Name: assembly and characterization of polyelectrolyte complex micelles
Uploaded: 2020-03-02T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assembly and Characterization of Polyelectrolyte Complex Micelles at JoVE.com

Vi takker Phil Griffin og Tera Lavoie fra soft matter-karakteriseringsanlegget og Advanced Electron Microscopy Facility, henholdsvis ved The University of Chicago. Vi takker også Xiaobing Zuo og Soenke Seifert fra Advanced Photon Source ved Argonne National Laboratory og NIST Center for Hierarchical Materials Design (CHiMaD) for støtte. Vi takker Jeff Ting og Michael Lueckheide for deres bidrag til dette arbeidet.

1. Utarbeidelse av materialer
<ol><li>Vei ut lyofilisert diblock polymer og tilsett vann opp til nesten volumet som kreves for en lagerløsning på 10 mg / ml endelig konsentrasjon. Vortex med maksimal hastighet i 2 min.</li>
	<li>Sonicate i 5 min. Svært lange diblocks kan kreve ekstra sonikering. Lagerløsningen skal virke helt gjennomsiktig og homogen.</li>
	<li>Juster pH til 7,4 med NaOH eller HCl etter behov. Tilsett vann i det endelige volumet. pLys-PEG-løsningene er ganske stabile, men bør kjøles ned for lang...

Som nevnt ovenfor er protokollene som presenteres her skrevet med fokus på oligonucleotides som polyanionkomponenten og pLys-PEG som kationisk nøytral blokkkopolymer, men vi har testet dem med en rekke polymerer, for eksempel poly(akrylsyre), polyglutamat og PEG-poly(vinylbenzyltritylammonium), og tror de generelt vil gjelde for de fleste polyelektrolytepar. En parameter som kanskje må optimaliseres er saltkonsentrasjonen som brukes til annealing, fordi den skal være høy nok til at PCM-er ikke dannes i begynnelsen a...

