Name: assembly and characterization of polyelectrolyte complex micelles
Uploaded: 2020-03-02T14:00:00
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Agradecemos a Phil Griffin e Tera Lavoie do Soft Matter Characterization Facility e advanced Electron Microscopy Facility, respectivamente, na Universidade de Chicago. Agradecemos também a Xiaobing Zuo e Soenke Seifert da Fonte De fótons Avançada do Laboratório Nacional de Argonne e do Centro NIST de Design de Materiais Hierárquicos (CHiMaD). Agradecemos a Jeff Ting e Michael Lueckheide por suas contribuições para este trabalho.

1. Preparação de Materiais
<ol><li>Pesar o polímero de diblock liofilizado e adicione água até quase o volume necessário para uma solução de estoque de 10 mg/mL concentração final. Vórtice em velocidade máxima por 2 min.</li>
	<li>Sonicate por 5 min. Desbloqueios muito longos podem exigir sonsoação adicional. A solução de estoque deve parecer completamente transparente e homogênea.</li>
	<li>Ajuste o pH para 7,4 usando NaOH ou HCl conforme necessário. Adicione água ao volume final. as soluções pLys...

Como mencionado acima, os protocolos aqui apresentados são escritos com foco em oligonucleotídeos como componente de polianion e pLys-PEG como copolímero de bloco cationic neutro, mas nós os testamos com uma variedade de polímeros, como poli (ácido acrílico), poliglutamato e PEG-poly (trimetilamônio de vinilbenzyl), e acreditamos que eles serão geralmente aplicáveis para a maioria dos pares polieletrotrólitos. Um parâmetro que pode precisar ser otimizado é a concentração de sal usada para aveia, pois deve ...

