Name: assembly and characterization of polyelectrolyte complex micelles
Uploaded: 2020-03-02T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assembly and Characterization of Polyelectrolyte Complex Micelles at JoVE.com

Vi tackar Phil Griffin och Tera Lavoie från Soft Matter Characterization Facility och Advanced Electron Microscopy Facility, respektive vid University of Chicago. Vi tackar också Xiaobing Zuo och Soenke Seifert av Advanced Photon Source på Argonne National Laboratory och NIST Center for Hierarchical Materials Design (CHiMaD) för stöd. Vi tackar Jeff Ting och Michael Lueckheide för deras bidrag till detta arbete.

1. Beredning av material
<ol><li>Väg ut lyophilized diblock polymer och tillsätt vatten upp till nästan den volym som krävs för en lagerlösning på 10 mg/ml slutlig koncentration. Virvel vid maximal hastighet i 2 min.</li>
	<li>Sonicate i 5 min. Mycket långa diblocks kan kräva ytterligare ultraljudsbehandling. Lagerlösningen bör verka helt transparent och homogen.</li>
	<li>Justera pH till 7,4 med NaOH eller HCl efter behov. Tillsätt vatten till den slutliga volymen. pLys-PEG-lösningar är ganska stabila me...

Som nämnts ovan, de protokoll som presenteras här är skrivna med fokus på oligonucleotides som polyanion komponent och pLys-PEG som cationic-neutral block sampolymer, men vi har testat dem med en mängd olika polymerer, såsom poly (akrylsyra), polyglutamat, och PEG-poly (vinylbensyl trimetylammonium), och tror att de kommer att vara allmänt tillämpliga för de flesta polyelektrolytpar. En parameter som kan behöva optimeras är saltkoncentrationen som används för glödgning, eftersom det bör vara tillräckligt ...

