Name: assembly and characterization of polyelectrolyte complex micelles
Uploaded: 2020-03-02T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assembly and Characterization of Polyelectrolyte Complex Micelles at JoVE.com

We danken Phil Griffin en Tera Lavoie van de Soft Matter Characterization Facility en Advanced Electron Microscopy Facility, respectievelijk, aan de Universiteit van Chicago. We danken xiaobing Zuo en Soenke Seifert van de Advanced Photon Source bij Argonne National Laboratory en NIST Center for Hierarchical Materials Design (CHiMaD) voor ondersteuning. Wij danken Jeff Ting en Michael Lueckheide voor hun bijdragen aan dit werk.

1. Bereiding van materialen
<ol><li>Weeg lyophilized diblock polymeer af en voeg water toe tot bijna het volume dat nodig is voor een voorraadoplossing van 10 mg/mL eindconcentratie. Vortex op maximale snelheid voor 2 min.</li>
	<li>Sonicate voor 5 min. Zeer lange diblocks kan extra sonicatie vereisen. De voorraadoplossing moet volledig transparant en homogeen lijken.</li>
	<li>Pas de pH indien nodig aan op 7,4 met NaOH of HCl. Voeg water toe aan het uiteindelijke volume. pLys-PEG-oplossingen zijn vrij stabiel, maar mo...

Zoals hierboven vermeld, zijn de hier gepresenteerde protocollen geschreven met een focus op oligonucleotiden als de polyanioncomponent en pLys-PEG als kationisch-neutraal blokcopolymeer, maar we hebben ze getest met een verscheidenheid aan polymeren, zoals poly(acrylzuur), polyglutamaat en PEG-poly (vinylbenzyl trimethylammonium), en geloven dat ze over het algemeen toepasbaar zullen zijn voor de meeste polyelektrolyserparen. Een parameter die kan moeten worden geoptimaliseerd is de zoutconcentratie die wordt gebruikt v...