Når motsatt ladede polyelektrolytter blandes i vandig løsning, entropi gevinst fra frigjøring av sine motsmoter forårsaker demixing av løsningen i en polymer-rik kondensert fase og en polymer-utarmet supernatant1,2,3,4,5, et fenomen kjent som polyelektrolytt kompleksasjon. Hvis en nøytral hydrofil blokk konjugerert til en eller begge polyelektrolytter, oppstår nanoskalafaseseparasjon i stedet (figur 1A). De resulterende selvmonterte kjerneskall nanopartikler er forskjellig referert til som polyelektrolyte komplekse micelles (PCMs), polyion kompleks micelles, blokk ionomer komplekser, eller koacervat-core micelles av analogi til overflateaktivt micellization, selv om alle komponenter i systemet er hydrofile6,7. En PCMs evne til å innkapsle hydrofile molekyler som proteiner og nukleinsyrer, samt den omfattende tunabiliteten som tilbys av blokkkopolymerbærerarkitekturen, gjør dem attraktive kandidater for å levere terapeutiske molekyler in vivo8,9,10,11,12,13.
Å levere terapeutiske nukleinsyrer til cellulære mål er en spesielt viktig utfordring, og en som PCMs tilbyr flere fordeler. Terapeutiske nukleinsyrer (genetisk DNA, mRNA og oligonucleotides som siRNA) har enormt potensial for å forbedre menneskers helse, men må overvinne mange biologiske og fysiske barrierer for å innse atpotensialet 14,15,16. Bare nukleinsyrer er degradert av serum og cellulære kjerner, blir raskt ryddet fra sirkulasjon, og deres sterke negative ladning gjør det vanskelig for dem å trenge inn i cellemembraner uten hjelp. Nåværende tilnærminger for å overvinne disse barrierene inkluderer kostbare kjemiske modifikasjoner for å forhindre skade fra kjerner og / eller innkapsling i ulike lipidnanopartikler montert via hydrofobe interaksjoner15,17,18. Mens disse metodene har vist seg effektive for lokale injeksjoner og levermålretting, gir systemisk bruk betydelige begrensninger for toksisitet, immunogenisitet og begrenset biodistribusjon16. Til sammenligning bruker PCM-er den negative ladningen av nukleinsyrer til å kondensere dem innenfor den faseseparerte kjernen, mens den nøytrale koronaen gir en steric barriere mot nedbrytning samt en plattform for å innlemme ligander for å forbedre målretting eller internalisering11,19. In vitro og dyrestudier har vist at PCM kan effektivt levere ulike nukleinsyre nyttelaster20,21,22,23,24, men svakheter i vår evne til å forutsi PCM egenskaper som størrelse, form, og stabilitet fra egenskapene til bestanddeler polymerer har hindret deres bredere adopsjon.
Nylig arbeid av vår gruppe og andre i feltet har begynt å løse dette problemet ved å utvikle struktur-eiendom, og i noen tilfeller struktur-eiendom-funksjon relasjoner for PCMer dannet fra nukleinsyrer og ulike kationsyrenøytrale polymerer7,25,26,27. To konsekvente temaer som har dukket opp fra disse studiene er viktigheten av å utvikle velkontrollerte, repeterbare protokoller for PCM-montering og fordelen av å bruke flere teknikker for å karakterisere de resulterende nanopartiklene. Polyelektrolytter, spesielt de med høy ladningtetthet som nukleinsyrer, samhandler veldig sterkt med hverandre, og ser ut til å lett bli kinetisk fanget ved blanding, noe som resulterer i PCM-preparater som er svært følsomme for små variasjoner i prosedyren og viser høy polydispersitet og dårlig gjentagbarhet fra batch til batch. PCMs har også vist seg å vedta et bredt spekter av former og størrelser avhengig av atomnivåkonfigurasjonene til komponentene sine, og fange dette mangfoldet med individuell karakteriseringsteknikk er svært vanskelig, spesielt siden noen vanlige teknikker som dynamisk lysspredning (DLS) krever antagelser om partikkelform for tolkningen.
I denne artikkelen diskuterer vi materialdesign og valg for PCMer, med fokus på oligonucleotides og kationiske nøytrale diblock kopolymerer. Vi beskriver deretter en salt annealing protokoll som bruker høye saltkonsentrasjoner etterfulgt av langsom dialyse for å unngå kinetisk fangst under PCM montering. Polyelektrolytter blandes i høye saltforhold hvor elektrostatiske attraksjoner screenes, så saltkonsentrasjonen senkes sakte for å tillate polyelektrolytter å bosette seg i sine mest energisk gunstige konfigurasjoner, analogt med den langsomme kjøleprosessen av termisk annealing. Ved hjelp av denne protokollen, vi er regelmessig i stand til å oppnå eksepsjonelt lav polydispersity og høy repeterbarhet for oligonucleotide PCMs7,26. Til slutt beskriver vi hvordan fire separate måleteknikker kan brukes til å karakterisere PCMer over et svært bredt spekter av lengdeskalaer, fra ekstern morfologi til intern struktur: DLS, flervinslysspredning (MALS), liten vinkel røntgenspredning (SAXS), og transmisjonselektronmikroskopi (TEM). Vi håper at disse protokollene vil gjøre det mulig for flere forskere å effektivt utforske egenskapene til disse interessante nanopartiklene.