Quando politrólitos carregados opostomente são misturados em solução aquosa, o ganho de entropia com a liberação de suas contra-ataques causa a desmistura da solução em uma fase condensada rica em polímeros e um supernatante empobrecido de polímero1,2,3,4,5, um fenômeno conhecido como complexo de polieletrólito. Se um bloco hidrofílico neutro for conjugado a um ou ambos os polieletrólitos, ocorre a separação da fase nanoescala (Figura 1A). As nanopartículas de conchas de conchas de núcleo automontadas resultantes são várias vezes referidas como micelis complexos de polieletrólito (PCMs), micelis complexas de poliionion, complexos de ionômeros de blocos ou micelles coacervate-core por analogia à micellização surfactante, mesmo que todos os componentes do sistema sejam hidrofílicos6,7. A capacidade de um PCM de encapsular moléculas hidrofônicas como proteínas e ácidos nucleicos, bem como a extensa tunability oferecida pela arquitetura portadora de copolímero do bloco torna-os candidatos atraentes para o parto de moléculas terapêuticas no vivo8,9,10,11,12,13.
Fornecer ácidos nupcleicos terapêuticos para alvos celulares é um desafio particularmente importante, e para o qual os PCMs oferecem várias vantagens. Os ácidos nucleicos terapêuticos (DNA genético, mRNA e oligonucleotídeos como o siRNA) têm imenso potencial para melhorar a saúde humana, mas devem superar inúmeras barreiras biológicas e físicas para perceber que potenciais14,15,16. Os ácidos nucleicos nus nus são degradados por núcleos soro e celulares, são rapidamente retirados de circulação, e sua forte carga negativa torna difícil para eles penetrar em membranas celulares sem assistência. As abordagens atuais para superar essas barreiras incluem modificações químicas dispendiosas para evitar danos causados por nucleases e/ou encapsulamento em várias nanopartículas lipídicas montadas através de interações hidrofóbicas15,17,18. Embora esses métodos tenham se mostrado eficazes para injeções locais e segmentação hepática, o uso sistêmico apresenta limitações significativas de toxicidade, imunogenicidade e biodistribuição limitada16. Em contrapartida, os PCMs usam a carga negativa de ácidos nucleicos para condensar-os dentro do núcleo separado de fase, enquanto a coroa neutra fornece uma barreira estérica contra a degradação, bem como uma plataforma para incorporar ligands para melhorar a segmentação ou internalização11,19. Estudos in vitro e animais mostraram que os PCMs podem efetivamente entregar várias cargas de ácido nucleico20,21,22,23,24,mas fraquezas em nossa capacidade de prever propriedades de PCM, como tamanho, forma e estabilidade das propriedades dos polímeros constituintes, têm dificultado sua adoção mais ampla.
Trabalhos recentes do nosso grupo e de outros no campo começaram a abordar esse problema desenvolvendo estrutura-propriedade, e em alguns casos relações estrutura-propriedade-função para PCMs formados a partir de ácidos nucleicos e vários polímeros cationic neutros7,25,26,27. Dois temas consistentes que surgiram desses estudos são a importância do desenvolvimento de protocolos bem controlados e repetitivos para a montagem do PCM e o benefício do uso de múltiplas técnicas para caracterizar as nanopartículas resultantes. Polieletrólitos, particularmente aqueles com alta densidade de carga como ácidos nucleicos, interagem uns com os outros com muita força, e parecem prontamente ficar presos kineticamente ao misturar, resultando em preparações pcm que são altamente sensíveis a pequenas variações no procedimento e exibem alta polidispersão e má repetibilidade de lote a lote. Os PCMs também têm se mostrado adotar uma ampla gama de formas e tamanhos, dependendo das configurações de nível atômico de seus componentes, e capturar essa diversidade com qualquer técnica de caracterização individual é muito difícil, especialmente porque algumas técnicas comuns como dispersão dinâmica de luz (DLS) exigem suposições sobre a forma de partículas para sua interpretação.
Neste artigo, discutimos o design de materiais e a seleção para PCMs, com foco em oligonucleotídeos e copolímeros de dibloco neutros. Descrevemos então um protocolo de acaração de sal que usa altas concentrações de sal seguidas de diálise lenta para evitar armadilhas cinéticas durante o conjunto pcm. Os polieletrólitos são misturados em altas condições de sal onde atrações eletrostáticas são exibidas, então a concentração de sal é lentamente reduzida para permitir que os polieletrólitos se instalem em suas configurações mais energeticamente favoráveis, análogos ao processo de resfriamento lento do acarinamento térmico. Usando este protocolo, somos regularmente capazes de alcançar excepcionalmente baixa polidispersão e alta repetibilidade para PCMs oligonucleotídeos7,26. Por fim, descrevemos como quatro técnicas de medição separadas podem ser usadas para caracterizar PCMs em uma ampla gama de escalas de comprimento, da morfologia externa à estrutura interna: DLS, dispersão de luz multi-ângulo (MALS), dispersão de raios-X de pequeno ângulo (SAXS) e microscopia eletrônica de transmissão (TEM). Esperamos que esses protocolos permitam que mais pesquisadores explorem efetivamente as capacidades dessas nanopartículas interessantes.
