Name: assembly and characterization of polyelectrolyte complex micelles
Uploaded: 2020-03-02T14:00:00
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Wir danken Phil Griffin und Tera Lavoie von der Soft Matter Characterization Facility bzw. Advanced Electron Microscopy Facility an der University of Chicago. Wir danken auch Xiaobing Zuo und Soenke Seifert von der Advanced Photon Source am Argonne National Laboratory und NIST Center for Hierarchical Materials Design (CHiMaD) für die Unterstützung. Wir danken Jeff Ting und Michael Lueckheide für ihre Beiträge zu dieser Arbeit.

1. Herstellung von Materialien
<ol><li>Wiegen Sie lyophilisiertes Diblockpolymer aus und fügen Sie Wasser bis zu fast dem Volumen hinzu, das für eine Lagerlösung von 10 mg/ml Endkonzentration erforderlich ist. Wirbel mit maximaler Geschwindigkeit für 2 min.</li>
	<li>Beschallen für 5 min. Sehr lange Diblocks können zusätzliche Beschallung erfordern. Die Lagerlösung sollte völlig transparent und homogen erscheinen.</li>
	<li>Stellen Sie den pH-Wert mit NaOH oder HCl nach Bedarf auf 7,4 ein. Fügen Sie dem endig...

Wie oben erwähnt, werden die hier vorgestellten Protokolle mit einem Schwerpunkt auf Oligonukleotiden als Polyanionskomponente und pLys-PEG als kationisch-neutrales Blockcopolymer geschrieben, aber wir haben sie mit einer Vielzahl von Polymeren getestet, wie Poly(Acrylsäure), Polyglutamat und PEG-Poly (Vinylbenzyltrimethylammonium), und glauben, dass sie allgemein für die meisten Polyelektrolytenpaare anwendbar sein werden. Ein Parameter, der möglicherweise optimiert werden muss, ist die Salzkonzentration, die zum Gl...