Polymer valg og forberedelse PCM egenskaper er sterkt påvirket av de fysiske og kjemiske egenskapene til bestanddelene polymerer, noe som gjør polymervalg et kritisk skritt i designprosessen. De mest velkarakteriserte blokkkopolymerer for nukleinsyre-PCMer er lineære diblocks som poly(lysin)-poly(etylenglykol) (pLys-PEG), men PCM-er kan dannes mellom polyelektrolytter og en rekke hydrofile nøytrale ladede polymerer, som kan genereres på en høygjennomstrømningsmåte 28. Valget av ladet gruppe påvirker stabiliteten til ionparing og form av micelles26, og PCM-størrelse har vist seg å øke med lengden på den ladede blokken5,7,26 ( Figur2), og dermed tillate PCM egenskaper som skal justeres for kravene til en ønsket applikasjon. For lineære diblocks har vi funnet ut at den siktede blokken skal ha minst 10 kostnader og bli sterkt belastet ved ønsket pH. Lengre ladede blokker kan fremme PCM-dannelse med oligonucleotides som siRNA, som er vanskelig å komplekse med kortere blokker21. Vi har observert PCM-dannelse med blokklengder opp til 200, og litteraturen beskriver lengre polymerer. Mer fleksibilitet er tilgjengelig i valg av nøytrale blokker24, men erfaring har vist at svært korte nøytrale blokker fører til aggregering i stedet for nanopartikkeldannelse, og at den minste nøytrale lengden øker med ladet blokklengde. For pLys-PEG kreves en PEG MW på minst 3000–5000 for pLys lengder under ~ 50, og lengre lengder kreves som den ladede blokken økes ytterligere. Økt nøytral blokklengde resulterer i økt PCM-størrelse, spesielt skalltykkelse, på grunn av steric trengsel av nøytrale polymerer.
Dette manuskriptet presenterer en protokoll for å forberede PCMer fra lyofiliserte høyrenhet pLys-PEG og oligonucleotides av kjent mengde, men bør være lett tilpasningsdyktig til andre systemer også. Vi har testet det med hell med flere ladede polypeptider, inkludert polyarginin og polyglutaminsyre, samt flere syntetiske polyelektrolytter, som polyakrylsyre og poly(vinylbenzyltrimetylammonium). Vi beskriver også å forberede PCMs med et stoichiometrisk forhold mellom polyelektrolyttladninger, men dette er lett å endre. Vi finner det enklest å arbeide i ladekonsentrasjonenheter (c.c.), som også naturlig rommer polymerer som ikke er fulladet. Hvis enten polymer ikke er godt karakterisert, bør det tas hensyn til nøyaktig å bestemme polymerlengdene/massene og sikre at overflødig salt ikke er til stede utover det som trengs for ladenøytralisering ved dialyse, for eksempel. Tilstedeværelsen av eventuelt beholdt vann bør også redegjøres for når konsentrasjoner beregnes. Nukleinsyrekonsentrasjon kan enkelt kvantifiseres ved absorbans ved 260 nm, og tilstedeværelse eller fravær av terminalfosfater bør vurderes ved beregning av c.c.
Når du bruker oligonucleotides som polyanioner, hybridisering tilstand og kjemisk struktur bidra til å bestemme tilbøyelighet til selvmontering og egenskapene til den resulterende PCM5,7,26. Optimalisering av disse, innenfor kravene til biologisk effekt hvis du bruker PCMer for levering, vil øke sannsynligheten for å danne de ønskede strukturene. Nyttige verktøy for å analysere hybridisering inkluderer MATLAB-funksjoner for nukleinsyrer, NUPACK29og IDT OligoAnalyzer. Vi anbefaler å analysere en kandidatsekvens for å forstå styrken av binding til 1) seg selv i en hårnålformasjon; 2) en annen kopi av samme sekvens (selv-dimer); og 3) til andre oligonucleotides tilstede i systemet. DNA og RNA smeltetemperaturer for en bestemt sekvens kan også beregnes ved hjelp av nærmeste nabo metode30,31. Termisk annealing av nukleinsyrer (trinn 2.3) denatures noen gjenværende sekundær struktur i de enkelte nukleotider og fremmer likevekt folding.
