Name: assembly and characterization of polyelectrolyte complex micelles
Uploaded: 2020-03-02T14:00:00
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Ringraziamo Phil Griffin e Tera Lavoie del Soft Matter Characterization Facility e Advanced Electron Microscopy Facility, rispettivamente, presso l'Università di Chicago. Ringraziamo anche xiao bing Eo e Soenke Seifert dell'Advanced Photon Source presso l'Argonne National Laboratory e il NIST Center for Hierarchical Materials Design (CHiMaD) per il supporto. Ringraziamo Jeff Ting e Michael Lueckheide per il loro contributo a questo lavoro.

1. Preparazione dei materiali
<ol><li>Pesare il polimero del diblock lofilfato e aggiungere acqua fino a quasi il volume necessario per una soluzione di riserva di 10 mg/mL di concentrazione finale. Vortice alla massima velocità per 2 min.</li>
	<li>Sonicato per 5 min. Gli sblocchi molto lunghi possono richiedere una sonicazione aggiuntiva. La soluzione stock dovrebbe apparire completamente trasparente e omogenea.</li>
	<li>Regolare pH a 7.4 utilizzando NaOH o HCl in base alle esigenze. Aggiungere acqua al volume fina...

Come accennato in precedenza, i protocolli qui presentati sono scritti con un focus sugli oligonucleotidi come componente di polianione e pLys-PEG come copolisimero di blocchi cationici-neutri-neutri, ma li abbiamo testati con una varietà di polimeri, come polimero (acido acrilico), poliglutamate e PEG-poly (vinybenzl'altro trimethylammonium), e crediamo che saranno generalmente applicabili per la maggior parte delle coppie polielettroli. Un parametro che potrebbe essere necessario ottimizzare è la concentrazione di sa...

Quando i polielettroliti caricati in modo opposto vengono mescolati in una soluzione acquosa, il guadagno entropia derivante dal rilascio delle loro contropartite provoca la demixazione della soluzione in una fase condensata ricca di polimeri e un supernatale impoverito di polimeri1,2,3,4, 5, un fenomeno noto come complessità polielettrolitale. Se un blocco idrofilo neutro viene coniugato a uno o a entrambi i polielettroliti, si verifica invece la separazione di fase su nanoscala (Figura 1A). Le nanoparticelle di nucleo-guscio autoassemblate risultanti sono variamente indicate come micelle complesse di polielettroliti (PCM), micelle complesse di poliione, complessi ionomerici a blocchi o micelle coacervate-core per analogia alla micellizzazione surrogata, anche se tutti i componenti del sistema sono idrofili6,7. La capacità di un PCM di incapsulare molecole idrofile come proteine e acidi nucleici, così come l'ampia sintonizzabilità offerta dall'architettura portante del copolimero a blocchi li rende interessanti candidati per la fornitura di molecole terapeutiche in vivo8,9,10,11,12,13.
Fornire acidi nucleici terapeutici a bersagli cellulari è una sfida particolarmente importante, per la quale i PCM offrono diversi vantaggi. Gli acidi nucleici terapeutici (DNA genetico, mRNA e oligonucleotidi come il siRNA) hanno un immenso potenziale per migliorare la salute umana, ma devono superare numerose barriere biologiche e fisiche per rendersi conto che il potenziale14,15,16. Gli acidi nucleici nudi nudi cisierizzano sono degradati da nucleasi cellulari e di siero, vengono rapidamente eliminati dalla circolazione e la loro forte carica negativa rende difficile per loro penetrare le membrane cellulari senza assistenza. Gli attuali approcci per il superamento di queste barriere includono costose modifiche chimiche per prevenire danni da nucleasi e/o incapsulamento in varie nanoparticelle di lipidi assemblate tramite interazioni idrofobiche15,17,18. Mentre questi metodi si sono dimostrati efficaci per iniezioni locali e targeting del fegato, uso sistemico presenta limitazioni significative di tossicità, immunogenicità, e biodistribuzione limitata16. Al contrario, i PCM utilizzano la carica negativa degli acidi nucleici per condensarli all'interno del nucleo separato da fase, mentre la corona neutra fornisce una barriera sterica contro la degradazione e una piattaforma per incorporare ligandi per migliorare il targeting o l'internalizzazione11,19. Studi in vitro e sugli animali hanno dimostrato che i PCM possono fornire efficacemente vari carichi utili di acido nucleico20,21,22,23,24, ma debolezze nella nostra capacità di prevedere le proprietà PCM come dimensioni, forma e stabilità dalle proprietà dei polimeri costituenti hanno ostacolato la loro più ampia adozione.