Wanneer omgekeerd geladen polyelektrolyten worden gemengd in waterige oplossing, entropie winst van het vrijkomen van hun tegenwerking veroorzaakt devermenging van de oplossing in een polymeer-rijke gecondenseerde fase en een polymeer-uitgeputsupernatant1,2,3,4,5, een fenomeen bekend als polyelektrolyt complexatie. Als een neutraal hydrofiel blok wordt geconjugeerd tot een of beide van de polyelektrolyten, nanoschaal fasescheiding vindt plaats plaats plaats (figuur 1A). De resulterende zelfgeassembleerde kern-shell nanodeeltjes worden verschillende woorden genoemd als polyelektrolyt complexe micelles (PCMs), polyion complex micelles, blok ionomer complexen, of coacervate-core micelles naar analogie van oppervlakteactieve micellization, hoewel alle componenten van het systeem hydrofiel6,7zijn. Het vermogen van een PCM om hydrofiele moleculen zoals eiwitten en nucleïnezuren in te kapselen, evenals de uitgebreide tunability die wordt aangeboden door de architectuur van de blokcopolymeerdrager maakt hen aantrekkelijke kandidaten voor het leveren van therapeutische moleculen in vivo8,9,10,11,12,13.
Het leveren van therapeutische nucleïnezuren aan cellulaire doelen is een bijzonder belangrijke uitdaging, waarvoor PCMs verschillende voordelen bieden. Therapeutische nucleïnezuren (genetisch DNA, mRNA en oligonucleotiden zoals siRNA) hebben een enorm potentieel voor het verbeteren van de menselijke gezondheid, maar moeten tal van biologische en fysieke barrières overwinnen om te beseffen dat potentieel14,15,16. Kale nucleïnezuren worden afgebroken door serum en cellulaire nucleases, worden snel uit de bloedsomloop gewist en hun sterke negatieve lading maakt het moeilijk voor hen om celmembranen zonder hulp binnen te dringen. De huidige benaderingen voor het overwinnen van deze barrières omvatten kostbare chemische wijzigingen om schade door nucleases en/of inkapseling in verschillende lipide nanodeeltjes te voorkomen die via hydrofobe interacties worden geassembleerd15,17,18. Hoewel deze methoden effectief zijn gebleken voor lokale injecties en levertargeting, biedt systemisch gebruik aanzienlijke beperkingen van toxiciteit, immunogeniciteit en beperkte biodistributie16. PPC's gebruiken daarentegen de negatieve lading nucleïnezuren om ze te condenseren binnen de geleidelijk gescheiden kern, terwijl de neutrale corona een steric barrière tegen degradatie biedt, evenals een platform voor het opnemen van liganden om targeting of internalisatie te verbeteren11,19. In vitro en dierlijke studies hebben aangetoond dat PSO's effectief kunnen leveren verschillende nucleïnezuur payloads20,21,22,23,24, maar zwakke punten in ons vermogen om PCM eigenschappen zoals grootte, vorm en stabiliteit te voorspellen van de eigenschappen van de samenstellende polymeren hebben belemmerd hun bredere adoptie.
Recent werk van onze groep en anderen in het veld is begonnen met het aanpakken van dit probleem door het ontwikkelen van structuur-eigendom, en in sommige gevallen structuur-eigendom-functie relaties voor PPC's gevormd uit nucleïnezuren en diverse kationische-neutrale polymeren7,25,26,27. Twee consistente thema's die uit deze studies naar voren zijn gekomen, zijn het belang van het ontwikkelen van goed gecontroleerde, herhaalbare protocollen voor PCM-assemblage en het voordeel van het gebruik van meerdere technieken om de resulterende nanodeeltjes te karakteriseren. Polyelektrolyten, met name die met een hoge ladingsdichtheid zoals nucleïnezuren, interageren zeer sterk met elkaar en lijken gemakkelijk kinetisch gevangen te raken bij het mengen, wat resulteert in PCM-preparaten die zeer gevoelig zijn voor kleine variaties in de procedure en hoge polydispersie en slechte herhaalbaarheid van batch tot batch weergeven. Pcms is ook aangetoond dat een breed scala van vormen en maten vast te stellen, afhankelijk van de atomaire-niveau configuraties van hun componenten, en het vastleggen van deze diversiteit met een individuele karakterisering techniek is zeer moeilijk, vooral omdat sommige gemeenschappelijke technieken zoals dynamische lichtverstrooiing (DLS) vereisen veronderstellingen over deeltjesvorm voor hun interpretatie.
In dit artikel bespreken we materiaalontwerp en selectie voor PCM's, met een focus op oligonucleotiden en kationisch-neutrale diblock copolymeren. Vervolgens beschrijven we een zoutannealingprotocol dat hoge zoutconcentraties gebruikt, gevolgd door langzame dialyse om kinetische begtoepassing tijdens PCM-assemblage te voorkomen. De polyelektrolyten worden gemengd in hoge zoutomstandigheden waar elektrostatische attracties worden gescreend, dan wordt de zoutconcentratie langzaam verlaagd om de polyelektrolyten zich te laten vestigen in hun meest energetisch gunstige configuraties, analoog aan het langzame koelproces van thermische annealing. Met behulp van dit protocol zijn we regelmatig in staat om uitzonderlijk lage polydispersie en hoge herhaalbaarheid voor oligonucleotide PCMs7,26te bereiken. Tot slot beschrijven we hoe vier afzonderlijke meettechnieken kunnen worden gebruikt om PCM's te karakteriseren over een zeer breed scala aan lengteschalen, van externe morfologie tot interne structuur: DLS, multi-angle lichtverstrooiing (MALS), kleine hoek X-ray verstrooiing (SAXS) en transmissieelektronenmicroscopie (TEM). We hopen dat deze protocollen meer onderzoekers in staat zullen stellen om effectief de mogelijkheden van deze interessante nanodeeltjes te verkennen.