PCM karakterisering og analyse Et bredt spekter av teknikker er tilgjengelig for karakterisering av nanopartikler, inkludert statisk og dynamisk lysspredning, liten vinkelspredning av elektroner eller nøytroner og elektronmikroskopi. I denne artikkelen gir vi protokoller for to lysspredningsteknikker, liten vinkel røntgenspredning og to elektronmikroskopiteknikker.
DLS måler autokorrelasjonen av temporale svingninger i spredningsintensitet i en vinkel fra Brownian-bevegelsen til prøven. Montering av disse dataene kan gi hydrodynamisk radius og polydispersitet for sfæriske micelles (figur 3). Flere vinkellysspredning (MALS) måler den statiske spredningsintensiteten i mange vinkler. Denne kantete avhengigheten beskriver formen på nanopartikkelen, men er begrenset til lengdeskalaer som er lengre enn ~ 50 nm for synlig lys, noe som begrenser effektiviteten for mindre nanopartikler. Begge teknikkene er basert på brytningsindekskonflikt og beskriver først og fremst de ytre dimensjonene til nanopartikkelen.
Liten vinkel Røntgenspredning (SAXS) bruker røntgenstråler som spredningssonden, og deres kortere bølgelengde tillater målinger over en rekkevidde på ~ 0,1-100 nm. Montering av observert spredningsintensitet vs. vinkel (konvensjonelt uttrykt som momentumoverføring q)gir informasjon om PCM morfologi (dvs. størrelse og form) og også intern struktur. Hvis en absolutt intensitetskalibrering er tilgjengelig, og hvis spredningsintensiteten kan ekstrapoleres til null vinkel, kan PCM-masse- og aggregeringsnummer også anslås32, noe som gjør SAXS til en ekstremt allsidig og verdifull metode. Små vinkel nøytron spredning (SANS) er følsom over et lignende utvalg av lengde skalaer, men er bare tilgjengelig på spesialiserte fasiliteter og vil ikke bli eksplisitt diskutert i denne artikkelen33,34,35.
De siste årene har sett bruk av benkeplate SAXS instrumenter, men vi finner at synchrotron kilder er bedre egnet for PCM karakterisering, som deres høyere intensitet gjør at data kan samles mye raskere for disse lavkontrast prøver. Vi tilbyr en kort protokoll for å anskaffe PCM SAXS-data på Beamline 12-ID-B ved Advanced Photon Source (Argonne National Laboratory, USA) fra et brukerperspektiv. Denne protokollen bør gjelde for de fleste synchrotron kilder, men rådgivning med lokale ansatte før du foreslår et eksperiment er sterkt anbefalt. Vi tilbyr også en datareduksjons- og analyseprotokoll ved hjelp av Irena36, et gratis sett med makroer skrevet for Igor Pro. Irena inkluderer et allsidig sett med formfaktorer for modellering av SAXS-data og muliggjør bygging av flerkomponentmodeller som er i stand til å beskrive den komplekse spredningsprofilen til PCMer (se Representative resultater, figur 4). Irena har også omfattende dokumentasjon og tutorials tilgjengelig på nettet. Før du prøver prosedyrene nedenfor, anbefaler vi å gjøre seg kjent med disse, spesielt opplæringen "Modellering av SAXS-data med to hovedscatterpopulasjoner".
Strålingsskader er en bekymring for røntgenspredning, men flere tiltak kan brukes for å minimere den. Spesielt anbefaler vi at du bruker et strømningscelleoppsett med en sprøytepumpe og PCM-prøve som flyter under datainnsamling, i stedet for en forseglet kapillær. Dette forenkler også i stor grad bakgrunnssubtraksjon. Vi foreslår også å ta flere eksponeringer av den flytende prøven i stedet for en lengre for å begrense strømmen som et enkelt utvalgsvolum ser og for å tillate sammenligning av eksponeringsdataene for å identifisere eventuelle skader.
I motsetning til spredningsteknikkene, som vanligvis krever montering for å tolke, gir transmisjonselektronmikroskopi (TEM) et ekte romvisuelt bilde av nanopartiklene ved å sende en elektronstråle gjennom prøven og projisere et bilde på en scintillation-skjerm (Figur 5). Vi presenterer protokoller for to TEM-teknikker i denne artikkelen. Cryo TEM fryser micelleprøver i et tynt lag med glassglassis, og bevarer strukturell konformasjon med minimale fremmede stoffer, optimalt for micelles ≤~10-100 nm i radius. Negativ flekk TEM bruker et tungmetallsalt (f.eks. uran) til å omgi prøven etter at den er tørket på overflaten av et rutenett. Den tette flekken vil spre flere elektroner enn prøven, legge til kontrast og produsere et negativt bilde av prøven. Cryo TEM anbefales for bilder av høy kvalitet. Det er imidlertid dyrere, tidkrevende, og kan ikke gi tilstrekkelig kontrast. Når dette er en bekymring, bør negative fargede prøver brukes. Eksempler på hver av dem vises i figur 5.
