Name: assembly and characterization of polyelectrolyte complex micelles
Uploaded: 2020-03-02T14:00:00
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Agradecemos a Phil Griffin y Tera Lavoie de soft Matter Characterization Facility y Advanced Electron Microscopy Facility, respectivamente, en la Universidad de Chicago. También agradecemos a Xiaobing Zuo y Soenke Seifert de la Fuente de Fotones Avanzados en el Laboratorio Nacional de Argonne y el Centro NIST para el Diseño de Materiales Jerárquicos (CHiMaD) por su apoyo. Agradecemos a Jeff Ting y Michael Lueckheide por sus contribuciones a este trabajo.

1. Preparación de materiales
<ol><li>Pesar el polímero dibloque liofilizado y añadir agua hasta casi el volumen necesario para una solución en stock de 10 mg/ml de concentración final. Vórtice a máxima velocidad durante 2 min.</li>
	<li>Sonicato durante 5 min. Los bloques muy largos pueden requerir sonicación adicional. La solución en stock debe parecer completamente transparente y homogénea.</li>
	<li>Ajuste el pH a 7.4 usando NaOH o HCl según sea necesario. Agregue agua al volumen final. Las soluciones pLy...

Como se mencionó anteriormente, los protocolos presentados aquí están escritos con un enfoque en oligonucleótidos como el componente de polianión y pLys-PEG como el copolímero de bloque catiónico-neutral, pero los hemos probado con una variedad de polímeros, tales como poli(ácido acrílico), poliglutamato, y PEG-poly(trimetilamonio de vinilo-vinilobenzil), y creemos que serán generalmente aplicables para la mayoría de los pares de polielectrolitos. Un parámetro que puede necesitar ser optimizado es la concent...

Cuando los polielectrolitos cargados de forma opuesta se mezclan en solución acuosa, la ganancia de entropía por la liberación de sus contraiones provoca la desmezcla de la solución en una fase condensada rica en polímeros y un sobrenadante agotado por polímeros1,2,3,4,5, un fenómeno conocido como complejo de polielectrolitos. Si un bloque hidrófilo neutro se conjuga con uno o ambos polielectrolitos, se produce una separación de fase a nanoescala en su lugar(Figura 1A). Las nanopartículas autoensambladas resultantes de la cáscara del núcleo se conocen como micelas complejas de polielectrolito (PCM), micelas complejas de polión, complejos de ionómeros de bloques o micelas de núcleo de coacervate por analogía a la micelar surfactante, aunque todos los componentes del sistema sean hidrófilos6,7. La capacidad de un PCM para encapsular moléculas hidrófilas como proteínas y ácidos nucleicos, así como la amplia afinación que ofrece la arquitectura portadora de copolímero sin bloques los convierte en candidatos atractivos para la entrega de moléculas terapéuticas in vivo8,9,10,11,12,13.
La entrega de ácidos nucleicos terapéuticos a las dianas celulares es un desafío particularmente importante, y uno para el que los PCM ofrecen varias ventajas. Los ácidos nucleicos terapéuticos (ADN genético, ARNm y oligonucleótidos como el siRNA) tienen un inmenso potencial para mejorar la salud humana, pero deben superar numerosas barreras biológicas y físicas para darse cuenta de que el potencial14,15,16. Los ácidos nucleicos desnudos se degradan por nucleasas séricas y celulares, se eliminan rápidamente de la circulación, y su fuerte carga negativa hace que sea difícil para ellos penetrar las membranas celulares sin ayuda. Los enfoques actuales para superar estas barreras incluyen costosas modificaciones químicas para prevenir daños causados por nucleasas y/o encapsulación en varias nanopartículas lipídicas ensambladas a través de interacciones hidrofóbicas15,17,18. Si bien estos métodos han demostrado ser eficaces para las inyecciones locales y la segmentación hepática, el uso sistémico presenta limitaciones significativas de toxicidad, inmunogenicidad, y la biodistribución limitada16. Por el contrario, los PCM utilizan la carga negativa de los ácidos nucleicos para condensarlos dentro del núcleo separado por fases, mientras que la corona neutra proporciona una barrera esterica contra la degradación, así como una plataforma para incorporar ligandos para mejorar la orientación o internalización11,19. Estudios in vitro y en animales han demostrado que los PCM pueden entregar eficazmente varias cargas útiles de ácido nucleico20,21,22,23,24, pero las debilidades en nuestra capacidad para predecir las propiedades de PCM como el tamaño, la forma, y la estabilidad de las propiedades de los polímeros constituyentes han obstaculizado su adopción más amplia.