När motsatta laddade polyelektrolyter blandas i vattenlösning, entropi vinst från utsläpp av sina kontringar orsakar avblandning av lösningen i en polymer-rik kondenserad fas och en polymer-utarmade supernatant1,2,3,4,5, ett fenomen som kallas polyelektrolyt komplexation. Om ett neutralt hydrofiliskt block konjugeras till en eller båda av polyelektrolyterna, uppstår nanoskalafasseparation istället (figur 1A). De resulterande självmonterade kärnskalnanopartiklarna kallas omväxlande polyelektrolytkomplexa miceller (PCMs), polyjonkomplexa miceller, blockjonomerkomplex eller coacervate-core micelles analogt till ytaktiva micellization, även om alla komponenter i systemet är hydrofila6,7. En PCM förmåga att kapsla in hydrofila molekyler såsom proteiner och nukleinsyror, liksom den omfattande tunability som erbjuds av blocket sampolymer bärare arkitektur gör dem attraktiva kandidater för att leverera terapeutiska molekyler in vivo8,9,10,11,12,13.
Att leverera terapeutiska nukleinsyror till cellulära mål är en särskilt viktig utmaning, och en utmaning för vilken PCMs erbjuder flera fördelar. Terapeutiska nukleinsyror (genetiska DNA, mRNA och oligonukleotider såsom siRNA) har en enorm potential för att förbättra människors hälsa, men måste övervinna många biologiska och fysiska hinder för att inse att potentiella14,15,16. Nakna nukleinsyror bryts ned av serum och cellulära nucleases, snabbt rensas från cirkulationen, och deras starka negativa laddning gör det svårt för dem att penetrera cellmembran utan hjälp. Nuvarande metoder för att övervinna dessa hinder inkluderar kostsamma kemiska modifieringar för att förhindra skador från nucleases och / eller inkapsling i olika lipid nanopartiklar monteras via hydrofoba interaktioner15,17,18. Medan dessa metoder har visat sig vara effektiva för lokala injektioner och lever inriktning, systemisk användning presenterar betydande begränsningar av toxicitet, immunogenicitet, och begränsad biodistribution16. Däremot använder PCMs den negativa laddningen av nukleinsyror för att kondensera dem inom den fasseparerade kärnan, medan den neutrala koronan ger en steric barriär mot nedbrytning samt en plattform för att införliva ligands för att förbättra inriktning eller internalisering11,19. In vitro och djurstudier har visat att PCM-datorer effektivt kan leverera olika nukleinsyra nyttolaster20,21,22,23,24, men svagheter i vår förmåga att förutsäga PCM egenskaper såsom storlek, form och stabilitet från egenskaperna hos de ingående polymererna har hindrat deras bredare antagande.
Senaste arbetet av vår grupp och andra inom området har börjat ta itu med detta problem genom att utveckla struktur-egendom, och i vissa fall struktur-egendom-funktion relationer för PCMs bildas från nukleinsyror och olika cationic-neutrala polymerer7,25,26,27. Två konsekventa teman som har uppstått ur dessa studier är vikten av att utveckla välkontrollerade, repeterbara protokoll för PCM-montering och fördelen med att använda flera tekniker för att karakterisera de resulterande nanopartiklarna. Polyelektrolyter, särskilt de med hög laddningstäthet som nukleinsyror, interagerar mycket starkt med varandra och verkar lätt fastna vid blandning, vilket resulterar i PCM-preparat som är mycket känsliga för små variationer i förfarandet och uppvisar hög polydispersity och dålig repeterbarhet från parti till parti. PCMs har också visat sig anta ett brett spektrum av former och storlekar beroende på atomnivå konfigurationer av sina komponenter, och fånga denna mångfald med någon enskild karakterisering teknik är mycket svårt, särskilt eftersom vissa vanliga tekniker såsom dynamisk ljus spridning (DLS) kräver antaganden om partikelform för deras tolkning.
I den här artikeln diskuterar vi materialdesign och urval för PCM, med fokus på oligonukleotider och katjoniska-neutrala diblock sampolymerer. Vi beskriver sedan ett salt glödgning protokoll som använder höga saltkoncentrationer följt av långsam dialys för att undvika kinetisk fångst under PCM montering. Polyelektrolyterna blandas i höga saltförhållanden där elektrostatiska attraktioner screenas, då sänks saltkoncentrationen långsamt för att polyelektrolyterna ska kunna bosätta sig i sina mest energiskt gynnsamma konfigurationer, analoga med den långsamma kylningsprocessen av termisk glödgning. Med hjälp av detta protokoll, vi regelbundet kunna uppnå exceptionellt låg polydispersity och hög repeterbarhet för oligonucleotide PCMs7,26. Slutligen beskriver vi hur fyra separata mättekniker kan användas för att karakterisera PCMs över ett mycket brett spektrum av längdskalor, från extern morfologi till intern struktur: DLS, multi-vinkel ljus spridning (MALS), liten vinkel röntgen spridning (SAXS), och överföring elektronmikroskopi (TEM). Vi hoppas att dessa protokoll kommer att göra det möjligt för fler forskare att effektivt utforska kapaciteten hos dessa intressanta nanopartiklar.
Polymerval och beredning PCM egenskaper påverkas starkt av de fysiska och kemiska egenskaperna hos de ingående polymererna, vilket gör polymerval ett kritiskt steg i designprocessen. De mest välkarakteriserade blocksampolymererna för nukleinsyrapcms är linjära diblocks såsom poly (lysin)-poly (etylenglykol) (pLys-PEG), men PCMs kan bildas mellan polyelektrolyter och en mängd hydrofila neutrala laddade polymerer, som kan genereras i en hög genomströmning sätt28. Valet av laddad grupp påverkar starkt stabiliteten i jonparning och form av miceller26, och PCM storlek har visat sig öka med längden på den laddade blocket5,7,26 (figur 2), vilket gör PCM egenskaper som skall justeras för kraven på en önskad ansökan. För linjära diblocks har vi funnit att det laddade blocket ska ha minst 10 avgifter och laddas starkt vid önskat pH. Längre laddade block kan främja PCM-bildning med oligonukleotider såsom siRNA, som är svåra att komplexa med kortare block21. Vi har framgångsrikt observerat PCM-bildning med blocklängder upp till 200, och litteraturen beskriver längre polymerer. Mer flexibilitet finns i valet av neutrala block24, men erfarenheten har visat att mycket korta neutrala block leder till aggregering snarare än nanopartikelbildning, och att den minsta neutrala längden ökar med laddad blocklängd. För pLys-PEG krävs en PEG MW på minst 3 000–5 000 för pLys-längder under ~50, och längre längder krävs eftersom det laddade blocket höjs ytterligare. Ökad neutral blocklängd resulterar i ökad PCM-storlek, särskilt skaltjocklek, på grund av steric trängsel av neutrala polymerer.