Hver av disse teknikkene rapporterer om litt forskjellige aspekter av nanopartiklene, med forskjellige styrker og begrensninger. Lysspredning er lett tilgjengelig, og er ofte den raskeste tilnærmingen, men har betydelige begrensninger i størrelse og formoppløsning. SAXS kan gi informasjon over et stort spekter av lengdeskalaer med rimelig høy gjennomstrømning, men krever spesialisert utstyr for å skaffe dataene, samt modellering for å tolke dem. TEM-bilder er enkle å tolke, men kan begrenses i kontrast og er iboende lav gjennomstrømning. Vår erfaring har vist at bruk av flere teknikker for karakterisering øker informasjonen som kan fås om PCM-egenskaper og forenkler tolkning en datasett hentet fra hver enkelt alene. For eksempel undersøker SAXS og TEM primært en PCMs tette kjerne, mens lysspredning rapporterer om de totale dimensjonene til nanopartikkelen. Dermed, kombinere dem tillater måling av både kjerne og corona størrelse. TEMs evne til å skaffe ekte rombilder kan gi bakkesannhetsdata for å muliggjøre valg av passende formfaktorer for modellering av SAXS-data som ellers kan være tvetydige. Denne artikkelen beskriver protokoller for alle fire teknikker, og en eksempelprosess for å bruke dem til å karakterisere et ukjent utvalg er gitt i Diskusjon-delen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>70 mm circle filter paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1001-070</td>
			<td>Filter paper for wicking during grid prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon Film TEM grid</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>CF200-Cu</td>
			<td>TEM grid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAWN</td>
			<td>Wyatt Technology</td>
			<td>DAWN</td>
			<td>MALS instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA oligonucleotide</td>
			<td>Integrated DNA Nanotechnologies Inc</td>
			<td></td>
			<td>Custom oligonucleotide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lacey Carbon TEM grid</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>LC200-Cu</td>
			<td>TEM grid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methoxy-poly(ethylene glycol)-block-poly(l-lysine hydrochloride) PEG5k - PLKC50</td>
			<td>Alamanda Polymers Inc</td>
			<td>mPEG5K-b-PLKC50</td>
			<td>Example block copolymer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td></td>
			<td>Ultrapure water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>For measuring nucleic acid concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>negative-action tweezers</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>N7</td>
			<td>Tweezers for grid preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm &#34;M&#34;</td>
			<td>Bemis Company Inc</td>
			<td>PM996</td>
			<td>Laboratory film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantifoil Holey Carbon TEM grid</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>Q210CR1.3</td>
			<td>TEM grid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Research Goniometer and Laser Light Scattering System</td>
			<td>Brookhaven Instruments</td>
			<td>BI-200SM</td>
			<td>DLS/MALS instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide-A-Lyzer G2 2K 0.5 mL</td>
			<td>Thermo Scientific Pierce Protein Biology</td>
			<td>87723</td>
			<td>Dialysis cartridge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>small volume cuvette</td>
			<td>Brookhaven Instruments</td>
			<td>BI-SVC</td>
			<td>Cuvette for DLS/MALS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solarus 950 Advanced Plasma System</td>
			<td>Gatan</td>
			<td>Solarus 950</td>
			<td>Plasma system for TEM grids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Talos TEM</td>
			<td>FEI</td>
			<td>Talos</td>
			<td>TEM used for cryo samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tecnai Spirit TEM</td>
			<td>FEI</td>
			<td>Spirit</td>
			<td>TEM used for dry samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl Formate</td>
			<td>SPI-Chem</td>
			<td>16984-59-1</td>
			<td>For negative staining samples for TEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitrobot</td>
			<td>FEI</td>
			<td>Vitrobot</td>
			<td>Vitrification robot for cryo grid preparation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assembly and characterization of polyelectrolyte complex micelles