Wenn entgegengesetzt geladene Polyelektrolyte in wässriger Lösung gemischt werden, bewirkt der Entropiegewinn aus der Freisetzung ihrer Gegensätze eine Demischung der Lösung in eine polymerreiche kondensierte Phase und einen polymeren abbauten Überstand1,2,3,4,5, ein Phänomen, das als Polyelektrolytkomplexierung bekannt ist. Wenn ein neutraler hydrophiler Block mit einem oder beiden Polyelektrolyten konjugiert wird, erfolgt stattdessen eine nanoskalige Phasentrennung (Abbildung 1A). Die resultierenden selbstzusammengesetzten Kernschalen-Nanopartikel werden verschiedentlich als Polyelektrolyt-Komplexmizellen (PCMs), Polyionenkomplex-Mizellen, Blockionomerkomplexe oder Coacervat-Kern-Mizellen analog zur Tensid-Micellisierung bezeichnet, obwohl alle Komponenten des Systems hydrophil6,7sind. Die Fähigkeit eines PCM, hydrophile Moleküle wie Proteine und Nukleinsäuren zu verkapseln, sowie die umfangreiche Tunabilität, die die Blockcopolymerträgerarchitektur bietet, machen sie zu attraktiven Kandidaten für die Lieferung von therapeutischen Molekülen in vivo8,9,10,11,12,13.
Die Bereitstellung von therapeutischen Nukleinsäuren für zelluläre Targets ist eine besonders wichtige Herausforderung, für die PCMs mehrere Vorteile bieten. Therapeutische Nukleinsäuren (genetische DNA, mRNA und Oligonukleotide wie siRNA) haben ein immenses Potenzial zur Verbesserung der menschlichen Gesundheit, müssen aber zahlreiche biologische und physikalische Barrieren überwinden, um dieses Potenzial14,15,16zu erkennen. Nackte Nukleinsäuren werden durch Serum abgebaut und Zellkerne werden schnell aus dem Kreislauf entfernt, und ihre starke negative Ladung macht es ihnen schwer, Zellmembranen ohne Hilfe zu durchdringen. Zu den aktuellen Ansätzen zur Überwindung dieser Barrieren gehören kostspielige chemische Modifikationen, um Schäden durch Nukleasen und/oder Verkapselung in verschiedene Lipid-Nanopartikel zu verhindern, die über hydrophobe Wechselwirkungen15,17,18zusammengesetzt werden. Während sich diese Methoden für lokale Injektionen und Lebertargeting als wirksam erwiesen haben, stellt die systemische Anwendung erhebliche Einschränkungen der Toxizität, Immunogenität und begrenzten Bioverteilung16dar. Im Gegensatz dazu verwenden PCMs die negative Ladung von Nukleinsäuren, um sie innerhalb des phasengetrennten Kerns zu kondensieren, während die neutrale Korona eine serische Barriere gegen Abbau sowie eine Plattform für die Integration von Liganden zur Verbesserung des Targetings oder der Internalisierung11,19bietet. In-vitro- und Tierstudien haben gezeigt, dass PCMs effektiv verschiedene Nukleinsäuren-Nutzlasten liefern können20,21,22,23,24, aber Schwächen in unserer Fähigkeit, PCM-Eigenschaften wie Größe, Form und Stabilität aus den Eigenschaften der konstituierenden Polymere vorherzusagen, haben ihre breitere Akzeptanz behindert.
Jüngste Arbeiten unserer Gruppe und anderer auf diesem Gebiet haben begonnen, dieses Problem durch die Entwicklung von Struktur-Eigenschaft, und in einigen Fällen Struktur-Eigenschaft-Funktions-Beziehungen für PCMs aus Nukleinsäuren und verschiedenen kationisch-neutralen Polymeren7,25,26,27. Zwei konsistente Themen, die aus diesen Studien hervorgegangen sind, sind die Bedeutung der Entwicklung gut kontrollierter, wiederholbarer Protokolle für die PCM-Montage und der Vorteil der Verwendung mehrerer Techniken, um die resultierenden Nanopartikel zu charakterisieren. Polyelektrolyte, insbesondere solche mit hoher Ladungsdichte wie Nukleinsäuren, interagieren sehr stark miteinander und scheinen beim Mischen leicht kinetisch gefangen zu werden, was zu PCM-Präparaten führt, die sehr empfindlich auf kleine Verfahrensschwankungen reagieren und eine hohe Polydispersität und schlechte Wiederholbarkeit von Charge zu Charge aufweisen. PCMs haben auch gezeigt, dass eine breite Palette von Formen und Größen in Abhängigkeit von den atomaren Konfigurationen ihrer Komponenten zu übernehmen, und diese Vielfalt mit jeder individuellen Charakterisierungstechnik zu erfassen ist sehr schwierig, zumal einige gängige Techniken wie dynamische Lichtstreuung (DLS) Annahmen über die Partikelform für ihre Interpretation erfordern.
In diesem Artikel diskutieren wir Materialdesign und -auswahl für PCMs mit schwerpunkt auf Oligonukleotiden und kationisch-neutralen Diblock-Copolymeren. Wir beschreiben dann ein Salzglühprotokoll, das hohe Salzkonzentrationen verwendet, gefolgt von einer langsamen Dialyse, um kinetisches Fangen während der PCM-Montage zu vermeiden. Die Polyelektrolyte werden unter hohen Salzbedingungen gemischt, wo elektrostatische Attraktionen gesiebt werden, dann wird die Salzkonzentration langsam abgesenkt, damit sich die Polyelektrolyte in ihre energetisch günstigsten Konfigurationen einsiedeln können, analog zum langsamen Kühlprozess des thermischen Glühens. Mit diesem Protokoll sind wir regelmäßig in der Lage, eine außergewöhnlich geringe Polydispersität und eine hohe Wiederholbarkeit für Oligonukleotid-PCMs7,26zu erreichen. Schließlich beschreiben wir, wie vier separate Messtechniken verwendet werden können, um PCMs über einen sehr breiten Bereich von Längenskalen zu charakterisieren, von der externen Morphologie bis zur internen Struktur: DLS, Multi-Winkel-Lichtstreuung (MALS), Kleinwinkel-Röntgenstreuung (SAXS) und Transmissionselektronenmikroskopie (TEM). Wir hoffen, dass diese Protokolle es mehr Forschern ermöglichen werden, die Fähigkeiten dieser interessanten Nanopartikel effektiv zu erforschen.