Seleção e Preparação de Polímeros As propriedades pcm são fortemente influenciadas pelas características físicas e químicas dos polímeros constituintes, tornando a seleção de polímeros um passo crítico no processo de design. Os copolímeros de bloco mais bem caracterizados para PCMs ácidonusão desbloqueios lineares, como poli (lisina)-poli (glicol de etileno) (pLys-PEG), mas pcMs podem ser formados entre polieletrólitos e uma variedade de polímeros hidrofílicos neutros, que podem ser gerados de alta forma de absorção28. A escolha do grupo carregado afeta fortemente a estabilidade da emparelhamento e forma de micelles26, e o tamanho do PCM tem se mostrado para aumentar com o comprimento do bloco carregado5,7,26 (Figura 2),permitindo que as propriedades pcm sejam sintonizadas para os requisitos de um aplicativo desejado. Para bloqueios lineares, descobrimos que o bloco carregado deve ter pelo menos 10 cargas e ser fortemente cobrado no pH desejado. Blocos mais carregados podem promover a formação de PCM com oligonucleotídeos como o siRNA, que são difíceis de complexos com blocos mais curtos21. Observamos com sucesso a formação de PCM com comprimentos de bloco até 200, e a literatura descreve polímeros mais longos. Mais flexibilidade está disponível na escolha dos blocos neutros24,mas a experiência mostrou que blocos neutros muito curtos levam à agregação em vez da formação de nanopartículas, e que o comprimento mínimo neutro aumenta com o comprimento do bloco carregado. Para pLys-PEG, um PEG MW de pelo menos 3.000-5.000 é necessário para comprimentos de pLys abaixo de ~50, e comprimentos mais longos são necessários à medida que o bloco carregado é aumentado ainda mais. O aumento do comprimento do bloco neutro resulta no aumento do tamanho do PCM, particularmente na espessura da concha, devido à aglomeração estérica dos polímeros neutros.
Este manuscrito apresenta um protocolo para preparar PCMs de pLys-PEG de alta pureza liofilizada e oligonucleotídeos de quantidade conhecida, mas deve ser facilmente adaptável a outros sistemas também. Testamos com sucesso com vários polipeptídeos carregados, incluindo poliarginina e ácido poliglutâmico, bem como vários polieletrolitos sintéticos, como ácido poliacrílico e poli(trimetilamônio de vinilbenzyl). Também descrevemos o preparo de PCMs com uma razão stoichiométrica de cargas de polieletrólito, mas isso é facilmente modificado. Achamos mais fácil trabalhar em unidades de concentração de carga (c.c.), que também acomoda naturalmente polímeros que não estão totalmente carregados. Se qualquer polímero não for bem caracterizado, deve-se tomar cuidado para determinar com precisão os comprimentos/massas de polímeros e garantir que o excesso de sal não esteja presente além do necessário para a neutralização da carga por diálise, por exemplo. A presença de qualquer água retida também deve ser contabilizada quando as concentrações forem calculadas. A concentração de ácido nucleico pode ser convenientemente quantificada pela absorção a 260 nm, e a presença ou ausência de fosfatos terminais deve ser considerada no cálculo do c.c.
Ao utilizar oligonucleotídeos como polianions, o estado de hibridização e estrutura química ajudam a determinar a propensão à automontagem e às características do PCM5,7,26. A otimização deles, dentro dos requisitos de eficácia biológica se usar PCMs para entrega, aumentará a probabilidade de formar as estruturas desejadas. Ferramentas úteis para analisar a hibridização incluem funções MATLAB para ácidos nucleicos, NUPACK29e IDT OligoAnalyzer. Recomendamos analisar uma sequência de candidatos para entender a força da vinculação a 1) em si mesmo em uma formação de grampo de cabelo; 2) outra cópia da mesma sequência (auto-dimer); e 3) a outros oligonucleotídeos presentes no sistema. As temperaturas de derretimento de DNA e RNA para uma sequência específica também podem ser calculadas usando o método vizinho mais próximo30,31. O aperto térmico de ácidos nucleicos (passo 2.3) desnatura qualquer estrutura secundária residual nos nucleotídeos individuais e promove o equilíbrio dobrável.