Il recente lavoro del nostro gruppo e di altri nel campo ha iniziato ad affrontare questo problema sviluppando la proprietà-struttura, e in alcuni casi le relazioni struttura-proprietà-funzione per PCM formate da acidi nucleici e vari polimeri cationici-neutri7,25,26,27. Due temi coerenti che sono emersi da questi studi sono l'importanza di sviluppare protocolli ben controllati e ripetibili per l'assemblaggio di PCM e il vantaggio di utilizzare più tecniche per caratterizzare le nanoparticelle risultanti. I polielettroliti, in particolare quelli ad alta densità di carica come gli acidi nucleici, interagiscono tra loro molto fortemente e sembrano facilmente rimanere cineticamente intrappolati durante la miscelazione, dando luogo a preparazioni PCM che sono altamente sensibili alle piccole variazioni nella procedura e mostrano un'elevata polidispersità e scarsa ripetibilità da lotto a lotto. I PCM hanno anche dimostrato di adottare una vasta gamma di forme e dimensioni a seconda delle configurazioni a livello atomico dei loro componenti, e catturare questa diversità con qualsiasi tecnica di caratterizzazione individuale è molto difficile, soprattutto perché alcune tecniche comuni come la dispersione dinamica della luce (DLS) richiedono ipotesi sulla forma delle particelle per la loro interpretazione.
In questo articolo, discutiamo di progettazione e selezione dei materiali per i PCM, con particolare attenzione agli oligonucleotidi e agli copolimeri di disblocco cationici-neutri. Descriviamo quindi un protocollo di annessione del sale che utilizza alte concentrazioni di sale seguite da dialisi lenta per evitare l'intrappolamento cinetico durante l'assemblaggio del PCM. I polielettroliti vengono mescolati in condizioni di sale elevato in cui vengono schermate le attrazioni elettrostatiche, quindi la concentrazione di sale viene lentamente abbassata per consentire ai polielettroliti di stabilirsi nelle loro configurazioni più favorevoli dal punto di vista energetico, analogamente al lento processo di raffreddamento dell'annealing termico. Utilizzando questo protocollo, siamo regolarmente in grado di ottenere polidispersità eccezionalmente bassa e alta ripetibilità per oligonucleotide PCMs7,26. Infine, descriviamo come quattro tecniche di misurazione separate possono essere utilizzate per caratterizzare i PCM su un'ampia gamma di scale di lunghezza, dalla morfologia esterna alla struttura interna: DLS, dispersione della luce multi-angolo (MALS), dispersione a raggi X a piccolo angolo (SAXS) e microscopia elettronica a trasmissione (TEM). Speriamo che questi protocolli consentano a più ricercatori di esplorare efficacemente le capacità di queste interessanti nanoparticelle.