Polymerauswahl und -vorbereitung Die PCM-Eigenschaften werden stark von den physikalischen und chemischen Eigenschaften der konstituierenden Polymere beeinflusst, was die Polymerauswahl zu einem entscheidenden Schritt im Designprozess macht. Die am besten charakterisierten Blockcopolymere für Nukleinsäure-PCMs sind lineare Diblöcke wie Poly(Lysin)-Poly(Ethylenglykol) (pLys-PEG), aber PCMs können zwischen Polyelektrolyten und einer Vielzahl hydrophiler neutral geladener Polymere gebildet werden, die in hoher Durchsatzweise erzeugt werden können28. Die Wahl der geladenen Gruppe wirkt sich stark auf die Stabilität der Ionenpaarung und Form der Mizellen26, und PCM-Größe hat gezeigt, dass mit der Länge des geladenen Blocks5,7,26 ( Abbildung2) zu erhöhen, so dass PCM-Eigenschaften auf die Anforderungen einer gewünschten Anwendung abgestimmt werden. Bei linearen Diblocks haben wir festgestellt, dass der geladene Block mindestens 10 Ladungen haben und beim gewünschten pH-Wert stark aufgeladen sein sollte. Länger geladene Blöcke können die PCM-Bildung mit Oligonukleotiden wie siRNA fördern, die mit kürzeren Blöcken schwer zu komplex sind21. Wir haben erfolgreich PCM-Bildung mit Blocklängen bis zu 200 beobachtet, und die Literatur beschreibt längere Polymere. Bei der Wahl der neutralen Blöcke24ist mehr Flexibilität möglich, aber die Erfahrung hat gezeigt, dass sehr kurze neutrale Blöcke eher zur Aggregation als zur Nanopartikelbildung führen und dass die minimale neutrale Länge mit geladener Blocklänge zunimmt. Für pLys-PEG wird eine PEG MW von mindestens 3.000–5.000 für PLys-Längen unter 50 € benötigt, und längere Längen sind erforderlich, da der geladene Block weiter erhöht wird. Erhöhte neutrale Blocklänge führt zu einer erhöhten PCM-Größe, insbesondere schalendicke, aufgrund der serischen Verdrängung der neutralen Polymere.
Dieses Manuskript enthält ein Protokoll zur Herstellung von PCMs aus lyophilisierten Hochreinheits-PLys-PEG und Oligonukleotiden bekannter Menge, sollte aber auch leicht an andere Systeme angepasst werden können. Wir haben es erfolgreich mit mehreren geladenen Polypeptiden getestet, einschließlich Polyarginin und Polyglutaminsäure, sowie mehreren synthetischen Polyelektrolyten, wie Polyacrylsäure und Poly (Vinylbenzyltrimethylammonium). Wir beschreiben auch die Vorbereitung von PCMs mit einem stoichiometrischen Verhältnis von Polyelektrolytladungen, aber dies kann leicht geändert werden. Wir finden es am einfachsten, in Ladekonzentrationseinheiten (c.c.) zu arbeiten, die natürlich auch Polymere aufnehmen, die nicht vollständig geladen sind. Wenn eines der Polymere nicht gut charakterisiert ist, ist darauf zu achten, dass die Polymerlängen/-massen genau bestimmt werden und dass überschüssiges Salz nicht über das hinaus vorhanden ist, was beispielsweise für die Ladungsneutralisation durch Dialyse erforderlich ist. Bei der Berechnung der Konzentrationen sollte auch das Vorhandensein von zurückgehaltenem Wasser berücksichtigt werden. Die Nukleinsäurekonzentration kann durch Absorption bei 260 nm bequem quantifiziert werden, und das Vorhandensein oder Fehlen von terminalen Phosphaten sollte bei der Berechnung der c.c. berücksichtigt werden.
Bei der Verwendung von Oligonukleotiden als Polyanionen helfen der Hybridisierungszustand und die chemische Struktur, die Neigung zur Selbstmontage und die Eigenschaften des resultierenden PCM5,7,26zu bestimmen. Die Optimierung dieser, innerhalb der Anforderungen an die biologische Wirksamkeit, wenn PCMs für die Lieferung verwendet werden, erhöht die Wahrscheinlichkeit, die gewünschten Strukturen zu bilden. Hilfreiche Werkzeuge zur Analyse der Hybridisierung sind MATLAB-Funktionen für Nukleinsäuren, NUPACK29und IDT OligoAnalyzer. Wir empfehlen, eine Kandidatensequenz zu analysieren, um die Stärke der Bindung an 1) selbst in einer Haarnadelbildung zu verstehen; 2) eine weitere Kopie derselben Sequenz (Selbstanzeige); und 3) an andere oligonukleotide, die im System vorhanden sind. DNA- und RNA-Schmelztemperaturen für eine bestimmte Sequenz können auch mit der Nächsten-Nachbar-Methode30,31berechnet werden. Thermisches Glühen von Nukleinsäuren (Schritt 2.3) denaturiert jede restliche Sekundärstruktur in den einzelnen Nukleotiden und fördert die Gleichgewichtsfaltung.