Detta manuskript presenterar ett protokoll för att förbereda PCMs från lyophilized hög renhet pLys-PEG och oligonukleotider av känd kvantitet, men bör lätt anpassas till andra system också. Vi har testat det framgångsrikt med flera laddade polypeptider, inklusive polyarginin och polyglutamussyra, samt flera syntetiska polyelektrolyter, såsom polyakrylsyra och poly(vinylbensyltrimethylammonium). Vi beskriver också förbereda PCMs med ett stoichiometriskt förhållande av polyelektrolyt avgifter, men detta är lätt att ändra. Vi tycker att det är lättast att arbeta med laddningskoncentrationsenheter (c.c.), som också naturligt rymmer polymerer som inte är fulladdade. Om antingen polymer inte är väl karakteriserad, bör man se till att exakt bestämma polymerlängder / massor och se till att överflödigt salt inte finns utöver vad som behövs för laddning neutralisering genom dialys, till exempel. Förekomsten av allt behållat vatten bör också redovisas när koncentrationerna beräknas. Nukleinsyrakoncentrationen kan enkelt kvantifieras genom absorbans vid 260 nm, och förekomsten eller frånvaron av terminalfosfater bör beaktas vid beräkning av c.c.
Vid användning av oligonukleotider som polyanioner, hybridisering tillstånd och kemisk struktur bidra till att bestämma benägenheten för självmontering och egenskaperna hos den resulterande PCM5,7,26. Optimera dessa, inom kraven för biologisk effekt om du använder PCM för leverans, kommer att öka sannolikheten för att bilda de önskade strukturerna. Användbara verktyg för att analysera hybridisering inkluderar MATLAB-funktioner för nukleinsyror, NUPACK29och IDT OligoAnalyzer. Vi rekommenderar att analysera en kandidat sekvens för att förstå styrkan i bindning till 1) själv i en hårnål formation; 2) en annan kopia av samma sekvens (själv-dimer); och 3) till andra oligonukleotider som finns i systemet. DNA och RNA-smälttemperaturer för en viss sekvens kan också beräknas med hjälp av närmaste grannemetod 30,31. Termisk glödgning av nukleinsyror (steg 2.3) denaturerar eventuell akvariesekundär struktur i de enskilda nukleotiderna och främjar jämviktsvikning.
PCM karakterisering och analys Ett brett spektrum av tekniker finns tillgängliga för att karakterisera nanopartiklar, inklusive statisk och dynamisk ljusspridning, liten vinkelspridning av elektroner eller neutroner och elektronmikroskopi. I den här artikeln tillhandahåller vi protokoll för två ljusspridningstekniker, liten vinkelröntgenspridning och två elektronmikroskopitekniker.
DLS mäter autokorrelationen av tidsmässiga fluktuationer i spridningsintensiteten i en vinkel från Brownian motion av provet. Montering av dessa data kan ge hydrodynamisk radie och polydispersity för sfäriska miceller(figur 3). Mals (Flera vinkelvinklar) mäter den statiska spridningsintensiteten i många vinklar. Detta kantiga beroende beskriver formen på nanopartikelen men är begränsad till längdskalor längre än ~50 nm för synligt ljus, vilket begränsar dess effektivitet för mindre nanopartiklar. Båda teknikerna är baserade på brytningsindex obalans och främst beskriva de yttre dimensionerna av nanopartikel.
Små vinkel röntgen spridning (SAXS) använder röntgenstrålar som spridning sonden, och deras kortare våglängd tillåter mätningar över en räckvidd på ~ 0,1-100 nm. Montering av den observerade spridningsintensiteten kontra vinkeln (konventionellt uttryckt som momentumöverföring q)ger information om PCM-morfologi (dvs. storlek och form) och även intern struktur. Om en absolut intensitetkalibrering finns tillgänglig, och om spridningsintensiteten kan extrapoleras till nollvinkel kan PCM-massa och aggregering också uppskattas32,vilket gör SAXS till en extremt mångsidig och värdefull metod. Liten vinkel neutron spridning (SANS) är känslig över ett liknande spektrum av längdskalor men är endast tillgänglig på specialiserade anläggningar och kommer inte uttryckligen diskuteras i denna artikel33,34,35.
De senaste åren har sett tillkomsten av bänksaxs instrument, men vi tycker att synkrotron källor är bättre lämpade för PCM karakterisering, eftersom deras högre intensitet tillåter data som ska samlas in mycket snabbare för dessa låg kontrast prover. Vi tillhandahåller ett kort protokoll för att förvärva PCM SAXS-data på Beamline 12-ID-B på Advanced Photon Source (Argonne National Laboratory, USA) ur ett användarperspektiv. Detta protokoll bör tillämpas på de flesta synkroniseringskällor, men samråd med lokal personal innan du föreslår ett experiment rekommenderas starkt. Vi tillhandahåller också ett datareducerings- och analysprotokoll med Irena36, en fri uppsättning makron skrivna för Igor Pro. Irena innehåller en mångsidig uppsättning formfaktorer för modellering AV SAXS-data och möjliggör konstruktion av multikomponentmodeller som kan beskriva pcms komplexa spridningsprofil (se representativa resultat, figur 4). Irena har också omfattande dokumentation och handledning finns tillgängliga online. Innan du försöker förfarandena nedan rekommenderar vi förtrogenhet med dessa, särskilt handledningen "Modellering av SAXS-data med två huvudsakliga scatterer populationer".