Polymeerselectie en -voorbereiding PCM-eigenschappen worden sterk beïnvloed door de fysische en chemische kenmerken van de samenstellende polymeren, waardoor polymeerselectie een cruciale stap is in het ontwerpproces. De meest goed gekarakteriseerde blokcopolymeren voor nucleïnezuur PM's zijn lineaire diblokken zoals poly(lysine)-poly(ethyleenglycol) (pLys-PEG), maar PcM's kunnen worden gevormd tussen polyelektrolyten en een verscheidenheid aan hydrofiele neutrale polymeren, die op een hoge doorvoerwijze kunnen worden gegenereerd28. De keuze van de geladen groep heeft een sterke invloed op de stabiliteit van ionenkoppeling en vorm van micelles26, en de PCM-grootte is aangetoond te verhogen met de lengte van het in rekening gebrachte blok5,7,26 (figuur 2), waardoor PCM-eigenschappen kunnen worden afgestemd op de eisen van een gewenste toepassing. Voor lineaire diblocks hebben we vastgesteld dat het opgeladen blok ten minste 10 ladingen moet hebben en sterk moet worden opgeladen bij de gewenste pH. Langere geladen blokken kunnen de PCM-vorming bevorderen met oligonucleotiden zoals siRNA, die moeilijk te complex zijn met kortere blokken21. We hebben met succes waargenomen PCM vorming met blok lengtes tot 200, en de literatuur beschrijft langere polymeren. Meer flexibiliteit is beschikbaar in de keuze van neutrale blokken24,maar de ervaring heeft geleerd dat zeer korte neutrale blokken leiden tot aggregatie in plaats van nanodeeltjesvorming, en dat de minimale neutrale lengte toeneemt met geladen bloklengte. Voor pLys-PEG is een PEG MW van ten minste 3.000-5.000 vereist voor pLys-lengtes onder ~ 50, en langere lengtes zijn vereist omdat het opgeladen blok verder wordt verhoogd. Verhoogde neutrale bloklengte resulteert in een grotere PCM-grootte, met name shell dikte, als gevolg van steric verdringing van de neutrale polymeren.
Dit manuscript presenteert een protocol voor de voorbereiding van PcMs van lyophilized hoge zuiverheid pLys-PEG en oligonucleotiden van bekende hoeveelheid, maar moet gemakkelijk aanpasbaar zijn aan andere systemen ook. We hebben het met succes getest met verschillende geladen polypeptiden, waaronder polyarginine en polyglutaminezuur, evenals verschillende synthetische polyelektrolyten, zoals polyacrylzuur en poly(vinylbenzyl trimethylammonium). We beschrijven ook het voorbereiden van PCM's met een stoichiometrische verhouding van polyelektrolytladingen, maar dit is eenvoudig te wijzigen. Wij vinden het het gemakkelijkst om te werken in charge concentration units (c.c.), die ook natuurlijk geschikt is voor polymeren die niet volledig zijn opgeladen. Als een van beide polymeren niet goed wordt gekarakteriseerd, moet ervoor worden gezorgd dat de polymeerlengtes/massa's nauwkeurig worden bepaald en ervoor moet worden gezorgd dat overtollig zout niet aanwezig is dan bijvoorbeeld die nodig is voor ladingsneutralisatie door dialyse. Bij de berekening van de concentraties moet ook rekening worden gehouden met de aanwezigheid van vastgehouden water. De nucleïnezuurconcentratie kan gemakkelijk worden gekwantificeerd door absorptie bij 260 nm, en bij de berekening van de c.c. moet rekening worden gehouden met de aanwezigheid of afwezigheid van eindfosfaten.
Bij het gebruik van oligonucleotiden als polyanionen helpen de hybridisatietoestand en de chemische structuur de neiging tot zelfassemblage en de kenmerken van het resulterende PCM5,7,26. Het optimaliseren van deze, binnen de eisen voor biologische werkzaamheid bij het gebruik van PCMs voor de levering, zal de kans op het vormen van de gewenste structuren verhogen. Handige tools voor het analyseren van hybridisatie zijn MATLAB-functies voor nuclezuren, NUPACK29en IDT OligoAnalyzer. We raden aan om een kandidaatsequentie te analyseren om de sterkte van binding tot 1) zelf te begrijpen in een haarspeldformatie; 2) een andere kopie van dezelfde sequentie (zelfdimmer); en 3) naar andere oligonucleotiden die in het systeem aanwezig zijn. DNA- en RNA-smelttemperaturen voor een specifieke sequentie kunnen ook worden berekend met behulp van de dichtstbijzijnde buurmethode30,31. Thermische annealing van nucleïnezuren (stap 2.3) denatureert elke resterende secundaire structuur in de individuele nucleotiden en bevordert evenwichtvouwen.