Selezione e preparazione del polimero Le proprietà PCM sono fortemente influenzate dalle caratteristiche fisiche e chimiche dei polimeri costituenti, rendendo la selezione dei polimeri una fase critica nel processo di progettazione. I copolimeri a blocchi più caratterizzati per i PCM acidi nucleici sono blocchi lineari come poly(lysine)-poly(ethylene glycol) (pLys-PEG), ma i PCM possono essere formati tra polielettroti e una varietà di polimeri idrofili a carica neutra, che possono essere generati in modo ad alta velocità28. La scelta del gruppo carico influisce fortemente sulla stabilità dell'abbinamento ionista e sulla forma delle micelle26,e la dimensione del PCM è stata dimostrata aumentare con la lunghezza del blocco caricato5,7,26 (Figura 2), consentendo così di tessere le proprietà PCM per i requisiti di un'applicazione desiderata. Per gli sblocchi lineari, abbiamo scoperto che il blocco caricato dovrebbe avere almeno 10 cariche ed essere fortemente caricato al pH desiderato. Blocchi caricati più lunghi possono promuovere la formazione di PCM con oligonucleotidi come il siRNA, che sono difficili da complesso con blocchi più brevi21. Abbiamo osservato con successo la formazione di PCM con lunghezze di blocco fino a 200, e la letteratura descrive polimeri più lunghi. Più flessibilità è disponibile nella scelta dei blocchi neutri24, ma l'esperienza ha dimostrato che blocchi neutri molto brevi portano all'aggregazione piuttosto che alla formazione di nanoparticelle, e che la lunghezza minima neutra aumenta con la lunghezza del blocco caricato. Per pLys-PEG, è necessario un PEG MW di almeno 3.000-5.000 per lunghezze di pLys inferiori a 50 dollari e sono necessarie lunghezze più lunghe man mano che il blocco caricato aumenta ulteriormente. L'aumento della lunghezza del blocco neutro comporta un aumento delle dimensioni del PCM, in particolare lo spessore del guscio, a causa dell'affollamento sterico dei polimeri neutri.
Questo manoscritto presenta un protocollo per la preparazione di PCM da pLys-PEG e oligonucleotidi di quantità nota lyophilizzata, ma dovrebbe essere facilmente adattabile anche ad altri sistemi. L'abbiamo testato con successo con diversi polipeptidi caricati, tra cui la poliargina e l'acido poliglutamico, così come diversi polielettroliti sintetici, come l'acido poliacrilico e il polietilene(vinylbenzyl trimethylammonium). Descriviamo anche la preparazione di PCM con un rapporto stoichiometrico di cariche di poligliti, ma questo è facilmente modificabile. Troviamo più facile lavorare in unità di concentrazione di carica (c.c.), che ospita anche naturalmente polimeri che non sono completamente caricati. Se uno dei polimeri non è ben caratterizzato, occorre prestare attenzione a determinare con precisione le lunghezze/masse di polimeri e garantire che il sale in eccesso non sia presente oltre quello necessario per la neutralizzazione della carica mediante dialisi, ad esempio. La presenza di acqua trattenuta deve essere contabilizzato anche quando vengono calcolate le concentrazioni. La concentrazione di acido nucleico può essere convenientemente quantificata mediante assorbimento a 260 nm e la presenza o l'assenza di fosfati terminali deve essere considerata nel calcolo del c.c.
Quando si utilizzano oligonucleotidi come polianioni, lo stato di ibridazione e la struttura chimica aiutano a determinare la propensione per l'auto-assemblaggio e le caratteristiche del PCM risultante5,7,26. L'ottimizzazione di questi, entro i requisiti di efficacia biologica se si utilizzano PCM per la consegna, aumenterà la probabilità di formare le strutture desiderate. Strumenti utili per l'analisi dell'ibridazione includono le funzioni MATLAB per gli acidi nucleici, NUPACK29e IDT OligoAnalyzer. Si consiglia di analizzare una sequenza candidata per comprendere la forza di legame a 1) se stesso in una formazione forcina; 2) un'altra copia della stessa sequenza (auto-dimero); e 3) ad altri oligonucleotidi presenti nel sistema. Le temperature di fusione del DNA e dell'RNA per una sequenza specifica possono anche essere calcolate utilizzando il metodo più vicino30,31. L'annessione termico degli acidi nucleici (passaggio 2.3) denatura qualsiasi struttura secondaria residua nei singoli nucleotidi e favorisce il ripiegamento dell'equilibrio.