Caracterização e Análise do PCM Uma ampla gama de técnicas estão disponíveis para caracterizar nanopartículas, incluindo dispersão de luz estática e dinâmica, pequena dispersão de ângulo suporitados de elétrons ou nêutrons e microscopia eletrônica. Neste artigo, fornecemos protocolos para duas técnicas de dispersão de luz, dispersão de raios-X de pequeno ângulo e duas técnicas de microscopia eletrônica.
O DLS mede a autocorrelação das flutuações temporais na intensidade de dispersão em um ângulo do movimento browniano da amostra. A montagem destes dados pode fornecer raio hidrodinâmico e polidispersão para micelas esféricas(Figura 3). A dispersão de luz de múltiplos ângulos (MALS) mede a intensidade de dispersão estática em muitos ângulos. Esta dependência angular descreve a forma da nanopartículas, mas limita-se a escalas de comprimento maiores que ~50 nm para luz visível, o que limita sua eficácia para nanopartículas menores. Ambas as técnicas são baseadas na incompatibilidade de índicerefrativo e descrevem principalmente as dimensões externas da nanopartícula.
A dispersão de raios-X de pequeno ângulo (SAXS) usa raios-X como sonda de dispersão, e seu comprimento de onda mais curto permite medições sobre uma faixa de ~0,1-100 nm. Encaixar a intensidade de dispersão observada versus ângulo (convencionalmente expresso como momentum transfer q) fornece informações sobre morfologia PCM (ou seja, tamanho e forma) e também estrutura interna. Se uma calibração de intensidade absoluta estiver disponível, e se a intensidade de dispersão pode ser extrapolada para ângulo zero, a massa pcm e o número de agregação também podem ser estimados32, tornando o SAXS um método extremamente versátil e valioso. A dispersão de nêutrons de pequeno ângulo (SANS) é sensível em uma gama semelhante de escalas de comprimento, mas só está disponível em instalações especializadas e não será explicitamente discutida neste artigo33,34,35.
Nos últimos anos, vimos o advento dos instrumentos SAXS, mas descobrimos que as fontes síncrotrons são mais adequadas para a caracterização do PCM, pois sua maior intensidade permite que os dados sejam coletados muito mais rapidamente para essas amostras de baixo contraste. Fornecemos um breve protocolo para a aquisição de dados PCM SAXS na Beamline 12-ID-B no Advanced Photon Source (Argonne National Laboratory, EUA) de uma perspectiva de usuário. Este protocolo deve ser aplicável à maioria das fontes síncrotrons, mas consultar a equipe local antes de propor um experimento é altamente recomendado. Também fornecemos um protocolo de redução e análise de dados utilizando irena36, um conjunto gratuito de macros escritas para Igor Pro. Irena inclui um conjunto versátil de fatores de forma para modelar dados SAXS e permite a construção de modelos multicomponentes capazes de descrever o complexo perfil de dispersão de PCMs (ver Resultados Representativos, Figura 4). Irena também tem documentação abrangente e tutoriais disponíveis online. Antes de tentar os procedimentos abaixo, recomendamos a familiarização com estes, particularmente o tutorial "Modelagem de dados SAXS com duas populações principais de dispersão".
Danos causados por radiação são uma preocupação para a dispersão de raios-X, mas várias medidas podem ser empregadas para minimizá-lo. Em particular, recomendamos o uso de uma configuração de célula de fluxo com uma bomba de seringa e amostra de PCM fluindo durante a aquisição de dados, em vez de um capilar selado. Isso também simplifica muito a subtração de fundo. Também sugerimos tomar múltiplas exposições da amostra fluindo em vez de uma mais longa, a fim de limitar o fluxo que qualquer volume único de amostra vê e permitir a comparação dos dados de exposição para identificar qualquer dano.
Em contraste com as técnicas de dispersão, que geralmente requerem a adaptação para interpretar, a microscopia eletrônica de transmissão (TEM) fornece uma imagem visual espacial real das nanopartículas, passando um feixe de elétrons através da amostra e projetando uma imagem em uma tela cintilante(Figura 5). Apresentamos protocolos para duas técnicas tem neste artigo. Cryo TEM congela amostras de micelle em uma fina camada de gelo víreso, preservando conformação estrutural com substâncias estrangeiras mínimas, ótima para micelles ≤~10-100 nm em raio. A mancha negativa TEM usa um sal de metal pesado (por exemplo, urânio) para cercar a amostra depois de ter sido seca na superfície de uma grade. A densa mancha espalhará mais elétrons do que a amostra, adicionando contraste e produzindo uma imagem negativa da amostra. Cryo TEM é recomendado para imagens de alta qualidade. No entanto, é mais caro, demorado, e pode não fornecer contraste suficiente. Quando isso é uma preocupação, amostras manchadas negativas devem ser usadas. Exemplos de cada um são mostrados na Figura 5.