El trabajo reciente de nuestro grupo y otros en el campo ha comenzado a abordar este problema mediante el desarrollo de estructura-propiedad, y en algunos casos relaciones estructura-propiedad-función para PCM formados a partir de ácidos nucleicos y diversos polímeros catiónicos neutros7,25,26,27. Dos temas consistentes que han surgido de estos estudios son la importancia de desarrollar protocolos bien controlados y repetibles para el ensamblaje de PCM y la ventaja de utilizar múltiples técnicas para caracterizar las nanopartículas resultantes. Los polielectrolitos, particularmente aquellos con alta densidad de carga como los ácidos nucleicos, interactúan entre sí con mucha fuerza, y parecen quedar fácilmente atrapados cinéticamente al mezclar, lo que resulta en preparaciones PCM que son altamente sensibles a pequeñas variaciones en el procedimiento y muestran alta polidispersidad y mala repetibilidad de lote a lote. También se ha demostrado que los PCM adoptan una amplia gama de formas y tamaños dependiendo de las configuraciones de nivel atómico de sus componentes, y capturar esta diversidad con cualquier técnica de caracterización individual es muy difícil, particularmente porque algunas técnicas comunes como la dispersión dinámica de la luz (DLS) requieren suposiciones sobre la forma de las partículas para su interpretación.
En este artículo, discutimos el diseño de materiales y la selección para PCMs, con un enfoque en oligonucleótidos y copolímeros dibloque catiónicos neutros. A continuación, describimos un protocolo de recocido de sal que utiliza altas concentraciones de sal seguidas de diálisis lenta para evitar la captura cinética durante el montaje de PCM. Los polielectrolitos se mezclan en condiciones de alta sal donde se examinan las atracciones electrostáticas, luego la concentración de sal se reduce lentamente para permitir que los polielectrolitos se asienten en sus configuraciones más favorables energéticamente, análogas al lento proceso de enfriamiento del recocido térmico. Utilizando este protocolo, somos regularmente capaces de lograr una polidispersidad excepcionalmente baja y alta repetibilidad para PCMs de oligonucleótidos7,26. Por último, describimos cómo se pueden utilizar cuatro técnicas de medición separadas para caracterizar los PCM en una amplia gama de escalas de longitud, desde la morfología externa hasta la estructura interna: DLS, dispersión de luz multiángulo (MALS), dispersión de rayos X de ángulo pequeño (SAXS) y microscopía electrónica de transmisión (TEM). Esperamos que estos protocolos permitan a más investigadores explorar eficazmente las capacidades de estas nanopartículas interesantes.
Selección y preparación de polímeros Las propiedades de PCM están fuertemente influenciadas por las características físicas y químicas de los polímeros constituyentes, haciendo que la selección de polímeros sea un paso crítico en el proceso de diseño. Los copolímeros de bloque más bien caracterizados para PCM de ácido nucleico son dibloques lineales como poli(lisina)-poli(etilenglicol) (pLys-PEG), pero los PCM se pueden formar entre polielectrolitos y una variedad de polímeros hidrofílicos con carga neutra, que se pueden generar de una manera de alto rendimiento28. Se ha demostrado que la elección del grupo cargado afecta en gran medida a la estabilidad del emparejamiento iónico y la forma de las micelas26,y se ha demostrado que el tamaño de PCM aumenta con la longitud del bloque cargado5,7,26 (Figura 2), lo que permite ajustar las propiedades pcM a los requisitos de una aplicación deseada. Para los bloques lineales, hemos encontrado que el bloque cargado debe tener al menos 10 cargas y ser fuertemente cargado en el pH deseado. Los bloques cargados más largos pueden promover la formación de PCM con oligonucleótidos como el siRNA, que son difíciles de complejos con bloques más cortos21. Hemos observado con éxito la formación de PCM con longitudes de bloque de hasta 200, y la literatura describe polímeros más largos. Hay más flexibilidad disponible en la elección de los bloques neutros24,pero la experiencia ha demostrado que los bloques neutros muy cortos conducen a la agregación en lugar de la formación de nanopartículas, y que la longitud neutra mínima aumenta con la longitud de bloque cargada. Para pLys-PEG, se requiere un MW PEG de al menos 3.000–5.000 para longitudes de pLys inferiores a 50 euros, y se requieren longitudes más largas a medida que el bloque cargado se incrementa aún más. El aumento de la longitud del bloque neutro da como resultado un mayor tamaño de PCM, particularmente el espesor de la cáscara, debido al hacinamiento escorésico de los polímeros neutros.