PCM-karakterisering en -analyse Een breed scala aan technieken zijn beschikbaar voor het karakteriseren van nanodeeltjes, waaronder statische en dynamische lichtverstrooiing, kleine hoekverstrooiing van elektronen of neutronen, en elektronenmicroscopie. In dit artikel bieden we protocollen voor twee lichtverstrooiingstechnieken, kleine hoek-röntgenverstrooiing en twee elektronenmicroscopietechnieken.
DLS meet de autocorrelatie van temporele schommelingen in verstrooiingsintensiteit onder één hoek van brownse beweging van het monster. Het aanbrengen van deze gegevens kan hydrodynamische straal en polydispersie voor sferische micelles(figuur 3)bieden. Meervoudige hoek lichtverstrooiing (MALS) meet de statische verstrooiingintensiteit onder vele hoeken. Deze hoekige afhankelijkheid beschrijft de vorm van het nanodeeltje, maar is beperkt tot lengteschalen langer dan ~ 50 nm voor zichtbaar licht, wat de effectiviteit ervan voor kleinere nanodeeltjes beperkt. Beide technieken zijn gebaseerd op refractieve index mismatch en beschrijven vooral de buitenafmetingen van het nanodeeltje.
Kleine hoek X-ray verstrooiing (SAXS) maakt gebruik van röntgenstralen als de verstrooiing sonde, en hun kortere golflengte maakt metingen over een bereik van ~ 0,1-100 nm. Het passen van de waargenomen verstrooiingsintensiteit versus hoek (conventioneel uitgedrukt als momentum transfer q)geeft informatie over PCM morfologie (d.w.z. grootte en vorm) en ook interne structuur. Als er een absolute intensiteitskalibratie beschikbaar is en als de verstrooiingsintensiteit naar nulhoek kan worden geëxtrapoleerd, kunnen pcmmassa en aggregatienummer ook worden geschat op32,waardoor SAXS een uiterst veelzijdige en waardevolle methode is. Kleine hoek neutronenverstrooiing (SANS) is gevoelig over een vergelijkbaar bereik van lengteschalen, maar is alleen beschikbaar in gespecialiseerde faciliteiten en zal niet expliciet worden besproken in dit artikel33,34,35.
De afgelopen jaren hebben gezien de komst van benchtop SAXS instrumenten, maar we vinden dat synchrotron bronnen zijn beter geschikt voor PCM karakterisering, omdat hun hogere intensiteit maakt het mogelijk om gegevens te worden verzameld veel sneller voor deze low-contrast monsters. We bieden een kort protocol voor het verkrijgen van PCM SAXS-gegevens bij Beamline 12-ID-B in het Advanced Photon Source (Argonne National Laboratory, USA) vanuit een gebruikersperspectief. Dit protocol moet van toepassing zijn op de meeste synchrotronbronnen, maar overleg met lokale medewerkers alvorens een experiment voor te stellen wordt ten zeerste aanbevolen. We bieden ook een data reduction en analyse protocol met behulp van Irena36, een gratis set van macro's geschreven voor Igor Pro. Irena bevat een veelzijdige set vormfactoren voor het modelleren van SAXS-gegevens en maakt de bouw mogelijk van multicomponentmodellen die in staat zijn het complexe verstrooiingsprofiel van PCM's te beschrijven (zie representatieve resultaten, figuur 4). Irena heeft ook uitgebreide documentatie en tutorials online beschikbaar. Voordat u de onderstaande procedures probeert, raden we u aan deze te vertrouwd maken, met name de zelfstudie "Modellering van SAXS-gegevens met twee belangrijke verstrooiingspopulaties".
Stralingsschade is een zorg voor röntgenverstrooiing, maar er kunnen verschillende maatregelen worden genomen om het te minimaliseren. In het bijzonder raden we aan om een flowcell setup te gebruiken met een spuitpomp en PCM-monster dat stroomt tijdens het verkrijgen van gegevens, in plaats van een verzegelde capillaire. Dit vereenvoudigt ook de aftrekking van de achtergrond sterk. We raden ook aan om meerdere blootstellingen van het stromende monster te nemen in plaats van één langer om de flux te beperken die een enkel volume van de steekproef ziet en om vergelijking van de blootstellingsgegevens mogelijk te maken om eventuele schade te identificeren.
In tegenstelling tot de verstrooiingstechnieken, die over het algemeen montage nodig hebben om te interpreteren, biedt transmissieelektronenmicroscopie (TEM) een echt ruimtevisueel beeld van de nanodeeltjes door een elektronenstraal door het monster te laten lopen en een beeld te projecteren op een scintillatiescherm(figuur 5). We presenteren protocollen voor twee TEM-technieken in dit artikel. Cryo TEM bevriest micelle monsters in een dunne laag glasijs, met behoud van structurele bevleesdheid met minimale vreemde stoffen, optimaal voor micelles ≤~10-100 nm in straal. Negatieve vlek TEM gebruikt een zwaar metaalzout (bijvoorbeeld uranium) om het monster te omringen nadat het op het oppervlak van een raster is gedroogd. De dichte vlek zal meer elektronen verspreiden dan het monster, het toevoegen van contrast en het produceren van een negatief beeld van het monster. Cryo TEM wordt aanbevolen voor afbeeldingen van hoge kwaliteit. Het is echter duurder, tijdrovender en biedt mogelijk niet voldoende contrast. Wanneer dit een probleem is, moeten negatieve gekleurde monsters worden gebruikt. Voorbeelden van elk zijn weergegeven in figuur 5.