Cada uma dessas técnicas relata aspectos ligeiramente diferentes das nanopartículas, com diferentes pontos fortes e limitações. A dispersão de luz está prontamente disponível, e muitas vezes é a abordagem mais rápida, mas tem limitações substanciais em tamanho e resolução de forma. O SAXS pode fornecer informações sobre uma grande gama de escalas de comprimento a um throughput razoavelmente alto, mas requer equipamentos especializados para adquirir os dados, bem como modelá-los para interpretá-los. As imagens TEM são simples de interpretar, mas podem ser limitadas em contraste e são inerentemente baixas. Nossa experiência mostrou que o uso de múltiplas técnicas para caracterização aumenta muito as informações que podem ser obtidas sobre propriedades pcm e simplifica a interpretação de conjuntos de dados obtidos de cada um sozinho. Por exemplo, saxs e TEM examinam principalmente o núcleo denso de um PCM, enquanto a dispersão de luz relata as dimensões globais da nanopartícula. Assim, combiná-los permite a medição do tamanho do núcleo e da coroa. A capacidade da TEM de adquirir imagens espaciais reais pode fornecer dados de verdade terrestre para permitir a seleção de fatores de formulário apropriados para a modelagem de dados SAXS que poderiam ser ambíguos. Este artigo descreve protocolos para todas as quatro técnicas, e um processo de exemplo para usá-las para caracterizar uma amostra desconhecida é dado na seção discussão.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>70 mm circle filter paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1001-070</td>
			<td>Filter paper for wicking during grid prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon Film TEM grid</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>CF200-Cu</td>
			<td>TEM grid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAWN</td>
			<td>Wyatt Technology</td>
			<td>DAWN</td>
			<td>MALS instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA oligonucleotide</td>
			<td>Integrated DNA Nanotechnologies Inc</td>
			<td></td>
			<td>Custom oligonucleotide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lacey Carbon TEM grid</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>LC200-Cu</td>
			<td>TEM grid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methoxy-poly(ethylene glycol)-block-poly(l-lysine hydrochloride) PEG5k - PLKC50</td>
			<td>Alamanda Polymers Inc</td>
			<td>mPEG5K-b-PLKC50</td>
			<td>Example block copolymer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td></td>
			<td>Ultrapure water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>For measuring nucleic acid concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>negative-action tweezers</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>N7</td>
			<td>Tweezers for grid preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm &#34;M&#34;</td>
			<td>Bemis Company Inc</td>
			<td>PM996</td>
			<td>Laboratory film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantifoil Holey Carbon TEM grid</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>Q210CR1.3</td>
			<td>TEM grid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Research Goniometer and Laser Light Scattering System</td>
			<td>Brookhaven Instruments</td>
			<td>BI-200SM</td>
			<td>DLS/MALS instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide-A-Lyzer G2 2K 0.5 mL</td>
			<td>Thermo Scientific Pierce Protein Biology</td>
			<td>87723</td>
			<td>Dialysis cartridge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>small volume cuvette</td>
			<td>Brookhaven Instruments</td>
			<td>BI-SVC</td>
			<td>Cuvette for DLS/MALS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solarus 950 Advanced Plasma System</td>
			<td>Gatan</td>
			<td>Solarus 950</td>
			<td>Plasma system for TEM grids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Talos TEM</td>
			<td>FEI</td>
			<td>Talos</td>
			<td>TEM used for cryo samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tecnai Spirit TEM</td>
			<td>FEI</td>
			<td>Spirit</td>
			<td>TEM used for dry samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl Formate</td>
			<td>SPI-Chem</td>
			<td>16984-59-1</td>
			<td>For negative staining samples for TEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitrobot</td>
			<td>FEI</td>
			<td>Vitrobot</td>
			<td>Vitrification robot for cryo grid preparation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assembly and characterization of polyelectrolyte complex micelles

