Name: assembly and characterization of polyelectrolyte complex micelles
Uploaded: 2020-03-02T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assembly and Characterization of Polyelectrolyte Complex Micelles at JoVE.com

Vi takker Phil Griffin og Tera Lavoie fra Soft Matter Characterization Facility og Advanced Electron Microscopy Facility, henholdsvis på The University of Chicago. Vi takker også Xiaobing Zuo og Soenke Seifert fra Advanced Photon Source på Argonne National Laboratory og NIST Center for Hierarchical Materials Design (CHiMaD) for støtte. Vi takker Jeff Ting og Michael Lueckheide for deres bidrag til dette arbejde.

1. Fremstilling af materialer
<ol><li>Afveje lyophilized diblock polymer og tilsæt vand op til næsten den mængde, der kræves for en bestand opløsning på 10 mg/ml endelig koncentration. Vortex ved maksimal hastighed i 2 min.</li>
	<li>Sonicate i 5 min. Meget lange diblocks kan kræve yderligere sonikering. Bestanden opløsning bør synes helt gennemsigtig og homogen.</li>
	<li>Juster pH til 7,4 ved hjælp af NaOH eller HCl efter behov. Tilsæt vand til det endelige volumen. pLys-PEG-opløsninger er ret stabile, me...

Som nævnt ovenfor, protokollerne præsenteres her er skrevet med fokus på oligonucleotider som polyanion komponent og pLys-PEG som kationisk-neutral blok copolymer, men vi har testet dem med en række polymerer, såsom poly (akrylsyre), polyglutamat, og PEG-poly (vinylbenzyl trimethylammonium), og mener, at de vil være generelt gældende for de fleste polyelektrolyt par. En parameter, der kan være nødvendigt at optimere, er saltkoncentrationen, der anvendes til glødning, fordi det skal være højt nok til, at PCM'e...