Strålningsskador är ett problem för röntgenspridning, men flera åtgärder kan användas för att minimera den. I synnerhet rekommenderar vi att du använder en flödescellinställning med en sprutpump och PCM-prov som flödar under datainsamling, snarare än en förseglad kapillär. Detta förenklar också kraftigt bakgrunden subtraktion. Vi föreslår också att ta flera exponeringar av det flödande provet snarare än en längre för att begränsa flödet som en enda volym av prov ser och för att möjliggöra jämförelse av exponeringsdata för att identifiera eventuella skador.
I motsats till spridningsteknikerna, som i allmänhet kräver montering för att tolka, ger transmissionselektronmikroskopi (TEM) en verklig visuell bild av nanopartiklarna genom att passera en elektronstråle genom provet och projicera en bild på en scintillationsskärm (figur 5). Vi presenterar protokoll för två TEM tekniker i denna artikel. Cryo TEM fryser glimmerprover i ett tunt lager glasaktig is, bevara strukturell konformation med minimala främmande ämnen, optimalför miceller ≤~10-100 nm i radie. Negativ fläck TEM använder ett tungmetallsalt (t.ex. uran) för att omge provet efter att det har torkats på ytan av ett rutnät. Den täta fläcken sprider fler elektroner än provet, lägger kontrast och producerar en negativ bild av provet. Cryo TEM rekommenderas för högkvalitativa bilder. Det är dock dyrare, tidskrävande, och kanske inte ger tillräcklig kontrast. När detta är ett problem bör negativa färgade prover användas. Exempel på var och en visas i figur 5.
Var och en av dessa tekniker rapporterar om något olika aspekter av nanopartiklar, med olika styrkor och begränsningar. Ljusspridning är lätt tillgänglig och är ofta den snabbaste metoden, men har betydande begränsningar i storlek och formupplösning. SAXS kan ge information om ett stort antal längdskalor vid någorlunda hög genomströmning, men kräver specialiserad utrustning för att förvärva data, samt modellering för att tolka den. TEM-bilder är enkla att tolka men kan begränsas i kontrast och är i sig lågt genomströmning. Vår erfarenhet har visat att använda flera tekniker för karakterisering ökar kraftigt den information som kan erhållas om PCM egenskaper och förenklar tolkningen av datauppsättningar som erhållits från var och en ensam. Saxs och TEM undersöker till exempel i första hand ett PCM-tals täta kärna, medan ljusspridningsrapporter om nanopartikelens övergripande dimensioner. Således, kombinera dem tillåter mätning av både kärna och korona storlek. TEM: s förmåga att förvärva verkliga rymdbilder kan ge mark sanningsdata för att möjliggöra val av lämpliga formfaktorer för modellering SAXS data som annars skulle vara tvetydiga. I den här artikeln beskrivs protokoll för alla fyra tekniker och en exempelprocess för att använda dem för att karakterisera ett okänt exempel anges i avsnittet Diskussion.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>70 mm circle filter paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1001-070</td>
			<td>Filter paper for wicking during grid prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon Film TEM grid</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>CF200-Cu</td>
			<td>TEM grid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAWN</td>
			<td>Wyatt Technology</td>
			<td>DAWN</td>
			<td>MALS instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA oligonucleotide</td>
			<td>Integrated DNA Nanotechnologies Inc</td>
			<td></td>
			<td>Custom oligonucleotide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lacey Carbon TEM grid</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>LC200-Cu</td>
			<td>TEM grid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methoxy-poly(ethylene glycol)-block-poly(l-lysine hydrochloride) PEG5k - PLKC50</td>
			<td>Alamanda Polymers Inc</td>
			<td>mPEG5K-b-PLKC50</td>
			<td>Example block copolymer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td></td>
			<td>Ultrapure water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>For measuring nucleic acid concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>negative-action tweezers</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>N7</td>
			<td>Tweezers for grid preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm &#34;M&#34;</td>
			<td>Bemis Company Inc</td>
			<td>PM996</td>
			<td>Laboratory film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantifoil Holey Carbon TEM grid</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>Q210CR1.3</td>
			<td>TEM grid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Research Goniometer and Laser Light Scattering System</td>
			<td>Brookhaven Instruments</td>
			<td>BI-200SM</td>
			<td>DLS/MALS instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide-A-Lyzer G2 2K 0.5 mL</td>
			<td>Thermo Scientific Pierce Protein Biology</td>
			<td>87723</td>
			<td>Dialysis cartridge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>small volume cuvette</td>
			<td>Brookhaven Instruments</td>
			<td>BI-SVC</td>
			<td>Cuvette for DLS/MALS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solarus 950 Advanced Plasma System</td>
			<td>Gatan</td>
			<td>Solarus 950</td>
			<td>Plasma system for TEM grids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Talos TEM</td>
			<td>FEI</td>
			<td>Talos</td>
			<td>TEM used for cryo samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tecnai Spirit TEM</td>
			<td>FEI</td>
			<td>Spirit</td>
			<td>TEM used for dry samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl Formate</td>
			<td>SPI-Chem</td>
			<td>16984-59-1</td>
			<td>For negative staining samples for TEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitrobot</td>
			<td>FEI</td>
			<td>Vitrobot</td>
			<td>Vitrification robot for cryo grid preparation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assembly and characterization of polyelectrolyte complex micelles