Elk van deze technieken rapporteert over iets verschillende aspecten van de nanodeeltjes, met verschillende sterke punten en beperkingen. Lichtverstrooiing is direct beschikbaar, en is vaak de snelste aanpak, maar heeft aanzienlijke beperkingen in grootte en vormresolutie. SAXS kan informatie verstrekken over een groot aantal lengteschalen bij een redelijk hoge doorvoer, maar vereist gespecialiseerde apparatuur om de gegevens te verkrijgen, evenals modellering om het te interpreteren. TEM-afbeeldingen zijn eenvoudig te interpreteren, maar kunnen in contrast worden beperkt en zijn inherent lage doorvoer. Onze ervaring heeft aangetoond dat het gebruik van meerdere technieken voor karakterisering de informatie die kan worden verkregen over PCM-eigenschappen sterk verhoogt en de interpretatie van gegevenssets die alleen van elk afzonderlijk zijn verkregen, vereenvoudigt. Saxs en TEM onderzoeken bijvoorbeeld voornamelijk de dichte kern van een PCM, terwijl lichtverstrooiingsrapporten over de totale afmetingen van het nanodeeltje. Zo, het combineren van hen maakt het mogelijk meting van zowel de kern en corona grootte. Tem's vermogen om echte ruimtebeelden te verkrijgen, kan grondwaarheidsgegevens opleveren om de selectie van geschikte vormfactoren voor het modelleren van SAXS-gegevens mogelijk te maken die anders dubbelzinnig zouden kunnen zijn. Dit artikel beschrijft protocollen voor alle vier de technieken, en een voorbeeldproces voor het gebruik ervan om een onbekend monster te karakteriseren wordt gegeven in de sectie Discussie.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>70 mm circle filter paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1001-070</td>
			<td>Filter paper for wicking during grid prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon Film TEM grid</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>CF200-Cu</td>
			<td>TEM grid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAWN</td>
			<td>Wyatt Technology</td>
			<td>DAWN</td>
			<td>MALS instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA oligonucleotide</td>
			<td>Integrated DNA Nanotechnologies Inc</td>
			<td></td>
			<td>Custom oligonucleotide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lacey Carbon TEM grid</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>LC200-Cu</td>
			<td>TEM grid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methoxy-poly(ethylene glycol)-block-poly(l-lysine hydrochloride) PEG5k - PLKC50</td>
			<td>Alamanda Polymers Inc</td>
			<td>mPEG5K-b-PLKC50</td>
			<td>Example block copolymer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td></td>
			<td>Ultrapure water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>For measuring nucleic acid concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>negative-action tweezers</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>N7</td>
			<td>Tweezers for grid preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm &#34;M&#34;</td>
			<td>Bemis Company Inc</td>
			<td>PM996</td>
			<td>Laboratory film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantifoil Holey Carbon TEM grid</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>Q210CR1.3</td>
			<td>TEM grid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Research Goniometer and Laser Light Scattering System</td>
			<td>Brookhaven Instruments</td>
			<td>BI-200SM</td>
			<td>DLS/MALS instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide-A-Lyzer G2 2K 0.5 mL</td>
			<td>Thermo Scientific Pierce Protein Biology</td>
			<td>87723</td>
			<td>Dialysis cartridge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>small volume cuvette</td>
			<td>Brookhaven Instruments</td>
			<td>BI-SVC</td>
			<td>Cuvette for DLS/MALS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solarus 950 Advanced Plasma System</td>
			<td>Gatan</td>
			<td>Solarus 950</td>
			<td>Plasma system for TEM grids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Talos TEM</td>
			<td>FEI</td>
			<td>Talos</td>
			<td>TEM used for cryo samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tecnai Spirit TEM</td>
			<td>FEI</td>
			<td>Spirit</td>
			<td>TEM used for dry samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl Formate</td>
			<td>SPI-Chem</td>
			<td>16984-59-1</td>
			<td>For negative staining samples for TEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitrobot</td>
			<td>FEI</td>
			<td>Vitrobot</td>
			<td>Vitrification robot for cryo grid preparation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assembly and characterization of polyelectrolyte complex micelles