Polyelektrolyte komplekse micelles (PCMer), kjerneskall nanopartikler dannet av selvmontering av ladede polymerer i vandig løsning, gir en kraftig plattform for å utforske fysikken til polyelektrolyttinteraksjoner og tilbyr også en lovende løsning for å det presserende problemet med å levere terapeutiske oligonucleotides in vivo. Å utvikle prediktive struktur-eiendomsforhold for PCMer har vist seg vanskelig, delvis på grunn av tilstedeværelsen av sterke kinetiske feller under nanopartikkel selvmontering. Denne artikkelen diskuterer kriterier for valg av polymerer for PCM-konstruksjon og gir protokoller basert på saltannealing som muliggjør montering av repeterbare nanopartikler med lav polydispersitet. Vi diskuterer også PCM-karakterisering ved hjelp av lysspredning, småvinkelrøntgenspredning og elektronmikroskopi.

For å illustrere karakteriseringsmetodene som er beskrevet ovenfor, viser vi typiske resultater for PCMer montert fra oligonucleotides og blokkerer kopolymerer av ulike lengder og kjemi (Figur 1). Figur 2 gir et eksempel på hvordan PCM-kjernestørrelse (som bestemt fra SAXS og TEM, figur 4 og figur 5)varierte med ladet blokklengde. Figur 3 viser DLS-data og tilpasningsres...

