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>For measuring nucleic acid concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>negative-action tweezers</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>N7</td>
			<td>Tweezers for grid preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm &#34;M&#34;</td>
			<td>Bemis Company Inc</td>
			<td>PM996</td>
			<td>Laboratory film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantifoil Holey Carbon TEM grid</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>Q210CR1.3</td>
			<td>TEM grid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Research Goniometer and Laser Light Scattering System</td>
			<td>Brookhaven Instruments</td>
			<td>BI-200SM</td>
			<td>DLS/MALS instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide-A-Lyzer G2 2K 0.5 mL</td>
			<td>Thermo Scientific Pierce Protein Biology</td>
			<td>87723</td>
			<td>Dialysis cartridge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>small volume cuvette</td>
			<td>Brookhaven Instruments</td>
			<td>BI-SVC</td>
			<td>Cuvette for DLS/MALS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solarus 950 Advanced Plasma System</td>
			<td>Gatan</td>
			<td>Solarus 950</td>
			<td>Plasma system for TEM grids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Talos TEM</td>
			<td>FEI</td>
			<td>Talos</td>
			<td>TEM used for cryo samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tecnai Spirit TEM</td>
			<td>FEI</td>
			<td>Spirit</td>
			<td>TEM used for dry samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl Formate</td>
			<td>SPI-Chem</td>
			<td>16984-59-1</td>
			<td>For negative staining samples for TEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitrobot</td>
			<td>FEI</td>
			<td>Vitrobot</td>
			<td>Vitrification robot for cryo grid preparation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assembly and characterization of polyelectrolyte complex micelles

聚电解质复合云母 （PCMs），由水溶液中带电聚合物自组装而成的核心壳纳米颗粒，为探索聚电解质相互作用的物理特性提供了强大的平台，也为在体内提供治疗性寡核苷酸的紧迫问题。事实证明，为PCM建立预测结构-属性关系很困难，部分原因是在纳米粒子自组装过程中存在强大的动力学陷阱。本文讨论了为PCM结构选择聚合物的标准，并提供了基于盐退火的协议，使可重复的低多分散性纳米粒子得以组装。我们还讨论了使用光散射、小角度X射线散射和电子显微镜的PCM表征。

为了说明上述特性方法，我们展示了从寡核苷酸和块共聚物中组装的各种长度和化学成分的PCM的典型结果（图1）。图 2 提供了 PCM 核心尺寸（根据 SAXS 和 TEM 确定，图 4和图 5）如何随带电块长度变化的示例。 图3显示了由相对长块共聚物和短单链寡核苷酸形成的球形PCM的DLS数据和拟合?...

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Assembly and Characterization of Polyelectrolyte Complex Micelles

我们提供协议和代表性数据，用于设计、组装和描述聚电解质复合云母、由聚电解质和亲水带无电荷块共聚物形成的核心壳纳米颗粒。

聚电解质复合微晶体的组装与特性

Polyelectrolyte complex micelles (PCMs), core-shell nanoparticles formed by self-assembly of charged polymers in aqueous solution, provide a powerful ...