PCM-Charakterisierung und -analyse Für die Charakterisierung von Nanopartikeln stehen eine breite Palette von Techniken zur Verfügung, einschließlich statischer und dynamischer Lichtstreuung, kleinwinkeliger Streuung von Elektronen oder Neutronen und Elektronenmikroskopie. In diesem Artikel stellen wir Protokolle für zwei Lichtstreuungstechniken, kleine Winkel-Röntgenstreuung und zwei Elektronenmikroskopietechniken bereit.
DLS misst die Autokorrelation zeitlicher Schwankungen der Streuintensität in einem Winkel von der Brownschen Bewegung der Probe. Das Anpassen dieser Daten kann hydrodynamischen Radius und Polydispersität für kugelförmige Mizellen liefern (Abbildung 3). Die Mehrfachwinkellichtstreuung (MALS) misst die statische Streuintensität in vielen Winkeln. Diese Winkelabhängigkeit beschreibt die Form des Nanopartikels, ist aber für sichtbares Licht auf Längenskalen von mehr als 50 nm begrenzt, was seine Wirksamkeit für kleinere Nanopartikel einschränkt. Beide Techniken basieren auf refraktiven Index-Inzimcierungen und beschreiben in erster Linie die äußeren Dimensionen des Nanopartikels.
Die Röntgenstreuung mit kleinen Winkeln (SAXS) verwendet Röntgenstrahlen als Streusonde, und ihre kürzere Wellenlänge ermöglicht Messungen über einen Bereich von 0,1 bis 100 nm. Die Anpassung der beobachteten Streuintensität vs. Winkel (konventionell ausgedrückt als Impulsübertragung q) liefert Informationen über die PCM-Morphologie (d.h. Größe und Form) und auch die interne Struktur. Wenn eine absolute Intensitätskalibrierung verfügbar ist und die Streuintensität auf Nullwinkel extrapoliert werden kann, können PCM-Masse und Aggregationsnummer ebenfallsauf 32geschätzt werden, was SAXS zu einer äußerst vielseitigen und wertvollen Methode macht. Die Kleinwinkel-Neutronenstreuung (SANS) ist über einen ähnlichen Bereich von Längenskalen empfindlich, ist aber nur in spezialisierten Einrichtungen verfügbar und wird in diesem Artikel33,34,35nicht explizit behandelt.
In den letzten Jahren kam es zu SAXS-Instrumenten, aber wir stellen fest, dass Synchrotronquellen besser für die PCM-Charakterisierung geeignet sind, da ihre höhere Intensität es ermöglicht, Daten für diese kontrastreichen Samples viel schneller zu sammeln. Wir bieten ein kurzes Protokoll zum Erfassen von PCM SAXS-Daten bei Beamline 12-ID-B am Advanced Photon Source (Argonne National Laboratory, USA) aus Anwendersicht. Dieses Protokoll sollte für die meisten Synchrotronquellen gelten, aber die Konsultation der lokalen Mitarbeiter vor dem Vorschlag eines Experiments wird dringend empfohlen. Wir bieten auch ein Datenreduktions- und Analyseprotokoll mit Irena36, einem kostenlosen Satz von Makros, die für Igor Pro geschrieben wurden. Irena enthält einen vielseitigen Satz von Formfaktoren für die Modellierung von SAXS-Daten und ermöglicht die Erstellung von Mehrkomponentenmodellen, die in der Lage sind, das komplexe Streuprofil von PCMs zu beschreiben (siehe Repräsentative Ergebnisse, Abbildung 4). Irena hat auch umfassende Dokumentation und Tutorials online zur Verfügung. Bevor Wir die folgenden Verfahren versuchen, empfehlen wir, sich mit diesen vertraut zu machen, insbesondere dem Tutorial "Modellierung von SAXS-Daten mit zwei Hauptstreuerpopulationen".
Strahlenschäden sind ein Problem für die Röntgenstreuung, aber es können mehrere Maßnahmen ergriffen werden, um sie zu minimieren. Insbesondere empfehlen wir die Verwendung eines Durchflusszellenaufbaus mit spritzenpumpe und PCM-Probe, die während der Datenerfassung fließt, anstatt einer versiegelten Kapillare. Dies vereinfacht auch die Hintergrundsubtraktion erheblich. Wir schlagen auch vor, mehrere Expositionen der fließenden Probe anstelle einer längeren zu nehmen, um den Fluss fluss, den jedes einzelne Volumen der Probe sieht, zu begrenzen und einen Vergleich der Expositionsdaten zu ermöglichen, um Schäden zu identifizieren.
Im Gegensatz zu den Streutechniken, die in der Regel eine Interpretation erfordern, liefert die Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) ein reales Raumbild der Nanopartikel, indem sie einen Elektronenstrahl durch die Probe passieren und ein Bild auf einen Szintillationsbildschirm projizieren (Abbildung 5). In diesem Artikel stellen wir Protokolle für zwei TEM-Techniken vor. Cryo TEM friert Micelle-Proben in eine dünne Schicht aus Glaseis ein und bewahrt die strukturelle Konformation mit minimalen Fremdstoffen, optimal für Mizellen im Radius von 10-100 nm. Negativer Fleck TEM verwendet ein Schwermetallsalz (z. B. Uran), um die Probe zu umgeben, nachdem sie auf der Oberfläche eines Gitters getrocknet wurde. Der dichte Fleck wird mehr Elektronen als die Probe streuen, Kontrast hinzufügen und ein negatives Bild der Probe erzeugen. Cryo TEM wird für hochwertige Bilder empfohlen. Es ist jedoch kostspieliger, zeitaufwändiger und bietet möglicherweise keinen ausreichenden Kontrast. Wenn dies ein Problem ist, sollten negative gebeizte Proben verwendet werden. Die beispiele sind in Abbildung 5dargestellt.