Watch this Scientific Journal Video about Assembly and Characterization of Polyelectrolyte Complex Micelles at JoVE.com

Assembly and Characterization of Polyelectrolyte Complex Micelles

Vi tilbyr protokoller og representative data for utforming, montering og karakterisering av polyelektrolyte komplekse micelles, kjerneskall nanopartikler dannet av polyelektrolytter og hydrofile ladede blokkkopolymerer.

Montering og karakterisering av polyelektrolyttkompleks micelles

Polyelectrolyte complex micelles (PCMs), core-shell nanoparticles formed by self-assembly of charged polymers in aqueous solution, provide a powerful ...

Denne metoden beskriver hele banen til design, montering og karakterisering av polyelektrolytt komplekse micelles som er nanopartikler som er dannet fra selvmontering av motsatt ladede polymerer. Noen store utfordringer med polyelektrolytt selvmontering unngår kinetiske feller og karakteriserer nanopartiklene. Salt glødeteknikken som vi beskriver gir mulighet for repeterbar montering av micelles med lav dispersitet i både størrelse og form, og vi beskriver karakteriseringsmetoder, inkludert lysspredning, liten vinkelrøntgenspredning og elektronmikroskopi.Å levere terapeutiske nukleinsyrer er en langvarig utfordring for nanomedisin. Disse polyelektrolytt komplekse micelles dra nytte av den sterke negative ladningen av nukleinsyre for å sequester dem i kjernen av micelle der nøytral polymer corona beskytter dem mot nukleaser og immunrespons. Monteringsmetoden skal gjelde for alle typer ladede polymerer.Vi har testet dem med flere polyanioner og polycations, og karakteriseringsmetoden skal gjelde for alle selvmonterte nanopartikler, inkludert overflateaktive nanopartikler og andre hydrofomisk drevne systemer. Begynn med å inkubere oligonucleotidløsningen ved 70 grader Celsius i fem minutter. Etter inkubasjonen, avkjøl den i 15 minutter ved romtemperatur for å termisk anneal nukleinsyrer, og tilsett deretter 40 mikroliter på 20 millimolar ladet konsentrasjonsdiblock copolymer.Vortex løsningen umiddelbart og inkubere den i fem minutter ved romtemperatur. For å utføre salt gløde, tilsett natriumkloridoppløsning til oligonukleotidløsningen for en endelig konsentrasjon av en molar og vortex den i 10 sekunder ved maksimal hastighet. Inkuber blandingen i 10 minutter ved romtemperatur, og fortsett deretter med å laste den inn i dialysepatronen.Før lasting, etikett patroner med permanent markør og suge dem i buffer i minst to minutter for å hydrere membranene. Fjern hetten ved å vri mot klokken og legg prøven ved hjelp av en gellastepipettespiss. Klem forsiktig membranen for å fjerne overflødig luft og sett på hetten.Sett patronene i 1X PBS 0,5 molar natriumkloriddialysebad og pass på at de flyter med begge membranene eksponert for badekaret. Etter 24 timer overfører du patronene til 1X PBS og suger den i ytterligere 24 timer. Etter den endelige dialysen, gjenopprette prøven ved å fjerne patronene fra badekaret, fjerne hetten og fjerne prøven med en gel lasting pipette tips.Plasser prøven i et rent 1,5 milliliter mikrocentrifugerør og kjøl den ned til den er klar til bruk. Forbered prøven i DLS-instrumentet i henhold til manuskriptretninger, og hent deretter data i minst ett minutt og sørg for at tellefrekvensen er konstant over hele anskaffelsestiden. Undersøk autokorrelasjonsdataene.Den lange grunnlinjen skal være flat og autokorrelasjonskurven skal være jevn med minimal spredning. Støy i dataene kan forbedres ved å innhente mer data. Hvis du vil utføre datareduksjon og analyse ved hjelp av Irena, starter du med å importere micelle i bakgrunnsdatasett.Plott eksemplet og bakgrunnen sammen på en loggloggskala og beregne prøven til bakgrunnsforholdet og kontroller den høye Q-asymptoteen. Beregne gjennomsnittsforholdet over dette Q-området, og bruk datamanipuleringsmakroen til å skalere bakgrunnen med det beregnede forholdet. Deretter plotter du det frasporede bakgrunnssignalet over Q og lagrer dataene med et nytt navn, og pass på at du ikke overskriver de opprinnelige dataene.Åpne modelleringsmakroen, og last deretter inn og plott inn bakgrunnsstredde data. Hvis du vil finne en omtrentlig modell for den ytre overflaten av polyelektrolyttkomplekse micelle, eller PCM, velger du flyt til moderat Q-område i datakontrollene, og pass på å inkludere svingninger hvis de er til stede. I modellkontroller velger du den første spredningspopulasjonen og kontrollerer at den er den eneste som er i bruk.Velg størrelsesfordeling for modell, velg ønsket distribusjonstype, og velg skjemafaktoren. Dette eksemplet er for en fleksibel sylinder som må legges til manuelt under brukerformfaktoren. Last ned og legg til den fleksible sylinderformfaktoren, og skriv deretter inn funksjonsnavnene og startverdiene for parametere en og to som tilsvarer lengden på sylinderen og Kuhn-lengden henholdsvis.Disse sylinderne er lengre enn det som kan løses av SAXS, slik at sylinderlengdeparameteren er fast til en stor verdi. Angi innledende parametere for søket ved å angi verdier i feltene skala, gjennomsnittsstørrelse og bredde. Klikk deretter beregn modell for å tegne den resulterende formfaktoren.Når rimelige parametere er funnet, klikker du fit modell for å utføre en ikke-lineær minst firkanter passer til dataene. Deretter modellerer spredningen av de enkelte polymerene i PCM-kjernen. Juster datakontrollene for å velge Q-området der overflødig spredning forekommer, som vanligvis er i det moderate til høye området.Legg til en annen spredningspopulasjon, og kontroller at den er den eneste som er i bruk. Velg enhetlig nivå for modellen, juster GDA-faktorene G og RG for å sikre at modellen ikke forutsier overdreven spredning ved lav Q og bruker tilpasnings-PB mellom markører makro for å få en innledende gjetning for disse parametrene. Når det gjelder formfaktoren, kan du utføre en ikke-lineær passform for enhetlig nivå-modellen.Hvis det finnes en diffraksjonstopp, legger du til en tredje modell for diffraksjonstoppen i Q-området av interesse. Når omtrentlige passformverdier er oppnådd for de enkelte spredningspopulasjonene, slå på alle tre sammen og optimaliser den kombinerte passformen. Til slutt må du kontrollere at hver verdi forblir fysisk rimelig og lagre passformen ved å velge lagre i mappe.Resultatet av denne prosedyren bør være en sammensatt modell som beskriver den lille vinkelen røntgenspitteringsdata godt over et stort spekter av størrelsesskalaer. Denne protokollen ble brukt til å designe, montere og karakterisere nukleinsyre polyelektrolytt komplekse micelles eller PCMs. Micelle kjernestørrelse er primært drevet av lengden på den ladede blokken av blokken copolymer og er i stor grad uavhengig av lengden på homopolymer.Dynamiske lysspøkedata ble anskaffet for sfæriske PCMer dannet av relativt lange blokkkikolymerer i korte en strandede oligonukleotider. Autokorrelasjonsfunksjonen forfalt til en flat verdi med enkelttidsskalaen, noe som resulterer i en topp i normalstørrelsen i repIS-størrelsesfordelingen. Kompleks liten engel x-ray spredning eller SAXS intensitet spectra kan være nøyaktig passform ved å kombinere modeller for flere romlige korrelasjoner som er til stede og multiangle lys spredning kan brukes til å utvide spredningsmålinger til lengre lengde skalaer.PCMer av varierende morfologi kan også avbildes med elektronmikroskopi for å bekrefte at kjerneradiier og form er i samsvar med verdiene som er hentet fra montering av SAXS-data. Når du monterer SAXS-data, er det viktig å ta hensyn til hver spredningsfunksjon og bruke gratis metoder som TEM for å sikre at du bruker riktig formfaktor.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Origami Inspired Self-assembly of Patterned and Reconfigurable Particles