Når modsat ladede polyelektrolytter blandes i vandig opløsning, entropi gevinst fra frigivelse af deres modtællere forårsager demixing af opløsningen i en polymer-rige kondenseret fase og en polymer-forarmet supernatant1,2,3,4,5, et fænomen kendt som polyelektrolyt kompleksation. Hvis en neutral hydrofile blok konjugeres til den ene eller begge polyelektrolytter, sker nanoskalafaseadskillelsen i stedet (figur 1A). De resulterende selvsamlede kerneskal nanopartikler er skiftevis benævnt polyelektrolyt komplekse micelles (PCMs), polyion kompleks micelles, blok ionomkomplekser, eller coacervate-core micelles analogt til overfladeaktive micellization, selv om alle komponenter i systemet er hydrofile6,7. En PCM evne til at indkapsle hydrofile molekyler såsom proteiner og nukleinsyrer, samt den omfattende tunabilitet, der tilbydes af blokken copolymer luftfartsselskab arkitektur gør dem attraktive kandidater til at levere terapeutiske molekyler i vivo8,9,10,11,12,13.
Levering af terapeutiske kerner syrer til cellulære mål er en særlig vigtig udfordring, og en, som PCMs tilbyder flere fordele. Terapeutiske nukleinsyrer (genetisk DNA, mRNA, og oligonucleotider såsom siRNA) har et enormt potentiale for at forbedre menneskers sundhed, men skal overvinde mange biologiske og fysiske barrierer for at indse, at potentielle14,15,16. Nøgne nukleinsyrer nedbrydes af serum og cellulære nukleases, er hurtigt ryddet fra cirkulation, og deres stærke negative ladning gør det vanskeligt for dem at trænge ind cellemembraner uden hjælp. De nuværende metoder til at overvinde disse barrierer omfatter dyre kemiske ændringer for at forhindre skader fra nukleases og/eller indkapsling i forskellige lipidnanopartikler samlet via hydrofobe interaktioner15,17,18. Mens disse metoder har vist sig effektive til lokale injektioner og levermålretning, giver systemisk brug betydelige begrænsninger af toksicitet, immunogenicitet og begrænset biodistribution16. I modsætning hertil bruger PCM'er den negative ladning af nukleinsyrer til at kondensere dem inden for den faseseparerede kerne, mens den neutrale korona giver en steric barriere mod nedbrydning samt en platform til at indarbejde ligander for at forbedre målretning eller internalisering11,19. In vitro og dyreforsøg har vist, at PCM'er effektivt kan levere forskellige nukleinsyre nyttelast20,21,22,23,24, men svagheder i vores evne til at forudsige PCM egenskaber såsom størrelse, form, og stabilitet fra egenskaberne af de konstituerende polymerer har hindret deres bredere vedtagelse.
Det seneste arbejde fra vores gruppe og andre på området er begyndt at løse dette problem ved at udvikle struktur-ejendom, og i nogle tilfælde struktur-ejendom-funktion relationer for PCM'er dannet af nukleinsyrer og forskellige kationiske-neutrale polymerer7,25,26,27. To konsekvente temaer, der er opstået fra disse undersøgelser er vigtigheden af at udvikle velkontrollerede, repeterbare protokoller for PCM samling og fordelen ved at bruge flere teknikker til at karakterisere de resulterende nanopartikler. Polyelektrolytter, især dem med høj ladning tæthed som nukleinsyrer, interagere med hinanden meget stærkt, og synes at let blive kinetisk fanget ved blanding, hvilket resulterer i PCM præparater, der er meget følsomme over for små variationer i proceduren og vise høj polydispersitet og dårlig repeterbarhed fra batch til parti. PcMs har også vist sig at vedtage en bred vifte af former og størrelser afhængigt af atomniveau konfigurationer af deres komponenter, og fange denne mangfoldighed med enhver individuel karakterisering teknik er meget vanskeligt, især da nogle almindelige teknikker såsom dynamisk lys spredning (DLS) kræver antagelser om partikelform for deres fortolkning.
I denne artikel diskuterer vi materialedesign og -udvælgelse til pc'er med fokus på oligonucleotider og kationiske-neutrale diblock-copolymerer. Vi beskriver derefter en saltglødningsprotokol, der bruger høje saltkoncentrationer efterfulgt af langsom dialyse for at undgå kinetisk fældefangst under PCM-samling. Polyelektrolytterne blandes i høje saltforhold, hvor elektrostatiske attraktioner screenes, og saltkoncentrationen sænkes langsomt, så polyelektrolytterne kan falde til ro i deres mest energisk gunstige konfigurationer, svarende til den langsomme afkølingsproces med termisk glødning. Ved hjælp af denne protokol, vi er regelmæssigt i stand til at opnå usædvanlig lav polydispersity og høj repeterbarhed for oligonucleotid PCMs7,26. Endelig beskriver vi, hvordan fire separate måleteknikker kan bruges til at karakterisere PCMs over en meget bred vifte af længdeskalaer, fra ekstern morfologi til intern struktur: DLS, multi-vinkel lys spredning (MALS), lille vinkel X-ray spredning (SAXS), og transmission elektron mikroskopi (TEM). Vi håber, at disse protokoller vil gøre det muligt for flere forskere effektivt at udforske mulighederne for disse interessante nanopartikler.