Jede dieser Techniken berichtet über leicht unterschiedliche Aspekte der Nanopartikel mit unterschiedlichen Stärken und Einschränkungen. Die Lichtstreuung ist leicht verfügbar und ist oft der schnellste Ansatz, hat jedoch erhebliche Größen- und Formeinschränkungen. SAXS kann Informationen über eine große Anzahl von Längenskalen bei einem relativ hohen Durchsatz bereitstellen, erfordert jedoch spezielle Geräte, um die Daten zu erfassen, sowie die Modellierung, um sie zu interpretieren. TEM-Bilder sind einfach zu interpretieren, können aber im Kontrast begrenzt sein und haben von Natur aus einen niedrigen Durchsatz. Unsere Erfahrung hat gezeigt, dass die Verwendung mehrerer Techniken für die Charakterisierung die Informationen, die über PCM-Eigenschaften erhalten werden können, erheblich erhöht und die Interpretation von Datensätzen vereinfacht, die von jedem einzelnen allein erhalten wurden. So untersuchen SAXS und TEM in erster Linie den dichten Kern eines PCM, während Lichtstreuung über die Gesamtabmessungen des Nanopartikels berichtet. So ermöglicht die Kombination von ihnen die Messung sowohl der Kern- als auch der Koronagröße. Die Fähigkeit von TEM, reale Raumbilder zu erfassen, kann Bodenwahrheitsdaten liefern, um die Auswahl geeigneter Formfaktoren für die Modellierung von SAXS-Daten zu ermöglichen, die andernfalls mehrdeutig sein könnten. In diesem Artikel werden Protokolle für alle vier Techniken beschrieben, und ein Beispielprozess für die Verwendung dieser Methoden zum Charakterisieren eines unbekannten Beispiels ist im Abschnitt Diskussion aufgeführt.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>70 mm circle filter paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1001-070</td>
			<td>Filter paper for wicking during grid prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon Film TEM grid</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>CF200-Cu</td>
			<td>TEM grid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAWN</td>
			<td>Wyatt Technology</td>
			<td>DAWN</td>
			<td>MALS instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA oligonucleotide</td>
			<td>Integrated DNA Nanotechnologies Inc</td>
			<td></td>
			<td>Custom oligonucleotide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lacey Carbon TEM grid</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>LC200-Cu</td>
			<td>TEM grid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methoxy-poly(ethylene glycol)-block-poly(l-lysine hydrochloride) PEG5k - PLKC50</td>
			<td>Alamanda Polymers Inc</td>
			<td>mPEG5K-b-PLKC50</td>
			<td>Example block copolymer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td></td>
			<td>Ultrapure water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>For measuring nucleic acid concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>negative-action tweezers</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>N7</td>
			<td>Tweezers for grid preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm &#34;M&#34;</td>
			<td>Bemis Company Inc</td>
			<td>PM996</td>
			<td>Laboratory film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantifoil Holey Carbon TEM grid</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>Q210CR1.3</td>
			<td>TEM grid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Research Goniometer and Laser Light Scattering System</td>
			<td>Brookhaven Instruments</td>
			<td>BI-200SM</td>
			<td>DLS/MALS instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide-A-Lyzer G2 2K 0.5 mL</td>
			<td>Thermo Scientific Pierce Protein Biology</td>
			<td>87723</td>
			<td>Dialysis cartridge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>small volume cuvette</td>
			<td>Brookhaven Instruments</td>
			<td>BI-SVC</td>
			<td>Cuvette for DLS/MALS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solarus 950 Advanced Plasma System</td>
			<td>Gatan</td>
			<td>Solarus 950</td>
			<td>Plasma system for TEM grids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Talos TEM</td>
			<td>FEI</td>
			<td>Talos</td>
			<td>TEM used for cryo samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tecnai Spirit TEM</td>
			<td>FEI</td>
			<td>Spirit</td>
			<td>TEM used for dry samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl Formate</td>
			<td>SPI-Chem</td>
			<td>16984-59-1</td>
			<td>For negative staining samples for TEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitrobot</td>
			<td>FEI</td>
			<td>Vitrobot</td>
			<td>Vitrification robot for cryo grid preparation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assembly and characterization of polyelectrolyte complex micelles