Este manuscrito presenta un protocolo para preparar PCMs a partir de pLys-PEG liofilizados de alta pureza y oligonucleótidos de cantidad conocida, pero debe ser fácilmente adaptable a otros sistemas también. Lo hemos probado con éxito con varios polipéptidos cargados, incluyendo poliarginina y ácido poliglutámico, así como varios polielectrolitos sintéticos, como el ácido poliacrílico y el poli(trimetilamonio de vinilobencilo). También describimos la preparación de PCM con una relación estequiométrica de cargas de polielectrolito, pero esto se modifica fácilmente. Nos resulta más fácil trabajar en unidades de concentración de carga (c.c.), que también acomodan naturalmente polímeros que no están completamente cargados. Si alguno de los polímeros no está bien caracterizado, se debe tener cuidado de determinar con precisión las longitudes/masas de polímeros y asegurarse de que el exceso de sal no está presente más allá del necesario para la neutralización de la carga mediante diálisis, por ejemplo. La presencia de cualquier agua retenida también debe tenerse en cuenta cuando se calculan las concentraciones. La concentración de ácido nucleico puede cuantificarse convenientemente mediante absorbancia a 260 nm, y se debe considerar la presencia o ausencia de fosfatos terminales al calcular el c.c.
Cuando se utilizan oligonucleótidos como poliolaiones, el estado de hibridación y la estructura química ayudan a determinar la propensión al autoensamblaje y las características del PCM5resultante,7,26. Optimizarlos, dentro de los requisitos de eficacia biológica si se utilizan PCMs para la entrega, aumentará la probabilidad de formar las estructuras deseadas. Las herramientas útiles para analizar la hibridación incluyen funciones de MATLAB para ácidos nucleicos, NUPACK29e IDT OligoAnalyzer. Recomendamos analizar una secuencia candidata para entender la fuerza de la unión a 1) sí mismo en una formación de horquilla; 2) otra copia de la misma secuencia (autodimer); y 3) a otros oligonucleótidos presentes en el sistema. Las temperaturas de fusión de ADN y ARN para una secuencia específica también se pueden calcular utilizando el método de vecino más cercano30,31. El recocido térmico de ácidos nucleicos (paso 2.3) desnaturaliza cualquier estructura secundaria residual en los nucleótidos individuales y promueve el plegado de equilibrio.
Caracterización y análisis de PCM Una amplia gama de técnicas están disponibles para caracterizar nanopartículas, incluyendo dispersión de luz estática y dinámica, dispersión de pequeños ángulos de electrones o neutrones, y microscopía electrónica. En este artículo, proporcionamos protocolos para dos técnicas de dispersión de luz, dispersión de rayos X de ángulo pequeño y dos técnicas de microscopía electrónica.
DLS mide la autocorrelación de fluctuaciones temporales en la intensidad de dispersión en un ángulo desde el movimiento Browniano de la muestra. La colocación de estos datos puede proporcionar radio hidrodinámico y polidispersidad para las micelas esféricas(Figura 3). La dispersión de luz de múltiples ángulos (MALS) mide la intensidad de dispersión estática en muchos ángulos. Esta dependencia angular describe la forma de la nanopartícula, pero se limita a escalas de longitud superiores a 50 nm para la luz visible, lo que limita su eficacia para nanopartículas más pequeñas. Ambas técnicas se basan en la discordancia del índice de refracción y describen principalmente las dimensiones externas de la nanopartícula.