Polymer udvælgelse og forberedelse PCM egenskaber er stærkt påvirket af de fysiske og kemiske egenskaber af de konstituerende polymerer, hvilket gør polymer udvælgelse et kritisk skridt i designprocessen. De mest velkarakteriserede blokcopolymerer til nukleinsyre-PC'er er lineære diblocks såsom poly(lysin)-poly (ethylenglycol) (pLys-PEG), men PCM'er kan dannes mellem polyelektrolytter og en række hydrofile neutralladede polymerer, som kan genereres på en høj gennemløbsmåde28. Valget af ladede gruppe påvirker i høj grad stabiliteten af ionparring og form af micelles26, og PCM størrelse har vist sig at stige med længden af den ladede blok5,7,26 ( Figur2), således PCM egenskaber, der skal indstilles til kravene i en ønsket anvendelse. For lineære diblocks, har vi konstateret, at den opkrævede blok skal have mindst 10 afgifter og være stærkt opkrævet på den ønskede pH. Længere ladede blokke kan fremme PCM dannelse med oligonucleotider såsom siRNA, som er vanskelige at komplekse med kortere blokke21. Vi har med succes observeret PCM dannelse med blok længder op til 200, og litteraturen beskriver længere polymerer. Der er større fleksibilitet i valget af neutrale blok24, men erfaringen har vist, at meget korte neutrale blokke fører til aggregering i stedet for nanopartikeldannelse, og at den minimale neutrale længde stiger med ladet bloklængde. For pLys-PEG kræves der en PEG MW på mindst 3.000-5.000 for pLys-længder under ~50, og der kræves længere længder, da den ladede blok øges yderligere. Øget neutral bloklængde resulterer i øget PCM-størrelse, især shelltykkelse, på grund af steric fortrængning af de neutrale polymerer.
Dette manuskript præsenterer en protokol til forberedelse af pcms fra lyophilized høj renhed pLys-PEG og oligonucleotider af kendt mængde, men bør være let kan tilpasses til andre systemer så godt. Vi har testet det med succes med flere ladede polypeptider, herunder polyarginin og polyglutamic syre, samt flere syntetiske polyelektrolytter, såsom polyakrylsyre og poly (vinylbenzyl trimethylammonium). Vi beskriver også forberedelse af pcms med et stoichiometric forhold af polyelektrolytafgifter, men dette kan nemt ændres. Vi finder det lettest at arbejde med at opkræve koncentrationsenheder (c.c.), som også naturligt rummer polymerer, der ikke er fuldt opladet. Hvis en af polymeren ikke er velkarakteriseret, skal man være omhyggelig med præcist at bestemme polymerlængderne/masserne og sikre, at overskydende salt ikke er til stede ud over det, der er nødvendigt for f.eks. Tilstedeværelsen af eventuelt tilbageholdt vand bør også tages i betragtning, når koncentrationerne beregnes. Nukleinsyrekoncentrationen kan kvantificeres bekvemt ved absorbans ved 260 nm, og tilstedeværelsen eller fraværet af terminalfosfater bør overvejes ved beregning af c.c.
Ved brug af oligonucleotider som polyanioner hjælper hybridiseringstilstanden og den kemiske struktur med at bestemme tilbøjeligheden til selvmontering og egenskaberne ved den resulterende PCM5,7,26. Optimering af disse, inden for kravene til biologisk effekt, hvis du bruger PCMs til levering, vil øge sandsynligheden for at danne de ønskede strukturer. Nyttige værktøjer til analyse af hybridisering omfatter MATLAB funktioner til nukleinsyrer, NUPACK29og IDT OligoAnalyzer. Vi anbefaler at analysere en kandidat sekvens for at forstå styrken af binding til 1) sig selv i en hårnål dannelse; 2) en anden kopi af den samme sekvens (selv-dimer); og 3) til andre oligonucleotider, der findes i systemet. DNA og RNA smeltetemperaturer for en bestemt sekvens kan også beregnes ved hjælp af nærmeste nabo metode30,31. Termisk glødning af nukleinsyrer (trin 2.3) denatures enhver resterende sekundær struktur i de enkelte nukleotider og fremmer ligevægt foldning.