Polyelektrolyt-Komplexmizellen (PCMs), Kernschalen-Nanopartikel, die durch Selbstmontage geladener Polymere in wässriger Lösung entstehen, bieten eine leistungsstarke Plattform für die Erforschung der Physik von Polyelektrolyt-Wechselwirkungen und bieten zudem eine vielversprechende Lösung für das drängende Problem der Bereitstellung von therapeutischen Oligonukleotiden in vivo. Die Entwicklung prädiktiver Struktur-Eigenschaft-Beziehungen für PCMs hat sich als schwierig erwiesen, zum Teil aufgrund des Vorhandenseins starker kinetischer Fallen während der Nanopartikel-Selbstmontage. Dieser Artikel behandelt Kriterien für die Auswahl von Polymeren für die PCM-Konstruktion und bietet Protokolle auf der Grundlage von Salzglühen, die die Montage von wiederholbaren, polydispersitätsarmen Nanopartikeln ermöglichen. Wir diskutieren auch die PCM-Charakterisierung mittels Lichtstreuung, Kleinwinkel-Röntgenstreuung und Elektronenmikroskopie.

Um die oben beschriebenen Charakterisierungsmethoden zu veranschaulichen, zeigen wir typische Ergebnisse für PCMs, die aus Oligonukleotiden und Blockcopolymeren unterschiedlicher Länge und Chemie zusammengesetzt sind (Abbildung 1). Abbildung 2 zeigt ein Beispiel dafür, wie die PCM-Kerngröße (wie aus SAXS und TEM ermittelt, Abbildung 4 und Abbildung 5)mit der geladenen Blocklänge variiert e.V. <str...