Polyelektrolyt complexe micelles (PCMs), core-shell nanodeeltjes gevormd door zelfassemblage van geladen polymeren in waterige oplossing, bieden een krachtig platform voor het verkennen van de fysica van polyelektrolyt interacties en bieden ook een veelbelovende oplossing het dringende probleem van het leveren van therapeutische oligonucleotiden in vivo. Het ontwikkelen van voorspellende structuur-eigenschap relaties voor PCMs is moeilijk gebleken, deels te wijten aan de aanwezigheid van sterke kinetische vallen tijdens nanodeeltjes zelfassemblage. Dit artikel bespreekt criteria voor het kiezen van polymeren voor PCM-constructie en biedt protocollen op basis van zoutannealing die het mogelijk maken om herhaalbare, laag-polydispersiaire nanodeeltjes samen te stellen. We bespreken ook PCM-karakterisering met behulp van lichtverstrooiing, kleine röntgenverstrooiing en elektronenmicroscopie.

Om de hierboven beschreven karakteriseringsmethoden te illustreren, tonen we typische resultaten voor PCB's die zijn samengesteld uit oligonucleotiden en blokcopolymeren van verschillende lengtes en chemie (figuur 1). Figuur 2 geeft een voorbeeld van hoe de PCM-kerngrootte (zoals bepaald op basis van SAXS en TEM, figuur 4 en figuur 5)varieerde met de opgeladen bloklengte. Figuur 3</...