Caratterizzazione e analisi PCM È disponibile un'ampia gamma di tecniche per caratterizzare le nanoparticelle, tra cui la dispersione statica e dinamica della luce, la dispersione di piccoli angoli di elettroni o neutroni e la microscopia elettronica. In questo articolo, forniamo protocolli per due tecniche di diffusione della luce, la dispersione a raggi X a piccolo angolo e due tecniche di microscopia elettronica.
DLS misura l'autocorrelazione delle fluttuazioni temporali nell'intensità di dispersione ad un angolo dal moto browniano del campione. L'installazione di questi dati può fornire raggio idrodinamico e polidispersione per le micelle sferiche (Figura 3). La dispersione della luce a più angoli (MALS) misura l'intensità di dispersione statica a molti angoli. Questa dipendenza angolare descrive la forma della nanoparticella, ma è limitata a scale di lunghezza più lunghe di 50 nm per la luce visibile, che ne limita l'efficacia per le nanoparticelle più piccole. Entrambe le tecniche si basano sulla mancata corrispondenza dell'indice di rifrazione e descrivono principalmente le dimensioni esterne della nanoparticella.
La dispersione a raggi X ad angolo ridotto (SAXS) utilizza i raggi X come sonda di dispersione e la loro lunghezza d'onda più corta consente misurazioni su un intervallo di 0,1–100 nm. L'adattamento dell'intensità di dispersione osservata rispetto all'angolo (convenzionalmente espresso come trasferimento di momentum q) fornisce informazioni sulla morfologia PCM (ad esempio, dimensioni e forma) e anche sulla struttura interna. Se è disponibile una calibrazione di intensità assoluta, e se l'intensità di dispersione può essere estrapolata ad angolo zero, la massa PCM e il numero di aggregazione possono anche essere stimati32, rendendo SAXS un metodo estremamente versatile e prezioso. La SANS (Small angle neutron scattering) è sensibile su una gamma simile di scale di lunghezza, ma è disponibile solo presso strutture specializzate e non sarà discussa esplicitamente in questo articolo33,34,35.
Negli ultimi anni abbiamo visto l'avvento degli strumenti SAXS da banco, ma scopriamo che le sorgenti di sincrotrone sono più adatte per la caratterizzazione PCM, poiché la loro maggiore intensità consente di raccogliere i dati molto più velocemente per questi campioni a basso contrasto. Forniamo un breve protocollo per l'acquisizione di dati PCM SAXS presso Beamline 12-ID-B presso l'Advanced Photon Source (Argonne National Laboratory, USA) dal punto di vista dell'utente. Questo protocollo dovrebbe essere applicabile alla maggior parte delle fonti di sincrotrone, ma è altamente consigliabile consultare il personale locale prima di proporre un esperimento. Forniamo anche un protocollo di riduzione e analisi dei dati utilizzando Irena36, un insieme gratuito di macro scritte per Igor Pro. Irena include un insieme versatile di fattori di forma per la modellazione dei dati SAXS e consente la costruzione di modelli multicomponente in grado di descrivere il profilo di dispersione complesso dei PCM (vedere Risultati rappresentativi, Figura 4). Irena ha anche una documentazione completa e tutorial disponibili online. Prima di tentare le procedure riportate di seguito, si consiglia di familiarizzare con questi, in particolare il tutorial "Modellazione dei dati SAXS con due principali popolazioni di scatterer".
Il danno da radiazioni è una preoccupazione per la dispersione dei raggi X, ma possono essere impiegate diverse misure per ridurlo al minimo. In particolare, si consiglia di utilizzare una configurazione di celle di flusso con una pompa di siringa e un campione PCM che scorre durante l'acquisizione dei dati, piuttosto che un capillare sigillato. Questo semplifica notevolmente anche la sottrazione in background. Suggeriamo inoltre di assumere esposizioni multiple del campione che scorre piuttosto che una più lunga per limitare il flusso che ogni singolo volume di campione vede e per consentire il confronto dei dati di esposizione per identificare eventuali danni.