La dispersión de rayos X de ángulo pequeño (SAXS) utiliza rayos X como sonda de dispersión, y su longitud de onda más corta permite mediciones en un rango de 0,1 a 100 nm. El ajuste de la intensidad de dispersión observada frente al ángulo (expresada convencionalmente como transferencia de impulso q) proporciona información sobre la morfología de PCM (es decir, tamaño y forma) y también la estructura interna. Si se dispone de una calibración de intensidad absoluta, y si la intensidad de dispersión se puede extrapolar a ángulo cero, la masa PCM y el número de agregación también se pueden estimar32,lo que convierte a SAXS en un método extremadamente versátil y valioso. La dispersión de neutrones de ángulo pequeño (SANS) es sensible en un rango similar de escalas de longitud, pero sólo está disponible en instalaciones especializadas y no se discutirá explícitamente en este artículo33,34,35.
En los últimos años se ha advenido los instrumentos SAXS de sobremesa, pero nos encontramos con que las fuentes de sincrotrón son más adecuadas para la caracterización de PCM, ya que su mayor intensidad permite que los datos se recopilen mucho más rápido para estas muestras de bajo contraste. Proporcionamos un breve protocolo para adquirir datos PCM SAXS en Beamline 12-ID-B en la Fuente Avanzada de Fotones (Argonne National Laboratory, USA) desde la perspectiva del usuario. Este protocolo debe ser aplicable a la mayoría de las fuentes de sincrotrón, pero es muy recomendable consultar con el personal local antes de proponer un experimento. También proporcionamos un protocolo de reducción y análisis de datos utilizando Irena36,un conjunto gratuito de macros escritas para Igor Pro. Irena incluye un conjunto versátil de factores de forma para modelar datos SAXS y permite la construcción de modelos multicomponente que son capaces de describir el perfil de dispersión complejo de los PCM (ver Resultados Representativos, Figura 4). Irena también tiene documentación completa y tutoriales disponibles en línea. Antes de intentar los procedimientos siguientes, se recomienda familiarizarse con estos, especialmente el tutorial "Modelado de datos SAXS con dos poblaciones principales de dispersores".
El daño por radiación es una preocupación para la dispersión de rayos X, pero se pueden emplear varias medidas para minimizarlo. En particular, recomendamos utilizar una configuración de celda de flujo con una bomba de jeringa y una muestra de PCM que fluya durante la adquisición de datos, en lugar de un capilar sellado. Esto también simplifica en gran medida la resta de fondo. También sugerimos tomar múltiples exposiciones de la muestra que fluye en lugar de una más larga con el fin de limitar el flujo que ve cualquier volumen único de la muestra y para permitir la comparación de los datos de exposición para identificar cualquier daño.
A diferencia de las técnicas de dispersión, que generalmente requieren ajuste para interpretar, la microscopía electrónica de transmisión (TEM) proporciona una imagen visual de espacio real de las nanopartículas pasando un haz de electrones a través de la muestra y proyectando una imagen en una pantalla de centelleo(Figura 5). Presentamos protocolos para dos técnicas TEM en este artículo. Cryo TEM congela las muestras de micelas en una fina capa de hielo vítreo, preservando la conformación estructural con sustancias extrañas mínimas, óptima para micelas de 10-100 nm de radio. La tetina negativa TEM utiliza una sal de metal pesado (por ejemplo, uranio) para rodear la muestra después de que se haya secado en la superficie de una rejilla. La mancha densa dispersará más electrones que la muestra, añadiendo contraste y produciendo una imagen negativa de la muestra. Cryo TEM se recomienda para imágenes de alta calidad. Sin embargo, es más costoso, consume mucho tiempo y puede no proporcionar suficiente contraste. Cuando esto es una preocupación, se deben utilizar muestras manchadas negativas. Ejemplos de cada uno se muestran en la Figura 5.