Polyelektrolyt komplexa miceller (PCMs), core-shell nanopartiklar som bildas av självmontering av laddade polymerer i vattenlösning, ger en kraftfull plattform för att utforska fysikpolyelektrolytinteraktioner och erbjuder också en lovande lösning på det akuta problemet med att leverera terapeutiska oligonukleotider in vivo. Att utveckla prediktiva struktur-egendom relationer för PCMs har visat sig svårt, delvis på grund av förekomsten av starka kinetiska fällor under nanopartikel självmontering. I den här artikeln beskrivs kriterier för att välja polymerer för PCM-konstruktion och ger protokoll baserade på saltglödgning som möjliggör montering av repeterbara nanopartiklar med låg polydispersity. Vi diskuterar också PCM karakterisering med ljusspridning, liten vinkelröntgenspridning och elektronmikroskopi.

För att illustrera karakteriseringsmetoder som beskrivs ovan visar vi typiska resultat för PCMs monterade från oligonukleotider och blocksampolymerer av olika längder och kemister(figur 1). Figur 2 ger ett exempel på hur PCM-kärnstorlek (enligt saxs och TEM, figur 4 och figur 5)varierade med laddad blocklängd. Figur 3 visar DLS-data och passande resultat för sfäris...

Watch this Scientific Journal Video about Assembly and Characterization of Polyelectrolyte Complex Micelles at JoVE.com

Assembly and Characterization of Polyelectrolyte Complex Micelles

Vi tillhandahåller protokoll och representativa data för design, montering och karaktäriserande polyelektrolyt komplexa miceller, core-shell nanopartiklar som bildas av polyelektrolyter och hydrofila laddade block sampolymerer.