A differenza delle tecniche di dispersione, che generalmente richiedono il montaggio per interpretare, la microscopia elettronica a trasmissione (TEM) fornisce un'immagine visiva dello spazio reale delle nanoparticelle passando un fascio di elettroni attraverso il campione e proiettando un'immagine su uno schermo di scintillazione (Figura 5). In questo articolo presentiamo protocolli per due tecniche TEM. Cryo TEM congela i campioni di micelle in un sottile strato di ghiaccio vitreo, preservando la conformazione strutturale con sostanze estranee minime, ottimale per le micelle a 10-100 nm nel raggio. Il TEM con macchie negative utilizza un sale metallico pesante (ad esempio, l'uranio) per circondare il campione dopo che è stato essiccato sulla superficie di una griglia. La macchia densa disperderà più elettroni del campione, aggiungendo contrasto e producendo un'immagine negativa del campione. Cryo TEM è consigliato per immagini di alta qualità. Tuttavia, è più costoso, richiede tempo e potrebbe non fornire un contrasto sufficiente. Quando questo è un problema, campioni macchiati negativi dovrebbero essere utilizzati. Esempi di ciascuno sono mostrati figura 5.
Ognuna di queste tecniche riporta aspetti leggermente diversi delle nanoparticelle, con diversi punti di forza e limitazioni. La dispersione della luce è prontamente disponibile ed è spesso l'approccio più veloce, ma presenta notevoli limitazioni in termini di dimensioni e risoluzione della forma. SAXS può fornire informazioni su un'ampia gamma di scale di lunghezza a velocità effettiva ragionevolmente elevata, ma richiede apparecchiature specializzate per acquisire i dati, nonché la modellazione per interpretarli. Le immagini TEM sono semplici da interpretare, ma possono essere limitate al contrario e sono intrinsecamente basse. La nostra esperienza ha dimostrato che l'utilizzo di più tecniche per la caratterizzazione aumenta notevolmente le informazioni che possono essere ottenute sulle proprietà PCM e semplifica l'interpretazione dei set di dati ottenuti da ciascuno solo di essi. Ad esempio, SAXS e TEM esaminano principalmente il nucleo denso di un PCM, mentre la dispersione della luce riferisce sulle dimensioni complessive della nanoparticella. Così, combinandoli permette la misurazione della dimensione del nucleo e della corona. La capacità di TEM di acquisire immagini di spazi reali può fornire dati sulla verità del terreno per consentire la selezione di fattori di forma appropriati per la modellazione di dati SAXS che potrebbero altrimenti essere ambigui. In questo articolo vengono descritti i protocolli per tutte e quattro le tecniche e nella sezione Discussione viene fornito un processo di esempio per il loro utilizzo per caratterizzarne un esempio sconosciuto.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>70 mm circle filter paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1001-070</td>
			<td>Filter paper for wicking during grid prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon Film TEM grid</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>CF200-Cu</td>
			<td>TEM grid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAWN</td>
			<td>Wyatt Technology</td>
			<td>DAWN</td>
			<td>MALS instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA oligonucleotide</td>
			<td>Integrated DNA Nanotechnologies Inc</td>
			<td></td>
			<td>Custom oligonucleotide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lacey Carbon TEM grid</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>LC200-Cu</td>
			<td>TEM grid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methoxy-poly(ethylene glycol)-block-poly(l-lysine hydrochloride) PEG5k - PLKC50</td>
			<td>Alamanda Polymers Inc</td>
			<td>mPEG5K-b-PLKC50</td>
			<td>Example block copolymer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td></td>