PCM-tegnning og -analyse En bred vifte af teknikker er tilgængelige til at karakterisere nanopartikler, herunder statisk og dynamisk lys spredning, lille vinkel spredning af elektroner eller neutroner, og elektron mikroskopi. I denne artikel leverer vi protokoller for to lysspredningsteknikker, lille vinkel røntgenspredning og to elektronmikroskopiteknikker.
DLS måler autokorrelation en tidsmæssige udsving i spredning intensitet i én vinkel fra Brownian bevægelse af prøven. Montering af disse data kan give hydrodynamisk radius og polydispersitet til sfæriske micelles (figur 3). Multivinkellysspredning (MALS) måler den statiske spredningsintensitet i mange vinkler. Denne vinkelafhængighed beskriver nanopartiklens form, men er begrænset til længdeskalaer længere end ~50 nm for synligt lys, hvilket begrænser dens effektivitet for mindre nanopartikler. Begge teknikker er baseret på brydningsindeks mismatch og primært beskrive de udvendige dimensioner af nanopartikel.
Lille vinkel X-ray spredning (SAXS) bruger røntgenstråler som spredning sonde, og deres kortere bølgelængde tillader målinger over en række ~ 0,1-100 nm. Montering af den observerede spredningsintensitet vs. vinkel (konventionelt udtrykt som momentumoverførsel q)giver oplysninger om PCM morfologi (dvs. størrelse og form) og også intern struktur. Hvis en absolut intensitet kalibrering er tilgængelig, og hvis spredning intensitet kan ekstrapoleres til nul vinkel, PCM masse og sammenlægning nummer kan også anslås32,hvilket gør SAXS en yderst alsidig og værdifuld metode. Neutronspredning af små vinkler (SANS) er følsom over for en tilsvarende længdeskala, men er kun tilgængelig på specialiserede faciliteter og vil ikke udtrykkeligt blive drøftet i denne artikel33,34,35.
De seneste år har set fremkomsten af benchtop SAXS instrumenter, men vi finder, at synchrotron kilder er bedre egnet til PCM karakterisering, som deres højere intensitet gør det muligt data, der skal indsamles meget hurtigere for disse lav kontrast prøver. Vi leverer en kort protokol til at erhverve PCM SAXS data på Beamline 12-ID-B på Advanced Photon Source (Argonne National Laboratory, USA) fra et brugerperspektiv. Denne protokol bør gælde for de fleste synkrotronkilder, men det anbefales stærkt at rådføre sig med lokalt personale, før der foreslås et eksperiment. Vi leverer også en datareduktions- og analyseprotokol ved hjælp af Irena36, et gratis sæt makroer skrevet til Igor Pro. Irena indeholder et alsidigt sæt af formfaktorer til modellering af SAXS-data og giver mulighed for konstruktion af multikomponentmodeller, der er i stand til at beskrive pcms' komplekse spredningsprofil (se repræsentative resultater, figur 4). Irena har også omfattende dokumentation og tutorials til rådighed online. Før du forsøger nedenstående procedurer, anbefaler vi kendskab til disse, især tutorial "Modellering af SAXS data med to vigtigste scatterer populationer".
Strålingsskader er en bekymring for røntgenspredning, men flere foranstaltninger kan anvendes til at minimere det. Vi anbefaler især at bruge en flowcelleopsætning med en sprøjtepumpe og PCM-prøve, der flyder under dataindsamling, i stedet for en forseglet kapillær. Dette forenkler også i høj grad baggrunden subtraktion. Vi foreslår også, at der tages flere eksponeringer af den flydende prøve i stedet for en længere for at begrænse den strøm, som en enkelt mængde prøve ser, og for at gøre det muligt at sammenligne eksponeringsdataene for at identificere eventuelle skader.
I modsætning til spredningsteknikkerne, som generelt kræver tilpasning til fortolkningen, giver transmissionselektronmikroskopi (TEM) et reelt visuelt rumbillede af nanopartiklerne ved at passere en elektronstråle gennem prøven og projicere et billede på en scintillationsskærm (figur 5). Vi præsenterer protokoller for to TEM teknikker i denne artikel. Cryo TEM fryser micelle prøver i et tyndt lag glaslegemeis, der bevarer strukturel kropsbygning med minimale fremmede stoffer, optimal for micelles ≤~10-100 nm i radius. Negativ plet TEM bruger et heavy metal salt (f.eks uran) til at omgive prøven, efter at den er blevet tørret på overfladen af et gitter. Den tætte plet vil sprede flere elektroner end prøven, tilføjer kontrast og producerer et negativt billede af prøven. Cryo TEM anbefales til billeder i høj kvalitet. Men det er dyrere, tidskrævende, og kan ikke give tilstrækkelig kontrast. Når dette giver anledning til bekymring, bør der anvendes negative farvede prøver. Eksempler på hver findes i figur 5.