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Assembly and Characterization of Polyelectrolyte Complex Micelles

Wir liefern Protokolle und repräsentative Daten für die Gestaltung, Montage und Charakterisierung von Polyelektrolyt-Komplexen Mizellen, Kernschalen-Nanopartikeln aus Polyelektrolyten und hydrophilen geladenen Blockcopolymeren.

Montage und Charakterisierung von Polyelektrolyt-Komplexmizellen

Polyelectrolyte complex micelles (PCMs), core-shell nanoparticles formed by self-assembly of charged polymers in aqueous solution, provide a powerful ...

Diese Methode beschreibt den vollständigen Weg der Konstruktion, Montage und Charakterisierung von Polyelektrolyt-Komplexen Mizellen, die Nanopartikel sind, die aus der Selbstmontage von entgegengesetzt geladenen Polymeren gebildet werden. Einige große Herausforderungen bei der Polyelektrolyt-Selbstmontage sind die Vermeidung kinetischer Fallen und die Charakterisierung der Nanopartikel. Die von uns beschriebene Salzglühtechnik ermöglicht die wiederholbare Montage von Mizellen mit geringer Dispergität in Größe und Form und wir beschreiben Charakterisierungsmethoden, einschließlich Lichtstreuung, Kleinwinkel-Röntgenstreuung und Elektronenmikroskopie.Die Lieferung von therapeutischen Nukleinsäuren ist eine seit langem bestehende Herausforderung für die Nanomedizin. Diese Polyelektrolyt-Komplexmizellen nutzen die starke negative Ladung der Nukleinsäure, um sie im Kern der Micelle zu sequestrieren, wo die neutrale Polymerkorona sie vor Nukleasen und Immunantwort schützt. Das Montageverfahren sollte auf jede Art von geladenen Polymeren anwendbar sein.Wir haben sie mit mehreren Polyanionen und Polykationen getestet, und die Charakterisierungsmethode sollte auf alle selbst zusammengesetzten Nanopartikel anwendbar sein, einschließlich Tensid-Nanopartikeln und anderen hydrophobisch angetriebenen Systemen. Beginnen Sie mit der Inkubation der Oligonukleotid-Lösung bei 70 Grad Celsius für fünf Minuten. Nach der Inkubation 15 Minuten bei Raumtemperatur abkühlen, um die Nukleinsäuren thermisch anzuglühen, dann 40 Mikroliter 20 Millimolar geladenen Konzentrationsdiblock-Copolymer hinzufügen.Wirbeln Sie die Lösung sofort und inkubieren Sie sie für fünf Minuten bei Raumtemperatur. Um das Salz-Anneal durchzuführen, fügen Sie der Oligonukleotid-Lösung Natriumchloridlösung für eine Endkonzentration von einem Molar hinzu und wirbeln Sie sie 10 Sekunden lang bei maximaler Geschwindigkeit. Inkubieren Sie das Gemisch 10 Minuten bei Raumtemperatur, und laden Sie es dann in die Dialysepatrone.Vor dem Laden Patronen mit permanentem Marker beschriften und mindestens zwei Minuten im Puffer einweichen, um die Membranen zu hydratisieren. Entfernen Sie die Kappe, indem Sie sich gegen den Uhrzeigersinn verdrehen, und laden Sie die Probe mit einer Gel-Ladepipettenspitze. Drücken Sie die Membran vorsichtig, um überschüssige Luft zu entfernen und die Kappe zu ersetzen.Setzen Sie die Patronen in 1X PBS 0,5 molaren Natriumchlorid-Dialysebad, um sicherzustellen, dass sie mit beiden Membranen dem Bad ausgesetzt schwimmen. Nach 24 Stunden die Patronen in 1X PBS überführen und für weitere 24 Stunden einweichen. Nach der endgültigen Dialyse, erholen Sie die Probe, indem Sie die Patronen aus dem Bad entfernen, die Kappe entfernen und die Probe mit einer Gel-Ladepipettenspitze entfernen.Legen Sie die Probe in ein sauberes 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenrohr und kühlen Sie sie bis zur Gebrauchstauglichkeit. Bereiten Sie die Probe in DLS-Instrument nach Manuskriptrichtungen vor, und erfassen Sie dann Daten für mindestens eine Minute, um sicherzustellen, dass die Zählrate über die gesamte Erfassungszeit konstant ist. Untersuchen Sie die Autokorrelationsdaten.Die lange Zeitbasislinie sollte flach sein und die Autokorrelationskurve sollte mit minimaler Streuung glatt sein. Das Rauschen in den Daten kann durch die Erfassung weiterer Daten verbessert werden. Um Datenreduktion und -analyse mit Irena durchzuführen, beginnen Sie mit dem Import von micelle in Hintergrunddatensätzen.Zeichnen Sie die Probe und den Hintergrund zusammen auf einer Log-Log-Skala, und berechnen Sie das Verhältnis zwischen Stichprobe und Hintergrund und überprüfen Sie das hohe Q-Asymptote. Berechnen Sie das durchschnittliche Verhältnis über diesen Q-Bereich, und verwenden Sie das Datenmanipulationsmakro, um den Hintergrund mit dem berechneten Verhältnis zu skalieren. Zeichnen Sie dann das im Hintergrund subtrahierte Signal über Q und speichern Sie die Daten mit einem neuen Namen, um sicherzustellen, dass die ursprünglichen Daten nicht überschrieben werden.