Watch this Scientific Journal Video about Assembly and Characterization of Polyelectrolyte Complex Micelles at JoVE.com

Assembly and Characterization of Polyelectrolyte Complex Micelles

We bieden protocollen en representatieve gegevens voor het ontwerpen, assembleren en karakteriseren van polyelektrolyt complexe micelles, core-shell nanodeeltjes gevormd door polyelektrolyten en hydrofielgeladen-niet-geladen blokcopolymeren.

Montage en karakterisering van Polyelectrolyte Complex Micelles

Polyelectrolyte complex micelles (PCMs), core-shell nanoparticles formed by self-assembly of charged polymers in aqueous solution, provide a powerful ...

Deze methode beschrijft het volledige pad van het ontwerp, de assemblage en de karakterisering van polyelectrolyt complexe micelles die nanodeeltjes zijn die worden gevormd uit de zelfassemblage van tegenovergesteld geladen polymeren. Enkele grote uitdagingen met polyelectrolyt zelfassemblage zijn het vermijden van kinetische vallen en het karakteriseren van de nanodeeltjes. De zout annealing techniek die we beschrijven zorgt voor de herhaalbare assemblage van micelles met een lage spreiding in zowel grootte en vorm en we beschrijven karakterisering methoden met inbegrip van licht verstrooiing, kleine hoek x-ray verstrooiing, en elektronenmicroscopie.Het leveren van therapeutische nucleïnezuren is een langdurige uitdaging voor nanogeneeskunde. Deze polyelectrolyt complexe micelles profiteren van de sterke negatieve lading van het nucleïnezuur om ze af te nemen in de kern van de micelle waar de neutrale polymeer corona hen beschermt tegen nucleases en immuunrespons. De montagemethode moet van toepassing zijn op elk type geladen polymeren.We hebben ze getest met verschillende polyanionen en polycaties en de karakteriseringsmethode moet van toepassing zijn op alle zelf geassembleerde nanodeeltjes, waaronder oppervlakteactieve nanodeeltjes en andere hydrofoobisch aangedreven systemen. Begin met het uitbroeden van de oligonucleotide oplossing bij 70 graden Celsius gedurende vijf minuten. Na de incubatie, koel het gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur om thermisch anneal de nucleïnezuren, voeg vervolgens 40 microliters van 20 millimolar geladen concentratie diblock copolymeer.Vortex de oplossing onmiddellijk en incubeer het gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Om het zout anneal uit te voeren, voeg natriumchloride oplossing aan de oligonucleotide oplossing voor een laatste concentratie van een kies en vortex gedurende 10 seconden op maximale snelheid. Incubeer het mengsel gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur en ga vervolgens verder met het laden in de dialysecartridge.Voorafgaand aan het laden, label cartridges met permanente marker en laat ze in buffer gedurende ten minste twee minuten om de membranen hydrateren. Verwijder de dop door tegen de klok in te draaien en laad het monster met behulp van een gel laden pipet tip. Knijp voorzichtig in het membraan om overtollige lucht te verwijderen en vervang de dop.Doe de cartridges in 1X PBS 0,5 molaire natriumchloride dialyse bad ervoor te zorgen dat ze drijven met beide membranen blootgesteld aan het bad. Breng de cartridges na 24 uur over in 1X PBS en laat het 24 uur extra weken. Na de laatste dialyse u het monster herstellen door de cartridges uit het bad te verwijderen, de dop te verwijderen en het monster te verwijderen met een gelladenpipetpunt.Doe het monster in een schone microcentrifugebuis van 1,5 milliliter en koel het tot het gebruiksklaar is. Bereid het monster in DLS-instrument volgens manuscriptaanwijzingen en verwerf vervolgens gegevens gedurende ten minste één minuut om ervoor te zorgen dat het telpercentage constant is gedurende de gehele acquisitietijd. Controleer de gegevens over autocorrelatie.De lange tijd baseline moet vlak zijn en de autocorrelatie curve moet glad zijn met minimale spreiding. Ruis in de gegevens kan worden verbeterd door het verwerven van meer gegevens. Om gegevensreductie en -analyse uit te voeren met Irena, moet u beginnen met het importeren van micelle in achtergrondgegevenssets.Plot het voorbeeld en de achtergrond samen op een logboekschaal en berekent de verhouding tussen voorbeeld en achtergrond en controleer de hoge Q-asymptote. Bereken de gemiddelde verhouding over dit Q-bereik en gebruik de macro voor gegevensmanipulatie om de achtergrond te schalen met de berekende verhouding. Plot vervolgens het afgetrokken signaal op de achtergrond boven Q en sla de gegevens op met een nieuwe naam, zodat u ervoor zorgt dat de oorspronkelijke gegevens niet worden overschreven.Open de modelleringsmacro en laad en plot de afgetrokken gegevens op de achtergrond. Als u een bij benadering model wilt vinden voor het externe oppervlak van de polyelectrolyte complexe micelle of PCM, selecteert u stroom naar matige Q-bereik in de gegevensbesturingselementen, zodat u schommelingen wilt opnemen als deze aanwezig zijn. Selecteer in modelbesturingselementen de eerste verstrooiingspopulatie en zorg ervoor dat deze de enige is die wordt gebruikt.Selecteer grootteverdeling voor model, kies het gewenste distributietype en selecteer de formulierfactor. Dit voorbeeld is voor een flexibele cilinder die handmatig moet worden toegevoegd onder de gebruikersvormfactor. Download en voeg de flexibele cilindervormfactor toe en voer vervolgens de functienamen en de initiële waarden in voor parameters één en twee die overeenkomen met de lengte van de cilinder en de Kuhn-lengte.Deze cilinders zijn langer dan kan worden opgelost door SAXS, zodat de cilinder lengte parameter is vastgesteld op een grote waarde. Stel de eerste parameters voor het zoeken in door waarden in te voeren in de schaal-, gemiddelde grootte- en breedtevelden. Klik vervolgens op model berekenen om de resulterende vormfactor te tekenen.Zodra redelijke parameters zijn gevonden, klikt u op fit model om een niet-lineaire minst vierkanten uit te voeren die passen bij de gegevens. Modelleer vervolgens de verstrooiing van de afzonderlijke polymeren in de PCM-kern. Pas de gegevensbesturingselementen aan om het Q-bereik te selecteren waar overmatige spreiding optreedt die meestal in het matige tot hoge bereik is.Voeg een tweede verstrooiende populatie toe en zorg ervoor dat dit de enige is die in gebruik is. Selecteer een uniform niveau voor het model, pas de GDA-factoren G en RG aan om ervoor te zorgen dat het model geen overmatige verstrooiing bij lage Q voorspelt en gebruik de geschikte PB tussen cursors macro om een eerste schatting voor deze parameters te verkrijgen. Wat betreft de form factor, voer een niet-lineaire pasvorm voor het uniforme niveau model.Als er een diffractiepiek aanwezig is, voeg dan een derde model toe voor de diffractiepiek in het Q-bereik van belang. Zodra benaderende fit waarden zijn verkregen voor de individuele verstrooiingspopulaties, schakel u alle drie samen in en optimaliseert u de gecombineerde pasvorm. Controleer ten slotte of elke waarde fysiek redelijk blijft en sla de pasvorm op door winkel in map te selecteren.Het resultaat van deze procedure moet een samengesteld model zijn dat de kleine hoek x-ray verstrooiingsgegevens over een groot aantal grootteschalen beschrijft. Dit protocol werd gebruikt voor het ontwerpen, monteren en karakteriseren van nucleïnezuur polyelectrolyte complexe micelles of PCMs. Micelle kerngrootte wordt voornamelijk gedreven door de lengte van het geladen blok van het blok copolymeer en is grotendeels onafhankelijk van de lengte van het homopolymeer.Dynamische lichtverstrooiingsgegevens werden verkregen voor bolvormige PCM's gevormd uit relatief lange blokcopolymeren in korte enkelstrengs oligonucleotiden. De autocorrelatiefunctie is vervallen tot een vlakke waarde met de enkele tijdschaal, wat resulteert in de enkele groottepiek in de respuitingsgrootteverdeling. Complexe kleine engel x-ray verstrooiing of SAXS intensiteit spectra kan nauwkeurig worden aangepast door het combineren van modellen voor de meerdere ruimtelijke correlaties die aanwezig zijn en multiangle lichtverstrooiing kan worden gebruikt om verstrooiingsmetingen uit te breiden tot langere lengte schalen.PCM's van verschillende morfologie kunnen ook worden afgebeeld met elektronenmicroscopie om te controleren of kernstralen en -vorm in overeenstemming zijn met de waarden die worden verkregen uit het monteren van SAXS-gegevens. Bij het aanpassen van SAXS-gegevens is het belangrijk om rekening te houden met elke verstrooiingsfunctie en om gratis methoden zoals TEM te gebruiken om ervoor te zorgen dat u de juiste vormfactor gebruikt.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Origami Inspired Self-assembly of Patterned and Reconfigurable Particles