Hver af disse teknikker rapporterer om lidt forskellige aspekter af nanopartikler, med forskellige styrker og begrænsninger. Lysspredning er let tilgængelig, og er ofte den hurtigste tilgang, men har betydelige begrænsninger i størrelse og form opløsning. SAXS kan give oplysninger over en lang række længdeskalaer ved rimelig høj gennemløb, men kræver specialiseret udstyr til at erhverve data, samt modellering til at fortolke det. TEM billeder er ligetil at fortolke, men kan begrænses i modsætning og er i sagens natur lav gennemløb. Vores erfaring har vist, at ved hjælp af flere teknikker til karakterisering i høj grad øger de oplysninger, der kan opnås om PCM egenskaber og forenkler fortolkningen af datasæt opnået fra hver enkelt alene. F.eks. undersøger SAXS og TEM primært en PCM's tætte kerne, mens lysspredningsrapporter om nanopartiklens overordnede dimensioner. Således kombinere dem giver mulighed for måling af både kerne og korona størrelse. TEM's evne til at erhverve virkelige rumbilleder kan give data om jorden til at gøre det muligt at vælge passende formfaktorer til modellering af SAXS-data, som ellers ville være tvetydige. I denne artikel beskrives protokoller for alle fire teknikker, og der gives et eksempel på brug af dem til at karakterisere et ukendt eksempel i diskussionsafsnittet.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>70 mm circle filter paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1001-070</td>
			<td>Filter paper for wicking during grid prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon Film TEM grid</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>CF200-Cu</td>
			<td>TEM grid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAWN</td>
			<td>Wyatt Technology</td>
			<td>DAWN</td>
			<td>MALS instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA oligonucleotide</td>
			<td>Integrated DNA Nanotechnologies Inc</td>
			<td></td>
			<td>Custom oligonucleotide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lacey Carbon TEM grid</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>LC200-Cu</td>
			<td>TEM grid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methoxy-poly(ethylene glycol)-block-poly(l-lysine hydrochloride) PEG5k - PLKC50</td>
			<td>Alamanda Polymers Inc</td>
			<td>mPEG5K-b-PLKC50</td>
			<td>Example block copolymer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td></td>
			<td>Ultrapure water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>For measuring nucleic acid concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>negative-action tweezers</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>N7</td>
			<td>Tweezers for grid preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm &#34;M&#34;</td>
			<td>Bemis Company Inc</td>
			<td>PM996</td>
			<td>Laboratory film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantifoil Holey Carbon TEM grid</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>Q210CR1.3</td>
			<td>TEM grid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Research Goniometer and Laser Light Scattering System</td>
			<td>Brookhaven Instruments</td>
			<td>BI-200SM</td>
			<td>DLS/MALS instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide-A-Lyzer G2 2K 0.5 mL</td>
			<td>Thermo Scientific Pierce Protein Biology</td>
			<td>87723</td>
			<td>Dialysis cartridge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>small volume cuvette</td>
			<td>Brookhaven Instruments</td>
			<td>BI-SVC</td>
			<td>Cuvette for DLS/MALS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solarus 950 Advanced Plasma System</td>
			<td>Gatan</td>
			<td>Solarus 950</td>
			<td>Plasma system for TEM grids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Talos TEM</td>
			<td>FEI</td>
			<td>Talos</td>
			<td>TEM used for cryo samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tecnai Spirit TEM</td>
			<td>FEI</td>
			<td>Spirit</td>
			<td>TEM used for dry samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl Formate</td>
			<td>SPI-Chem</td>
			<td>16984-59-1</td>
			<td>For negative staining samples for TEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitrobot</td>
			<td>FEI</td>
			<td>Vitrobot</td>
			<td>Vitrification robot for cryo grid preparation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assembly and characterization of polyelectrolyte complex micelles