Öffnen Sie das Modellierungsmakro, und laden Sie dann die subtrahierten Hintergrunddaten, und zeichnen Sie sie auf. Um ein ungefähres Modell für die Außenfläche des Polyelektrolyt-Komplexmicelle (PCM) zu finden, wählen Sie in den Datensteuerelementen den Bereich "Durchfluss bis mittelmittel Q" aus, um sicherzustellen, dass Schwingungen enthalten sind, wenn sie vorhanden sind. Wählen Sie in Modellsteuerelementen die erste Streuungspopulation aus, und stellen Sie sicher, dass sie die einzige wird.Wählen Sie die Größenverteilung für das Modell aus, wählen Sie den gewünschten Verteilungstyp aus, und wählen Sie den Formfaktor aus. Dieses Beispiel ist für einen flexiblen Zylinder, der manuell unter dem Benutzerformfaktor hinzugefügt werden muss. Laden Sie den flexiblen Zylinderformfaktor herunter und fügen Sie ihn hinzu, und geben Sie dann die Funktionsnamen und Anfangswerte für die Parameter eins und zwei ein, die der Zylinderlänge bzw. der Kuhn-Länge entsprechen.Diese Zylinder sind länger als von SAXS aufgelöst werden können, sodass der Zylinderlängenparameter auf einen großen Wert festgelegt ist. Legen Sie die Anfangsparameter für die Suche fest, indem Sie Werte in die Felder Skalierung, Mittelwertgröße und Breite eingeben. Klicken Sie dann auf Modell berechnen, um den resultierenden Formfaktor zu zeichnen.Sobald vernünftige Parameter gefunden wurden, klicken Sie auf Modell anpassen, um eine nichtlineare kleinste Quadrate anpassung an die Daten auszuführen. Als nächstes modellieren Sie die Streuung der einzelnen Polymere innerhalb des PCM-Kerns. Passen Sie die Datensteuerelemente an, um den Q-Bereich auszuwählen, in dem eine übermäßige Streuung auftritt, die in der Regel im mittleren bis hohen Bereich liegt.Fügen Sie eine zweite Streuungspopulation hinzu, und stellen Sie sicher, dass sie die einzige ist, die verwendet wird. Wählen Sie die einheitliche Ebene für das Modell aus, passen Sie die GDA-Faktoren G und RG an, um sicherzustellen, dass das Modell keine übermäßige Streuung bei niedrigem Q vorhersagt, und verwenden Sie das Anpassungs-PB zwischen Cursormakro, um eine erste Schätzung für diese Parameter zu erhalten. Führen Sie eine nichtlineare Anpassung für das Modell der einheitlichen Ebene aus.Wenn ein Beugungsspitzenwert vorhanden ist, fügen Sie ein drittes Modell für die Beugungsspitze im Q-Interessenbereich hinzu. Sobald ungefähre Anpassungswerte für die einzelnen Streupopulationen ermittelt wurden, schalten Sie alle drei zusammen ein und optimieren Sie die kombinierte Passung. Überprüfen Sie schließlich, ob jeder Wert physisch angemessen bleibt, und speichern Sie die Anpassung, indem Sie den Speicher im Ordner auswählen.Das Ergebnis dieses Verfahrens sollte ein zusammengesetztes Modell sein, das die Kleinen-Winkel-Röntgenstreudaten weit über einen großen Bereich von Größenmaßstäben beschreibt. Dieses Protokoll wurde verwendet, um Nukleinsäure-Polyelektrolyt-Komplexe Mizellen oder PCMs zu entwerfen, zu montieren und zu charakterisieren. Micelle-Kerngröße wird in erster Linie durch die Länge des geladenen Blocks des Blockcopolymers angetrieben und ist weitgehend unabhängig von der Länge des Homopolymers.Dynamische Lichtstreuungsdaten wurden für sphärische PCMs erfasst, die aus relativ langen Blockcopolymeren in kurzen einsträngigen Oligonukleotiden gebildet wurden. Die Autokorrelationsfunktion ist auf einen flachen Wert mit der einzelnen Zeitskala zerfallen, was zu einem Spitzenwert der einzelnen Größe in der RepIS-Größenverteilung führt. Komplexe kleine Engel-Röntgenstreuung oder SAXS-Intensitätsspektren können genau passen, indem Modelle für die verschiedenen räumlichen Korrelationen kombiniert werden, die vorhanden sind, und Multiangle-Lichtstreuung kann verwendet werden, um Streumessungen auf längere Längenskalen zu erweitern.PCMs unterschiedlicher Morphologie können auch mit Elektronenmikroskopie abgebildet werden, um zu überprüfen, ob Kernradien und Form mit den Werten übereinstimmen, die bei der Anpassung von SAXS-Daten erzielt wurden. Beim Anpassen von SAXS-Daten ist es wichtig, für jede Streufunktion Zuberücksichtigen und kostenlose Methoden wie TEM zu verwenden, um sicherzustellen, dass Sie den richtigen Formfaktor verwenden.

Research

JoVE Journal

Chemistry

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Forschung

Chemie

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