该方法描述了多电解复式微晶硅体的设计、组装和表征的全路径，这些微晶硅是由相反带电聚合物的自组装形成的纳米粒子。聚分子自组装的一些主要挑战是避免动力学陷阱和纳米粒子的特性。我们描述的盐退火技术允许在尺寸和形状上具有低分散性的麦克风的可重复组装，我们描述了包括光散射、小角度X射线散射和电子显微镜在内的表征方法。提供治疗性核酸是纳米医学的长期挑战。这些多电聚细胞复合细胞利用核酸的强负电荷，将它们隔离在中性聚合物日冕保护它们免受核酸酶和免疫反应的细胞核心中。装配方法应适用于任何类型的带电聚合物。我们已经用几种聚物和聚物测试了它们，表征方法应适用于任何自组装的纳米粒子，包括表面活性纳米粒子和其他水磷驱动系统。首先在70摄氏度下孵育寡核苷酸溶液5分钟。孵育后，在室温下冷却15分钟，对核酸进行热退，然后加入40微升20毫摩尔电浓度二块共糖。立即对溶液进行涡旋，并在室温下孵育五分钟。要执行盐退火，在寡核苷酸溶液中加入氯化钠溶液，最终浓度为一摩尔，以最高速度旋转10秒。在室温下孵育混合物10分钟，然后继续装入透析盒。在装入之前，用永久标记标记墨盒，并在缓冲液中浸泡至少两分钟，以滋润膜。通过逆时针旋转去除盖，并使用凝胶加载移液器尖端装载样品。轻轻挤压膜以去除多余的空气并更换盖。将墨盒放入 1X PBS 0.5 摩尔氯化钠透析浴中，确保它们漂浮在两个膜暴露在浴池中。24 小时后，将墨盒转移到 1X PBS 中，然后再浸泡 24 小时。最后透析后，通过从浴池中取出墨盒、取下盖子以及用凝胶加载移液器尖端取出样品来回收样品。将样品放入干净的 1.5 毫升微离心管中，然后冷藏至使用。根据手稿方向在 DLS 仪器中准备样品，然后获取数据至少一分钟，确保计数速率在整个采集时间内保持不变。检查自动关联数据。长时间基线应为平面，自相关曲线应平滑且散点最小。通过获取更多数据，可以改善数据中的噪声。若要使用 Irena 执行数据缩减和分析，请从在后台数据集中导入 micelle 开始。在日志刻度上绘制样本和背景，并计算样本与背景的比率，并验证高 Q 无症状。计算此 Q 范围内的平均比率，并使用数据操作宏使用计算比率缩放背景。然后绘制 Q 上的背景减去信号，然后用新名称保存数据，确保不覆盖原始数据。打开建模宏，然后加载和绘制背景减去的数据。要查找聚细胞复杂微米（PCM）外部表面的近似模型，请在数据控件中选择到中等 Q 范围的流，以确保在存在振荡时包括振荡。在模型控件中，选择第一个散射总体，并确保它是唯一正在使用的散射总体。为模型选择大小分布，选择所需的分布类型，然后选择外形规格。此示例用于必须在用户外形下手动添加的柔性气缸。下载并添加灵活的气缸外形，然后输入分别对应于气缸长度和库恩长度的参数 1 和 2 的函数名称和初始值。这些气缸比 SAXS 可以解析的要长，因此气缸长度参数固定在大值。通过在比例、平均大小和宽度字段中输入值来设置搜索的初始参数。然后单击计算模型以绘制生成的外形因子。找到合理的参数后，单击拟合模型以执行与数据拟合的非线性最少平方。接下来，对PCM核心内单个聚合物的散射进行建模。调整数据控件以选择发生多余散射的 Q 范围，该范围通常位于中高范围内。添加第二个散射总体，并确保它是唯一正在使用的人口。为模型选择统一级别，调整 GDA 因子 G 和 RG，以确保模型不会预测低 Q 时过度散射，并使用游标宏之间的拟合 PB 获取这些参数的初始猜测。至于外形，对统一水平模型执行非线性拟合。如果存在衍射峰值，则为 Q 感兴趣范围内的衍射峰值添加第三个模型。一旦获得单个散射量的近似拟合值，则将所有三个点合一打开并优化组合拟合。最后，检查每个值在物理上是否合理，并通过在文件夹中选择存储来保存拟合。此过程的结果应该是一个复合模型，该模型描述小角度 X 射线散射数据，以及大范围的大小尺度。该协议用于设计、组装和表征核酸聚细胞复合米特尔或PCM。 Micelle芯大小主要由块共聚物带电块的长度驱动，并且在很大程度上与同聚物的长度无关。为短单链寡核苷酸中相对长的块共聚合物形成的球形PCM采集了动态光散射数据。自相关函数衰减为具有单个时间刻度的平面值，从而在 repIS 大小分布中生成单个大小峰值。复杂的小天使 X 射线散射或 SAXS 强度光谱可以通过结合存在的多个空间相关性模型来精确拟合，多角度光散射可用于将散射测量扩展到更长的长度尺度。不同形态的PCM也可以用电子显微镜进行成像，以验证核心半径和形状是否与拟合SAXS数据获得的值一致。安装 SAXS 数据时，请务必考虑每个散射特征，并使用 TEM 等免费方法确保使用正确的外形规格。

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