			<td>Ultrapure water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>For measuring nucleic acid concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>negative-action tweezers</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>N7</td>
			<td>Tweezers for grid preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm &#34;M&#34;</td>
			<td>Bemis Company Inc</td>
			<td>PM996</td>
			<td>Laboratory film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantifoil Holey Carbon TEM grid</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>Q210CR1.3</td>
			<td>TEM grid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Research Goniometer and Laser Light Scattering System</td>
			<td>Brookhaven Instruments</td>
			<td>BI-200SM</td>
			<td>DLS/MALS instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide-A-Lyzer G2 2K 0.5 mL</td>
			<td>Thermo Scientific Pierce Protein Biology</td>
			<td>87723</td>
			<td>Dialysis cartridge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>small volume cuvette</td>
			<td>Brookhaven Instruments</td>
			<td>BI-SVC</td>
			<td>Cuvette for DLS/MALS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solarus 950 Advanced Plasma System</td>
			<td>Gatan</td>
			<td>Solarus 950</td>
			<td>Plasma system for TEM grids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Talos TEM</td>
			<td>FEI</td>
			<td>Talos</td>
			<td>TEM used for cryo samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tecnai Spirit TEM</td>
			<td>FEI</td>
			<td>Spirit</td>
			<td>TEM used for dry samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl Formate</td>
			<td>SPI-Chem</td>
			<td>16984-59-1</td>
			<td>For negative staining samples for TEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitrobot</td>
			<td>FEI</td>
			<td>Vitrobot</td>
			<td>Vitrification robot for cryo grid preparation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assembly and characterization of polyelectrolyte complex micelles

Le micelle complesse di polielettroti , nanoparticelle core-shell formate dall'auto-assemblaggio di polimeri caricati in una soluzione acquosa, forniscono una potente piattaforma per esplorare la fisica delle interazioni polielettrolitiche e offrono anche una soluzione promettente per il problema pressante di fornire oligonucleotidi terapeutici in vivo. Lo sviluppo di relazioni struttura-proprietà predittiva per i PCM si è rivelato difficile, in parte a causa della presenza di forti trappole cinetiche durante l'auto-assemblaggio delle nanoparticelle. Questo articolo illustra i criteri per la scelta dei polimeri per la costruzione PCM e fornisce protocolli basati sull'annealing del sale che consentono l'assemblaggio di nanoparticelle ripetibili e a bassa polidisità. Discutiamo anche della caratterizzazione pcM utilizzando la dispersione della luce, la dispersione a raggi X a piccolo angolo e la microscopia elettronica.

Per illustrare i metodi di caratterizzazione descritti in precedenza, mostriamo risultati tipici per i PCM assemblati da oligonucleotidi e copolimeri a blocchi di varie lunghezze e sostanze chimiche (Figura 1). Figura 2 fornisce un esempio di come le dimensioni del nucleo PCM (come determinato da SAXS e TEM, Figura 4 e Figura 5) variava con lunghezza del blocco caricato. La figura 3...

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Assembly and Characterization of Polyelectrolyte Complex Micelles

Forniamo protocolli e dati rappresentativi per la progettazione, l'assemblaggio e la caratterizzazione di micelle complesse di polielettroliti, nanoparticelle core-shell formate da polielettroliti e copolimeri a blocchi caricati caricati idrofili.

Assemblaggio e caratterizzazione di Micelle complesse di polielettroliti

Polyelectrolyte complex micelles (PCMs), core-shell nanoparticles formed by self-assembly of charged polymers in aqueous solution, provide a powerful ...