Micelios complexos de polieletrólito (PCMs), nanopartículas de concha soca formadas pela automontagem de polímeros carregados em solução aquosa, fornecem uma plataforma poderosa para explorar a física das interações de polieletrólitos e também oferecem uma solução promissora para o problema premente de entregar oligonucleotídeos terapêuticos in vivo. O desenvolvimento de relações preditivas de estrutura-propriedade para PCMs tem se mostrado difícil, em parte devido à presença de fortes armadilhas cinéticas durante a auto-montagem da nanopartículas. Este artigo discute critérios para a escolha de polímeros para construção de PCM e fornece protocolos baseados em aanneling de sal que permitem a montagem de nanopartículas repetitivas e de baixa polidispersão. Também discutimos a caracterização do PCM usando dispersão de luz, dispersão de raios-X de pequeno ângulo e microscopia eletrônica.

Para ilustrar os métodos de caracterização descritos acima, mostramos resultados típicos para PCMs montados a partir de oligonucleotídeos e blocos de copolímeros de vários comprimentos e químicas(Figura 1). A Figura 2 fornece um exemplo de como o tamanho do núcleo PCM (conforme determinado a partir de SAXS e TEM, Figura 4 e Figura 5) variou com comprimento de bloco carregado. <strong class="xfi...

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Assembly and Characterization of Polyelectrolyte Complex Micelles