Polyelektrolyt kompleks micelles (PCMs), core-shell nanopartikler dannet af selvsamling af ladede polymerer i vandig løsning, giver en kraftfuld platform til at udforske fysik polyelektrolyt interaktioner og tilbyder også en lovende løsning på det presserende problem med at levere terapeutiske oligonucleotider in vivo. Udvikling af prædiktive struktur-ejendom relationer for PCMs har vist sig vanskeligt, til dels på grund af tilstedeværelsen af stærke kinetiske fælder under nanopartikel selvsamling. Denne artikel diskuterer kriterier for valg af polymerer til PCM konstruktion og giver protokoller baseret på salt annealing, der gør det muligt samling af repeterbare, lav polydispersity nanopartikler. Vi diskuterer også PCM karakterisering ved hjælp af lys spredning, lille vinkel X-ray spredning, og elektron mikroskopi.

For at illustrere de ovenfor beskrevne karakteriseringsmetoder viser vi typiske resultater for PCM'er, der er samlet fra oligonucleotider og blokere copolymerer af forskellig længde og kemi (figur 1). Figur 2 giver et eksempel på, hvordan PCM-kernestørrelse (som bestemt fra SAXS og TEM, figur 4 og figur 5) varierede med ladet bloklængde. Figur 3 viser DLS-data og tilpas...