Questo metodo descrive il percorso completo della progettazione, assemblaggio e caratterizzazione di micelle complesse polielettroliti che sono nanoparticelle che si formano dall'auto-assemblaggio di polimeri caricati in modo opposto. Alcune delle principali sfide con l'auto-assemblaggio dei polielettroliti sono evitare trappole cinetiche e caratterizzare le nanoparticelle. La tecnica di ricottura del sale che descriviamo consente l'assemblaggio ripetibile di micelle a bassa dispersione sia in termini di dimensioni che di forma e descriviamo metodi di caratterizzazione tra cui scattering della luce, scattering a raggi X ad angolo ridotto e microscopia elettronica.Fornire acidi nucleici terapeutici è una sfida di lunga data per la nanomedicina. Queste micelle complesse polielettroliti sfruttano la forte carica negativa dell'acido nucleico per sequestrarle nel nucleo della micelle dove la corona polimerica neutra le protegge dalle nucleasi e dalla risposta immunitaria. Il metodo di assemblaggio deve essere applicabile a qualsiasi tipo di polimero carico.Li abbiamo testati con diversi polianioni e policationi e il metodo di caratterizzazione dovrebbe essere applicabile a tutte le nanoparticelle auto-assemblate tra cui nanoparticelle tensioattiva e altri sistemi idrofobicamente guidati. Iniziare incubando la soluzione oligonucleotosa a 70 gradi Celsius per cinque minuti. Dopo l'incubazione, raffreddarlo per 15 minuti a temperatura ambiente per ricottura termica degli acidi nucleici, quindi aggiungere 40 microlitri di copolimero di blocco a concentrazione caricata da 20 millimolare.Vortice immediatamente la soluzione e incubarla per cinque minuti a temperatura ambiente. Per eseguire la ricottura salina, aggiungere la soluzione di cloruro di sodio alla soluzione oligonucleotosa per una concentrazione finale di un molare e vortice per 10 secondi alla massima velocità. Incubare la miscela per 10 minuti a temperatura ambiente, quindi procedere con il caricamento nella cartuccia di dialisi.Prima del caricamento, etichettare le cartucce con marcatore permanente e immergerle nel tampone per almeno due minuti per idratare le membrane. Rimuovere il cappuccio torcendo in senso antiorario e caricare il campione utilizzando una punta della pipetta di caricamento del gel. Spremere delicatamente la membrana per rimuovere l'aria in eccesso e sostituire il cappuccio.Mettere le cartucce nel bagno di dialisi al cloruro di sodio molare 1X PBS 0.5 assicurandosi che galleggiano con entrambe le membrane esposte al bagno. Dopo 24 ore, trasferire le cartucce in 1X PBS e immergerle per altre 24 ore. Dopo la dialisi finale, recuperare il campione rimuovendo le cartucce dal bagno, rimuovendo il tappo e rimuovendo il campione con una punta della pipetta di caricamento del gel.Posizionare il campione in un tubo di microcentrifugo pulito da 1,5 millilitri e refrigera fino a quando non è pronto per l'uso. Preparare il campione nello strumento DLS in base alle indicazioni manoscritte, quindi acquisire i dati per almeno un minuto assicurandosi che il tasso di conteggio sia costante per l'intero tempo di acquisizione. Esaminare i dati di correzione automatica.La linea di base a lungo termine dovrebbe essere piatta e la curva di autocorrelazione dovrebbe essere liscia con una dispersione minima. Il rumore nei dati può essere migliorato acquisendo più dati. Per eseguire la riduzione e l'analisi dei dati utilizzando Irena, iniziare importando micelle in set di dati in background.Tracciare l'esempio e lo sfondo insieme su una scala log-log e calcolare il rapporto campione/sfondo e verificare l'asintoto Q elevato. Calcola il rapporto medio su questo intervallo Q e usa la macro di manipolazione dei dati per ridimensionare lo sfondo con il rapporto calcolato. Quindi tracciare il segnale sottratto in background su Q e salvare i dati con un nuovo nome assicurandosi di non sovrascrivere i dati originali.Aprire la macro di modellazione, quindi caricare e tracciare i dati sottratti in background. Per trovare un modello approssimativo per la superficie esterna della micelle complessa polielettrolita, o PCM, selezionare il flusso per moderare