Cada una de estas técnicas informa sobre aspectos ligeramente diferentes de las nanopartículas, con diferentes fortalezas y limitaciones. La dispersión de la luz está fácilmente disponible, y a menudo es el enfoque más rápido, pero tiene limitaciones sustanciales en el tamaño y la resolución de la forma. SAXS puede proporcionar información en una amplia gama de escalas de longitud a un rendimiento razonablemente alto, pero requiere equipos especializados para adquirir los datos, así como modelarlos para interpretarlos. Las imágenes TEM son fáciles de interpretar, pero pueden limitarse en contraste y tienen un rendimiento inherentemente bajo. Nuestra experiencia ha demostrado que el uso de múltiples técnicas de caracterización aumenta en gran medida la información que se puede obtener sobre las propiedades de PCM y simplifica la interpretación de los conjuntos de datos obtenidos de cada uno solo. Por ejemplo, SAXS y TEM examinan principalmente el núcleo denso de un PCM, mientras que los informes de dispersión de luz sobre las dimensiones globales de la nanopartícula. Por lo tanto, combinarlos permite la medición del tamaño del núcleo y corona. La capacidad de TEM para adquirir imágenes de espacio real puede proporcionar datos de la verdad del suelo para permitir la selección de factores de forma adecuados para modelar datos SAXS que de otro modo podrían ser ambiguos. En este artículo se describen los protocolos para las cuatro técnicas y se proporciona un proceso de ejemplo para usarlos para caracterizar una muestra desconocida en la sección Discusión.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>70 mm circle filter paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1001-070</td>
			<td>Filter paper for wicking during grid prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon Film TEM grid</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>CF200-Cu</td>
			<td>TEM grid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAWN</td>
			<td>Wyatt Technology</td>
			<td>DAWN</td>
			<td>MALS instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA oligonucleotide</td>
			<td>Integrated DNA Nanotechnologies Inc</td>
			<td></td>
			<td>Custom oligonucleotide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lacey Carbon TEM grid</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>LC200-Cu</td>
			<td>TEM grid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methoxy-poly(ethylene glycol)-block-poly(l-lysine hydrochloride) PEG5k - PLKC50</td>
			<td>Alamanda Polymers Inc</td>
			<td>mPEG5K-b-PLKC50</td>
			<td>Example block copolymer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td></td>
			<td>Ultrapure water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>For measuring nucleic acid concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>negative-action tweezers</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>N7</td>
			<td>Tweezers for grid preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm &#34;M&#34;</td>
			<td>Bemis Company Inc</td>
			<td>PM996</td>
			<td>Laboratory film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantifoil Holey Carbon TEM grid</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>Q210CR1.3</td>
			<td>TEM grid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Research Goniometer and Laser Light Scattering System</td>
			<td>Brookhaven Instruments</td>
			<td>BI-200SM</td>
			<td>DLS/MALS instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide-A-Lyzer G2 2K 0.5 mL</td>
			<td>Thermo Scientific Pierce Protein Biology</td>
			<td>87723</td>
			<td>Dialysis cartridge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>small volume cuvette</td>
			<td>Brookhaven Instruments</td>
			<td>BI-SVC</td>
			<td>Cuvette for DLS/MALS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solarus 950 Advanced Plasma System</td>
			<td>Gatan</td>
			<td>Solarus 950</td>
			<td>Plasma system for TEM grids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Talos TEM</td>
			<td>FEI</td>
			<td>Talos</td>
			<td>TEM used for cryo samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tecnai Spirit TEM</td>
			<td>FEI</td>
			<td>Spirit</td>
			<td>TEM used for dry samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl Formate</td>
			<td>SPI-Chem</td>
			<td>16984-59-1</td>
			<td>For negative staining samples for TEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitrobot</td>
			<td>FEI</td>
			<td>Vitrobot</td>
			<td>Vitrification robot for cryo grid preparation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assembly and characterization of polyelectrolyte complex micelles

Las micelas complejas de polielectrolitos (PCM), las nanopartículas de carcasa central formadas por el autoensamblaje de polímeros cargados en solución acuosa, proporcionan una potente plataforma para explorar la física de las interacciones de polielectrolitos y también ofrecen una solución prometedora para el problema apremiante de la administración de oligonucleótidos terapéuticos in vivo. El desarrollo de relaciones estructura-propiedad predictivas para PCM ha resultado difícil, en parte debido a la presencia de fuertes trampas cinéticas durante el autoensamblaje de nanopartículas. En este artículo se describen los criterios para la elección de polímeros para la construcción de PCM y se proporcionan protocolos basados en el recocido de sal que permiten el montaje de nanopartículas repetibles de baja polidispersidad. También discutimos la caracterización de PCM mediante dispersión de luz, dispersión de rayos X de ángulo pequeño y microscopía electrónica.