Watch this Scientific Journal Video about Assembly and Characterization of Polyelectrolyte Complex Micelles at JoVE.com

Assembly and Characterization of Polyelectrolyte Complex Micelles

Vi leverer protokoller og repræsentative data til design, samling og karakterisering af polyelektrolytkompleksmicelles, nanopartikler af kerneskallen dannet af polyelektrolytter og hydrofile ladede blok-copolymerer.

Samling og karakterisering af polyelektrolytkompleksmiceller

Polyelectrolyte complex micelles (PCMs), core-shell nanoparticles formed by self-assembly of charged polymers in aqueous solution, provide a powerful ...

Denne metode beskriver den fulde vej af design, samling og karakterisering af polyelektrolyte komplekse micelles, som er nanopartikler, der er dannet af selvsamling af modsat ladede polymerer. Nogle store udfordringer med polyelektrolyt selvsamling undgår kinetiske fælder og karakteriserer nanopartiklerne. Saltglødningsteknikken, som vi beskriver, giver mulighed for repeterbar samling af micelles med lav dispersitet i både størrelse og form, og vi beskriver karakteriseringsmetoder, herunder lysspredning, lille vinkel røntgenspredning og elektronmikroskopi.Levering af terapeutiske nukleinsyrer er en langvarig udfordring for nanomedicin. Disse polyelektrolyte komplekse micelles drage fordel af den stærke negative ladning af nukleinsyre til at sequester dem i kernen af micelle, hvor den neutrale polymer korona beskytter dem mod nukleaser og immunrespons. Samlemetoden skal gælde for alle typer ladede polymerer.Vi har testet dem med flere polyanioner og polykationer, og karakteriseringsmetoden bør gælde for alle selvsamlede nanopartikler, herunder overfladeaktive nanopartikler og andre hydrophobisk drevne systemer. Begynd med at inkubere oligonucleotidopløsningen ved 70 grader Celsius i fem minutter. Efter inkubationen afkøles den i 15 minutter ved stuetemperatur for termisk at udgløde nukleinsyrerne, og der tilsættes derefter 40 mikroliter på 20 millimolarladnings koncentrationerdiblok copolymer.Vortex opløsningen straks og inkubere det i fem minutter ved stuetemperatur. For at udføre saltglødning tilsættes natriumchloridopløsningen til oligonukleotidopløsningen for en endelig koncentration af en kindtand og vortex det i 10 sekunder ved maksimal hastighed. Inkuber blandingen i 10 minutter ved stuetemperatur, og fortsæt derefter med at lægge den i dialysepatronen.Før isætning skal patroner med permanent markør lægges i blød i buffer i mindst to minutter for at fugte membranerne. Fjern hætten ved at dreje mod uret og ilæse prøven med en gellæstepipettespids. Klem forsigtigt membranen for at fjerne overskydende luft og udskift hætten.Læg patronerne i 1X PBS 0,5 molar natriumchloriddialysebad og sørg for, at de flyder med begge membraner udsat for badet. Efter 24 timer skal patronerne overføres til 1X PBS og lægges i blød i yderligere 24 timer. Efter den endelige dialyse genvindes prøven ved at fjerne patronerne fra badet, fjerne hætten og fjerne prøven med en gellæstespids.Prøven anbringes i et rent 1,5 milliliter mikrocentrifugerør, og den opbevares i køleskab, indtil den er klar til brug. Forbered prøven i DLS-instrumentet i henhold til manuskriptanvisninger, og ansk dem derefter data i mindst et minut for at sikre, at optællingshastigheden er konstant over hele anskaffelsestiden. Undersøg data om autokorrelation.Den lange tid baseline skal være flad og autokorrelation kurven bør være glat med minimal scatter. Støj i dataene kan forbedres ved at indsamle flere data. Hvis du vil udføre datareduktion og -analyse ved hjælp af Irena, skal du starte med at importere micelle i baggrundsdatasæt.Afbilde prøven og baggrunden sammen på en log-log skala og beregne prøven til baggrund forholdet og kontrollere den høje Q asymptote. Beregn gennemsnitsforholdet over dette Q-område, og brug datamanipulationsmakroen til at skalere baggrunden med det beregnede forhold. Afbild derefter baggrundsfratrukket signal over Q og gem dataene med et nyt navn, og sørg for ikke at overskrive de oprindelige data.Åbn modelmakroen, indlæs og plot baggrunden fratrukket data. Hvis du vil finde en omtrentlig model til den udvendige overflade af den polyelektrolytkomplekse micelle eller PCM, skal du vælge flow til moderat Q-område i datakontrolelementerne og sørge for at medtage svingninger, hvis de er til stede. I modelkontrolelementer skal du vælge den første spredningspopulation og sikre dig, at den er den eneste, der er i brug.Vælg størrelsesfordeling for model, vælg den ønskede fordelingstype, og vælg formfaktoren. Dette eksempel er for en fleksibel cylinder, som skal tilføjes manuelt under brugerformfaktoren. Download og tilføj den fleksible cylinderformfaktor, og indtast derefter funktionsnavnene og de oprindelige værdier for henholdsvis parametre et og to, som svarer til cylinderens længde og Kuhn-længden.Disse cylindre er længere end det, der kan løses med SAXS, så cylinderlængdeparameteren er fastgjort til en stor værdi. Angiv de første parametre for søgningen ved at angive værdier i felterne skalering, middelstørrelse og bredde. Klik derefter på beregn model for at tegne den resulterende formfaktor.Når der er fundet rimelige parametre, skal du klikke på tilpassmodel for at udføre en ikke-lineær mindst kvadrater, der passer til dataene. Dernæst model spredning af de enkelte polymerer i PCM kerne. Juster datakontrolelementerne for at vælge Q-området, hvor overskydende spredning forekommer, og som typisk er i det moderate til høje område.Tilføj en anden spredning befolkning og sørg for det er den eneste i brug. Vælg samlet niveau for modellen, juster GDA-faktorerne G og RG for at sikre, at modellen ikke forudsiger overdreven spredning ved lavt Q, og brug den tilpassede PB mellem markernes makro for at få et indledende gæt for disse parametre. Med hensyn til formfaktoren skal du udføre en ikke-lineær pasform til den samlede niveaumodel.Hvis der er en diffraktionstop, skal du tilføje en tredje model for diffraktionstoppen i Q-området. Når der opnås omtrentlige pasformsværdier for de enkelte spredningspopulationer, skal du slå alle tre sammen til og optimere den kombinerede pasform. Endelig skal du kontrollere, at hver værdi forbliver fysisk rimelig og gemme pasformen ved at vælge butik i mappen.Resultatet af denne procedure bør være en sammensat model, der beskriver de små vinkel x-ray spredning data langt over en lang række størrelse skalaer. Denne protokol blev brugt til at designe, samle og karakterisere nukleinsyre polyelektrolyte komplekse micelles eller PCMs. Micelle kernestørrelse er primært drevet af længden af den ladede blok af blokken copolymer og er stort set uafhængig af længden af homopolymer.Dynamiske lysspælende data blev erhvervet for sfæriske PCM'er dannet af relativt lange blok copolymers i korte enkeltstrengede oligonukleotider. Autokorrelationsfunktionen henfaldet til en flad værdi med den enkelte tidsskala, hvilket resulterede i en enkelt størrelsetop i repIS-størrelsesfordelingen. Komplekse små engel x-ray spredning eller SAXS intensitet spektre kan være præcist passer ved at kombinere modeller for de mange rumlige korrelationer, der er til stede og multiangle lys spredning kan bruges til at udvide spredning målinger til længere længde skalaer.PCMs af varierende morfologi kan også afbildes med elektronmikroskopi for at kontrollere, at kerneradier og -form er i overensstemmelse med de værdier, der opnås ved tilpasning af SAXS-data. Når du tilpasser SAXS-data, er det vigtigt at tage højde for hver spredningsfunktion og bruge gratis metoder som TEM for at sikre, at du bruger den korrekte formfaktor.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Origami Inspired Self-assembly of Patterned and Reconfigurable Particles