l'intervallo Q nei controlli dati assicurandosi di includere oscillazioni se sono presenti. Nei controlli modello, selezionare la prima popolazione di scattering e assicurarsi che sia l'unica in uso.Selezionate la distribuzione delle dimensioni per il modello, scegliete il tipo di distribuzione desiderato e selezionate il fattore di forma. Questo esempio è per un cilindro flessibile che deve essere aggiunto manualmente sotto il fattore di forma dell'utente. Scaricare e aggiungere il fattore di forma del cilindro flessibile, quindi inserire i nomi delle funzioni e i valori iniziali per i parametri uno e due che corrispondono rispettivamente alla lunghezza del cilindro e alla lunghezza di Kuhn.Questi cilindri sono più lunghi di quelli che possono essere risolti da SAXS, quindi il parametro di lunghezza del cilindro è fissato a un valore elevato. Impostare i parametri iniziali per la ricerca immettendo i valori nei campi scala, dimensione media e larghezza. Quindi fare clic su calcola modello per disegnare il fattore di forma risultante.Una volta trovati parametri ragionevoli, fare clic sul modello di adattamento per eseguire un minimo quadrato non lineare adatto ai dati. Successivamente, modellare la dispersione dei singoli polimeri all'interno del nucleo PCM. Regolare i controlli dati per selezionare l'intervallo Q in cui si verifica lo scattering in eccesso, che in genere si trova nell'intervallo da moderato a alto.Aggiungere una seconda popolazione di scattering e assicurarsi che sia l'unica in uso. Selezionate il livello unificato per il modello, regolate i fattori GDA G e RG per garantire che il modello non predice uno scattering eccessivo a Q basso e utilizzate la macro FIT PB tra cursori per ottenere un'ipotesi iniziale per questi parametri. Per quanto riguarda il fattore di forma, eseguire un adattamento non lineare per il modello di livello unificato.Se è presente un picco di diffrazione, aggiungere un terzo modello per il picco di diffrazione nell'intervallo Q di interesse. Una volta ottenuti valori di adattamento approssimativi per le singole popolazioni di scattering, accendere tutti e tre insieme e ottimizzare l'adattamento combinato. Infine, controlla che ogni valore rimanga fisicamente ragionevole e salva l'adattamento selezionando l'archivio nella cartella.Il risultato di questa procedura dovrebbe essere un modello composito che descrive i dati di scattering a raggi X ad angolo ridotto ben su una vasta gamma di scale di dimensioni. Questo protocollo è stato utilizzato per progettare, assemblare e caratterizzare micelle complesse di polielettroliti ad acido nucleico o PCM. La dimensione del nucleo della micelle è principalmente guidata dalla lunghezza del blocco caricato del copolimero del blocco ed è in gran parte indipendente dalla lunghezza dell'omopolimero.I dati dinamici di diffusione della luce sono stati acquisiti per PCM sferici formati da copolimeri a blocchi relativamente lunghi in brevi oligonucleotidi a singolo filamento. La funzione di autocorrelazione è decaduta in un valore piatto con la singola scala temporale con conseguente picco di dimensione singola nella distribuzione delle dimensioni repIS. Lo scattering a raggi X di piccoli angeli complessi o gli spettri di intensità SAXS possono essere adattati con precisione combinando modelli per le correlazioni spaziali multiple presenti e lo scattering della luce multiangle può essere utilizzato per estendere le misurazioni dello scattering a scale di lunghezza più lunga.I PCM di morfologia variabile possono anche essere immagini con microscopia elettronica per verificare che i raggi e la forma del nucleo siano coerenti con i valori ottenuti adattando i dati SAXS. Quando si adattano i dati SAXS, è importante tenere conto di ogni funzione di scattering e utilizzare metodi gratuiti come TEM per assicurarsi di utilizzare il fattore di forma corretto.

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Preparazione e caratterizzazione di nanostrutture ibride C60/Graphene

Physical thermal deposition in a high vacuum environment is a clean and controllable method for fabricating novel molecular nanostructures on graphene. We ...