Fornecemos protocolos e dados representativos para projetar, montar e caracterizar micelas complexas de polieletrólito, nanopartículas de casca de núcleo formadas por polieletrólitos e copolímeros de blocos não carregados hidrofílicos.

Montagem e Caracterização de Micelis Complexos polieletrolitos

Polyelectrolyte complex micelles (PCMs), core-shell nanoparticles formed by self-assembly of charged polymers in aqueous solution, provide a powerful ...

Este método descreve o caminho completo do projeto, montagem e caracterização de micelas complexas polieletrólitos que são nanopartículas que são formadas a partir da auto-montagem de polímeros carregados de forma oposta. Alguns dos principais desafios com a automontagem polieletrico são evitar armadilhas cinéticas e caracterizar as nanopartículas. A técnica de ressarbramento de sal que descrevemos permite o conjunto repetitivo de micelas com baixa dispersão tanto em tamanho quanto em forma e descrevemos métodos de caracterização, incluindo dispersão de luz, dispersão de raios-X de pequeno ângulo e microscopia eletrônica.A entrega de ácidos nucleicos terapêuticos é um desafio de longa data para a nanomedicina. Estes micelas complexos polieletrolitos aproveitam a forte carga negativa do ácido nucleico para sequestra-los no núcleo da micelle onde a coroa de polímero neutro os protege de núcleos e resposta imune. O método de montagem deve ser aplicável a qualquer tipo de polímeros carregados.Testamos-os com vários polianões e policações e o método de caracterização deve ser aplicável a quaisquer nanopartículas auto-montadas, incluindo nanopartículas surfactantes e outros sistemas movidos a hidrofobicamente. Comece incubando a solução de oligonucleotídeo a 70 graus Celsius por cinco minutos. Após a incubação, esfrie-o por 15 minutos à temperatura ambiente para resfriar termicamente os ácidos nucleicos, em seguida, adicione 40 microliters de 20 milmolar de concentração carregada diblock copolymer.Vórtice a solução imediatamente e incuba-a por cinco minutos em temperatura ambiente. Para realizar o sal anneal, adicione a solução de cloreto de sódio à solução de oligonucleotídeo para uma concentração final de um molar e vórtice por 10 segundos em velocidade máxima. Incubar a mistura por 10 minutos em temperatura ambiente e, em seguida, proceder com o carregamento no cartucho de diálise.Antes do carregamento, rotule os cartuchos com marcador permanente e mergulhe-os em tampão por pelo menos dois minutos para hidratar as membranas. Remova a tampa torcendo no sentido anti-horário e carregue a amostra usando uma ponta de pipeta de carregamento de gel. Aperte suavemente a membrana para remover o excesso de ar e substitua a tampa.Coloque os cartuchos em 1X PBS 0,5 banho de diálise de cloreto de sódio molar certificando-se de que eles estão flutuando com ambas as membranas expostas ao banho. Após 24 horas, transfira os cartuchos para 1X PBS e mergulhe-o por mais 24 horas. Após a diálise final, recupere a amostra removendo os cartuchos do banho, removendo a tampa e removendo a amostra com uma ponta de pipeta de carregamento de gel.Coloque a amostra em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro limpo e leve à geladeira até estar pronta para usar. Prepare a amostra no instrumento DLS de acordo com as instruções do manuscrito e, em seguida, adquira dados por pelo menos um minuto certificando-se de que a taxa de contagem é constante durante todo o tempo de aquisição. Examine os dados de autocorrelação.A linha de base de longa duração deve ser plana e a curva de autocorrelação deve ser suave com dispersão mínima. O ruído nos dados pode ser melhorado adquirindo mais dados. Para realizar a redução e análise de dados usando o Irena, comece importando micelle em conjuntos de dados de fundo.Plote a amostra e o fundo juntos em uma escala de log-log e calcule a proporção amostra-fundo e verifique a assíntota Q alta. Calcule a razão média sobre esta faixa Q e use a macro de manipulação de dados para dimensionar o fundo com a razão calculada. Em seguida, plote o sinal subtraído de fundo sobre Q e salve os dados com um novo nome certificando-se de não substituir os dados originais.Abra a macro de modelagem e, em seguida, carregue e plote os dados subtraídos de fundo. Para encontrar um modelo aproximado para a superfície externa da micela complexa polieletrílica, ou PCM, selecione o fluxo para faixa Q moderada nos controles de dados, certificando-se de incluir oscilações se estiverem presentes. Nos controles de modelo, selecione a primeira população dispersante e certifique-se de que ela é a única em uso.Selecione a distribuição de tamanho para o modelo, escolha o tipo de distribuição desejado e selecione o fator de forma. Este exemplo é para um cilindro flexível que deve ser adicionado manualmente sob o fator de forma do usuário. Baixe e adicione o fator de forma flexível do cilindro, em seguida, insira os nomes da função e os valores iniciais para os parâmetros um e dois que correspondem ao comprimento do cilindro e do comprimento kuhn, respectivamente.Estes cilindros são mais longos do que podem ser resolvidos pelo SAXS para que o parâmetro de comprimento do cilindro seja fixado a um grande valor. Defina parâmetros iniciais para a pesquisa inserindo valores na escala, tamanho médio e campos de largura. Em seguida, clique em calcular o modelo para desenhar o fator de forma resultante.Uma vez encontrados parâmetros razoáveis, clique no modelo fit para executar um mínimo não linear de quadrados adequados aos dados. Em seguida, modele a dispersão dos polímeros individuais dentro do núcleo PCM. Ajuste os controles de dados para selecionar a faixa Q onde ocorre o excesso de dispersão que normalmente está na faixa moderada a alta.Adicione uma segunda população dispersante e certifique-se de que é a única em uso. Selecione o nível unificado para o modelo, ajuste os fatores G e RG do GDA para garantir que o modelo não preveja dispersão excessiva no Q baixo e use o PB fit entre os cursores macro para obter um palpite inicial para esses parâmetros. Quanto ao fator de forma, realize um ajuste não linear para o modelo de nível unificado.Se houver um pico de difração, adicione um terceiro modelo para o pico de difração na faixa Q de interesse. Uma vez que valores de ajuste aproximados são obtidos para as populações dispersantes individuais, ligue os três juntos e otimize o ajuste combinado. Por fim, verifique se cada valor permanece fisicamente razoável e salve o ajuste selecionando a loja na pasta.O resultado deste procedimento deve ser um modelo composto que descreve os dados de dispersão de raios-X de pequeno ângulo bem sobre uma grande variedade de escalas de tamanho. Este protocolo foi usado para projetar, montar e caracterizar micelas complexas de ácido nucleico ou PCMs. O tamanho do núcleo de Miceelle é impulsionado principalmente pelo comprimento do bloco carregado do copolímero do bloco e é em grande parte independente do comprimento do homopolímero.Dados dinâmicos de dispersão de luz foram adquiridos para PCMs esféricos formados a partir de copolímeros de blocos relativamente longos em oligonucleotídeos de um único fio. A função de correção automática decaiu para um valor plano com a escala de tempo única resultando no pico de tamanho único na distribuição de tamanho repIS. A dispersão complexa de raios-X de anjo pequenos ou espectros de intensidade de SAXS podem ser encaixadas com precisão, combinando modelos para as múltiplas correlações espaciais que estão presentes e a dispersão de luz multiangle pode ser usada para estender as medições de dispersão para escalas de comprimento mais longas.PcMs de morfologia variada também podem ser imagens com microscopia eletrônica para verificar se raios e forma do núcleo são consistentes com os valores obtidos a partir da montagem de dados SAXS. Ao ajustar os dados do SAXS, é importante explicar cada recurso de dispersão e usar métodos complementares como o TEM para ter certeza de que você está usando o fator de forma correto.

Research

JoVE Journal

Chemistry

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