Con el fin de ilustrar los métodos de caracterización descritos anteriormente, mostramos resultados típicos para los PCM ensamblados a partir de oligonucleótidos y copolímeros de bloque sin varias longitudes y químicas(Figura 1). La Figura 2 proporciona un ejemplo de cómo el tamaño del núcleo PCM (según lo determinado a partir de SAXS y TEM, Figura 4 y Figura 5)varió con la longitud de bloque...

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Assembly and Characterization of Polyelectrolyte Complex Micelles

Proporcionamos protocolos y datos representativos para diseñar, ensamblar y caracterizar micelas complejas de polielectrolitos, nanopartículas de carcasa central formadas por polielectrolitos y copolímeros de bloques hidrofílicos sin carga.

Montaje y caracterización de micelas complejas de polielectrolitos

Polyelectrolyte complex micelles (PCMs), core-shell nanoparticles formed by self-assembly of charged polymers in aqueous solution, provide a powerful ...

Este método describe la ruta completa del diseño, montaje y caracterización de micelas complejas de polielectrolito que son nanopartículas que se forman a partir del autoensamble de polímeros cargados de forma opuesta. Algunos desafíos importantes con el autoensambleo de polielectrolito son evitar las trampas cinéticas y caracterizar las nanopartículas. La técnica de recocido de sal que describimos permite el montaje repetible de micelas con baja dispersión tanto en tamaño como en forma y describimos métodos de caracterización que incluyen dispersión de luz, dispersión de rayos X de ángulo pequeño y microscopía electrónica.La entrega de ácidos nucleicos terapéuticos es un desafío de larga data para la nanomedicina. Estas micelas complejas de polielectrolito aprovechan la fuerte carga negativa del ácido nucleico para secuestrarlas en el núcleo de la micela donde la corona de polímero neutro las protege de las nucleas y la respuesta inmune. El método de montaje debe aplicarse a cualquier tipo de polímeros cargados.Los hemos probado con varios polianiones y policaciones y el método de caracterización debe ser aplicable a cualquier nanopartícula automontada, incluidas las nanopartículas surfactantes y otros sistemas impulsados hidrofóbicamente. Comience incubando la solución de oligonucleótidos a 70 grados celsius durante cinco minutos. Después de la incubación, enfríe durante 15 minutos a temperatura ambiente para recocido térmicamente los ácidos nucleicos, luego agregue 40 microlitros de 20 copolímeros de concentración cargados de mililitro.Vórtice la solución inmediatamente e incubar durante cinco minutos a temperatura ambiente. Para realizar la recocido de sal, añada solución de cloruro sódico a la solución de oligonucleótidos para una concentración final de un molar y vórtice durante 10 segundos a la velocidad máxima. Incubar la mezcla durante 10 minutos a temperatura ambiente y luego proceder a cargarla en el cartucho de diálisis.Antes de la carga, etiquete los cartuchos con marcador permanente y remojelos en tampón durante al menos dos minutos para hidratar las membranas. Retire la tapa girando en sentido antihorario y cargue la muestra con una punta de pipeta de carga de gel. Apriete suavemente la membrana para eliminar el exceso de aire y reemplace la tapa.Coloque los cartuchos en 1X PBS 0.5 baño de diálisis de cloruro sódico molar asegurándose de que están flotando con ambas membranas expuestas al baño. Después de 24 horas, transfiera los cartuchos a 1X PBS y remoje durante 24 horas adicionales. Después de la diálisis final, recupere la muestra retirando los cartuchos del baño, quitando la tapa y retirando la muestra con una punta de pipeta de carga de gel.Coloque la muestra en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros limpio y refrigídala hasta que esté lista para su uso. Prepare la muestra en el instrumento DLS de acuerdo con las instrucciones del manuscrito y, a continuación, adquiera datos durante al menos un minuto asegurándose de que la tasa de recuento es constante durante todo el tiempo de adquisición. Examine los datos de autocorrelación.La línea base de largo tiempo debe ser plana y la curva de autocorrelación debe ser suave con una dispersión mínima. El ruido en los datos se puede mejorar mediante la adquisición de más datos. Para realizar la reducción y el análisis de datos con Irena, comience importando micelle en conjuntos de