Origami Inspired Zelf-assemblage van Patterned en Herconfigureerbare Deeltjes

There are numerous techniques such as photolithography, electron-beam lithography and soft-lithography that can be used to precisely pattern two ...

Formation of Ordered Biomolecular Structures by the Self-assembly of Short Peptides

Vorming van Bestelde Biomoleculaire structuren door de zelf-assemblage van korte peptiden

In nature, complex functional structures are formed by the self-assembly of biomolecules under mild conditions. Understanding the forces that control ...

Synthesis and Characterization of Functionalized Metal-organic Frameworks

Synthese en karakterisering van gefunctionaliseerde metaal-organische roosters

Metal-organic frameworks have attracted extraordinary amounts of research attention, as they are attractive candidates for numerous industrial and ...

Self-assembly of Complex Two-dimensional Shapes from Single-stranded DNA Tiles

Zelf-assemblage van Complex Tweedimensionaal Vormen van enkelstrengs DNA Tiles

Current methods in DNA nano-architecture have successfully engineered a variety of 2D and 3D structures using principles of self-assembly. In this ...

Preparation and Characterization of Individual and Multi-drug Loaded Physically Entrapped Polymeric Micelles

Bereiding en karakterisering van de individuele en multi-geneesmiddel beladen Fysiek Ingesloten Polymeer Micellen

Amphiphilic block copolymers like polyethyleneglycol-block-polylactic acid (PEG-b-PLA) can self-assemble into micelles above their critical micellar ...

Synthesis and Characterization of Supramolecular Colloids

Synthese en karakterisering van Supramoleculaire colloïden

Control over colloidal assembly is of utmost importance for the development of functional colloidal materials with tailored structural and mechanical ...

On-line Analysis of Nitrogen Containing Compounds in Complex Hydrocarbon Matrixes

On-line analyse van stikstofhoudende verbindingen in Complex Hydrocarbon Matrix

The shift to heavy crude oils and the use of alternative fossil resources such as shale oil are a challenge for the petrochemical industry. The ...

Facile Synthesis of Worm-like Micelles by Visible Light Mediated Dispersion Polymerization Using Photoredox Catalyst

Facile Synthese van Worm-micellen door het zichtbare licht Mediated Dispersion polymerisatie onder toepassing van Photoredox Catalyst

Presented herein is a protocol for the facile synthesis of worm-like micelles by visible light mediated dispersion polymerization. This approach begins ...

Anionic Polymerization of an Amphiphilic Copolymer for Preparation of Block Copolymer Micelles Stabilized by &#960;-&#960; Stacking Interactions

Anionic Polymerization of an Amphiphilic Copolymer for Preparation of Block Copolymer Micelles Stabilized by ÃƒÆ’Ã‚ÂÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬-ÃƒÆ’Ã‚ÂÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ Stacking Interactions

Anionische polymerisatie van een amfifiele copolymeer voor de bereiding van blokcopolymeer micellen gestabiliseerd door π-π stapelen interacties

In this study, an amphiphilic copolymer that includes a core-forming block with phenyl groups was synthesized by living anionic polymerization of phenyl ...

Preparation and Characterization of C60/Graphene Hybrid Nanostructures

Preparation and Characterization of C60/Graphene Hybrid Nanostructures

Bereiding en karakterisatie van C60/Graphene hybride nanostructuren

Physical thermal deposition in a high vacuum environment is a clean and controllable method for fabricating novel molecular nanostructures on graphene. We ...