Origami Inspirert Self-montering av mønstret og rekonfigurerbar Partikler

There are numerous techniques such as photolithography, electron-beam lithography and soft-lithography that can be used to precisely pattern two ...

Formation of Ordered Biomolecular Structures by the Self-assembly of Short Peptides

Dannelse av Bestilte biomolekylære strukturer ved selvbygging av Short Peptider

In nature, complex functional structures are formed by the self-assembly of biomolecules under mild conditions. Understanding the forces that control ...

Synthesis and Characterization of Functionalized Metal-organic Frameworks

Syntese og karakterisering av funksjon Metal-organisk Rammeverk

Metal-organic frameworks have attracted extraordinary amounts of research attention, as they are attractive candidates for numerous industrial and ...

Self-assembly of Complex Two-dimensional Shapes from Single-stranded DNA Tiles

Selvbygging av komplekse Todimensjonale figurer fra Single DNA Fliser

Current methods in DNA nano-architecture have successfully engineered a variety of 2D and 3D structures using principles of self-assembly. In this ...

Preparation and Characterization of Individual and Multi-drug Loaded Physically Entrapped Polymeric Micelles

Utarbeidelse og karakterisering av Individuell og Multi-drug Loaded fysisk innesperret Polymer Miceller

Amphiphilic block copolymers like polyethyleneglycol-block-polylactic acid (PEG-b-PLA) can self-assemble into micelles above their critical micellar ...

Synthesis and Characterization of Supramolecular Colloids

Syntese og karakterisering av supra Colloids

Control over colloidal assembly is of utmost importance for the development of functional colloidal materials with tailored structural and mechanical ...

On-line Analysis of Nitrogen Containing Compounds in Complex Hydrocarbon Matrixes

Online Analyse av nitrogenholdige forbindelser i Kompleks hydrokarbon Matriser

The shift to heavy crude oils and the use of alternative fossil resources such as shale oil are a challenge for the petrochemical industry. The ...

Facile Synthesis of Worm-like Micelles by Visible Light Mediated Dispersion Polymerization Using Photoredox Catalyst

Facile Synthesis of Worm-lignende Miceller av synlig lys mediert dispersjonspolymeriseringen Bruke Photoredox Catalyst

Presented herein is a protocol for the facile synthesis of worm-like micelles by visible light mediated dispersion polymerization. This approach begins ...

Anionic Polymerization of an Amphiphilic Copolymer for Preparation of Block Copolymer Micelles Stabilized by &#960;-&#960; Stacking Interactions

Anionic Polymerization of an Amphiphilic Copolymer for Preparation of Block Copolymer Micelles Stabilized by ÃƒÆ’Ã‚ÂÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬-ÃƒÆ’Ã‚ÂÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ Stacking Interactions

Anioniske polymerisering av en amfifil copolymer for forberedelse av blokk-kopolymer Miceller stabilisert av π-rc stabling Interactions

In this study, an amphiphilic copolymer that includes a core-forming block with phenyl groups was synthesized by living anionic polymerization of phenyl ...

Preparation and Characterization of C60/Graphene Hybrid Nanostructures

Preparation and Characterization of C60/Graphene Hybrid Nanostructures

Forberedelse og karakterisering av C60/Graphene Hybrid nanostrukturer

Physical thermal deposition in a high vacuum environment is a clean and controllable method for fabricating novel molecular nanostructures on graphene. We ...