datos en segundo plano.Trazar la muestra y el fondo juntos en una escala de registro-log y calcular la proporción de muestra a fondo y verificar la asintota Q alta. Calcular la relación media en este rango Q y utilizar la macro de manipulación de datos para escalar el fondo con la relación calculada. A continuación, trace la señal restada en segundo plano sobre Q y guarde los datos con un nuevo nombre asegurándose de no sobrescribir los datos originales.Abra la macro de modelado y, a continuación, cargue y trace los datos restados en segundo plano. Para encontrar un modelo aproximado para la superficie externa de la micela compleja de polielectrolito, o PCM, seleccione el flujo al rango Q moderado en los controles de datos asegurándose de incluir oscilaciones si están presentes. En los controles de modelo, seleccione la primera población de dispersión y asegúrese de que es la única en uso.Seleccione la distribución de tamaño para el modelo, elija el tipo de distribución deseado y seleccione el factor de forma. Este ejemplo es para un cilindro flexible que debe agregarse manualmente bajo el factor de forma del usuario. Descargue y agregue el factor de forma de cilindro flexible, luego ingrese los nombres de función y los valores iniciales para los parámetros uno y dos que corresponden a la longitud del cilindro y la longitud de Kuhn respectivamente.Estos cilindros son más largos de lo que puede resolver SAXS, por lo que el parámetro de longitud del cilindro se fija en un valor grande. Establezca los parámetros iniciales para la búsqueda introduciendo valores en los campos de escala, tamaño medio y ancho. A continuación, haga clic en Calcular modelo para dibujar el factor de forma resultante.Una vez encontrados los parámetros razonables, haga clic en ajustar el modelo para realizar un mínimo de cuadrados no lineales que se ajuste a los datos. A continuación, modele la dispersión de los polímeros individuales dentro del núcleo PCM. Ajuste los controles de datos para seleccionar el rango Q donde se produce un exceso de dispersión que suele estar en el rango moderado a alto.Agregue una segunda población de dispersión y asegúrese de que es la única en uso. Seleccione un nivel unificado para el modelo, ajuste los factores GDA G y RG para asegurarse de que el modelo no prediga la dispersión excesiva a baja Q y utilice el PB de ajuste entre la macro de cursores para obtener una conjetura inicial para estos parámetros. En cuanto al factor de forma, realice un ajuste no lineal para el modelo de nivel unificado.Si hay un pico de difracción, agregue un tercer modelo para el pico de difracción en el rango Q de interés. Una vez que se obtengan valores de ajuste aproximados para las poblaciones de dispersión individuales, active los tres juntos y optimice el ajuste combinado. Por último, compruebe que cada valor permanece físicamente razonable y guarde el ajuste seleccionando Almacenar en carpeta.El resultado de este procedimiento debe ser un modelo compuesto que describa los datos de dispersión de rayos X de ángulo pequeño en un amplio rango de escalas de tamaño. Este protocolo se utilizó para diseñar, ensamblar y caracterizar micelas complejas de polielectrolito de ácido nucleico o PCMs.Los datos dinámicos de dispersión de luz se adquirieron para PCM esféricos formados a partir de copolímeros de bloque relativamente largos en oligonucleótidos cortos de una sola cadena. La función de autocorrelación se descomisó a un valor plano con la escala de tiempo única, lo que da como resultado el pico de tamaño único en la distribución de tamaño de repIS. La dispersión compleja de rayos X de pequeño ángel o los espectros de intensidad SAXS se pueden ajustar con precisión combinando modelos para las múltiples correlaciones espaciales que están presentes y la dispersión de luz multiángulo se puede utilizar para extender las mediciones de dispersión a escalas de longitud más largas.Los MDM de morfología variable también se pueden tomar imágenes con microscopía electrónica para verificar que los radios y la forma del núcleo son consistentes con los valores obtenidos a partir de la adaptación de los datos SAXS. Al ajustar los datos de SAXS, es importante tener en cuenta cada función de dispersión y utilizar métodos complementarios como TEM para asegurarse de que está utilizando el factor de forma correcto.

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