Origami Inspireret Selvsamling af mønstret og omkonfigurerbare Particles

There are numerous techniques such as photolithography, electron-beam lithography and soft-lithography that can be used to precisely pattern two ...

Formation of Ordered Biomolecular Structures by the Self-assembly of Short Peptides

Dannelse af Bestilte Biomolekylær Strukturer af Self-samling af korte peptider

In nature, complex functional structures are formed by the self-assembly of biomolecules under mild conditions. Understanding the forces that control ...

Synthesis and Characterization of Functionalized Metal-organic Frameworks

Syntese og karakterisering af funktionaliserede Metal-organisk Frameworks

Metal-organic frameworks have attracted extraordinary amounts of research attention, as they are attractive candidates for numerous industrial and ...

Self-assembly of Complex Two-dimensional Shapes from Single-stranded DNA Tiles

Self-samling af komplekse Todimensionale Former fra Single DNA Fliser

Current methods in DNA nano-architecture have successfully engineered a variety of 2D and 3D structures using principles of self-assembly. In this ...

Preparation and Characterization of Individual and Multi-drug Loaded Physically Entrapped Polymeric Micelles

Forberedelse og karakterisering af individuelle og Multi-drug Loaded Fysisk indesluttet polymermiceller

Amphiphilic block copolymers like polyethyleneglycol-block-polylactic acid (PEG-b-PLA) can self-assemble into micelles above their critical micellar ...

Synthesis and Characterization of Supramolecular Colloids

Syntese og karakterisering af supramolekylære Colloids

Control over colloidal assembly is of utmost importance for the development of functional colloidal materials with tailored structural and mechanical ...

On-line Analysis of Nitrogen Containing Compounds in Complex Hydrocarbon Matrixes

On-line analyse af nitrogenholdige forbindelser i Kompleks kulbrintestof Matricer

The shift to heavy crude oils and the use of alternative fossil resources such as shale oil are a challenge for the petrochemical industry. The ...

Facile Synthesis of Worm-like Micelles by Visible Light Mediated Dispersion Polymerization Using Photoredox Catalyst

Facile Syntese af ormelignende Miceller af synligt lys Mediated Dispersion polymerisering Brug Photoredox Catalyst

Presented herein is a protocol for the facile synthesis of worm-like micelles by visible light mediated dispersion polymerization. This approach begins ...

Anionic Polymerization of an Amphiphilic Copolymer for Preparation of Block Copolymer Micelles Stabilized by &#960;-&#960; Stacking Interactions

Anionic Polymerization of an Amphiphilic Copolymer for Preparation of Block Copolymer Micelles Stabilized by ÃƒÆ’Ã‚ÂÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬-ÃƒÆ’Ã‚ÂÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ Stacking Interactions

Anionisk polymerisation af en amfifil Copolymer for Udarbejdelse af blokcopolymer Miceller stabiliseret af π-Tr Stacking Interaktioner

In this study, an amphiphilic copolymer that includes a core-forming block with phenyl groups was synthesized by living anionic polymerization of phenyl ...

Preparation and Characterization of C60/Graphene Hybrid Nanostructures

Preparation and Characterization of C60/Graphene Hybrid Nanostructures

Forberedelse og karakterisering af C60/Graphene Hybrid nanostrukturer

Physical thermal deposition in a high vacuum environment is a clean and controllable method for fabricating novel molecular nanostructures on graphene. We ...