Montering och karakterisering av Polyelektrolyt Complex Micelles

Polyelectrolyte complex micelles (PCMs), core-shell nanoparticles formed by self-assembly of charged polymers in aqueous solution, provide a powerful ...

Denna metod beskriver den fullständiga vägen för design, montering och karakterisering av polyelektrolyt komplexa miceller som är nanopartiklar som bildas från självmontering av motsatt laddade polymerer. Några stora utmaningar med polyelektrolyt självmontering är att undvika kinetiska fällor och karaktärisera nanopartiklar. Saltglödgningstekniken som vi beskriver möjliggör repeterbar montering av miceller med låg dispersitet i både storlek och form och vi beskriver karakteriseringsmetoder inklusive ljusspridning, liten vinkelröntgenspridning och elektronmikroskopi.Att leverera terapeutiska nukleinsyror är en långvarig utmaning för nanomedicin. Dessa polyelektrolytkomplexmicles utnyttjar nukleinsyrans starka negativa laddning för att binda dem i kärnan av micelle där den neutrala polymerkoronan skyddar dem från nukleaser och immunsvar. Monteringsmetoden bör vara tillämplig på alla typer av laddade polymerer.Vi har testat dem med flera polyanioner och polyjoner och karakteriseringsmetoden bör vara tillämplig på alla självmonterade nanopartiklar, inklusive ytaktiva nanopartiklar och andra hydrofobically-drivna system. Börja med att inkubera oligonukleotidlösningen vid 70 grader Celsius i fem minuter. Efter inkubationen, kyl den i 15 minuter vid rumstemperatur till termiskt glödgning av nukleinsyror, tillsätt sedan 40 mikroliter av 20 millimolar laddade koncentration diblock copolymer.Vortexa lösningen omedelbart och inkubera den i fem minuter i rumstemperatur. För att utföra saltglödgning, tillsätt natriumkloridlösning till oligonukleotidlösningen för en slutlig koncentration av en molar och virvel det i 10 sekunder vid maximal hastighet. Inkubera blandningen i 10 minuter i rumstemperatur, fortsätt sedan med att läsa in den i dialyspatronen.Före inläsningen ska etikettpatroner med permanent markör och blötlägg dem i buffert i minst två minuter för att hydrera membranen. Ta bort locket genom att vrida moturs och ladda provet med hjälp av en gel lastning pipett spets. Kläm försiktigt på membranet för att avlägsna överflödig luft och sätt tillbaka locket.Sätt patronerna i 1X PBS 0,5 molar natriumklorid dialysbad se till att de flyter med båda membranen utsätts för badet. Efter 24 timmar överför du patronerna till 1X PBS och blöter ner dem i ytterligare 24 timmar. Efter den slutliga dialysen, återvinna provet genom att ta ut patronerna från badet, ta bort locket och ta bort provet med en gel lastning pipett spets.Placera provet i ett rent mikrocentrifugrör på 1,5 milliliter och kyl det tills det är klart att använda. Förbered provet i DLS-instrument enligt manuskriptriktningar, sedan skaffa data i minst en minut se till att räkna räntan är konstant över hela förvärvstiden. Undersök autokorrelationsdata.Den långa tiden baslinjen ska vara platt och autokorrelation kurvan bör vara slät med minimal scatter. Buller i uppgifterna kan förbättras genom att skaffa mer data. Om du vill utföra datareducering och analys med hjälp av Irena börjar du med att importera micelle i datamängder i bakgrunden.Rita provet och bakgrunden tillsammans på en log-log skala och beräkna provet till bakgrund förhållandet och verifiera den höga Q asymptote. Beräkna det genomsnittliga förhållandet över detta Q-intervall och använd datamanipulationsmakroet för att skala bakgrunden med det beräknade förhållandet. Rita sedan bakgrunden subtraheras signal över Q och spara data med ett nytt namn se till att inte skriva över de ursprungliga data.Öppna modelleringsmakroet och läs sedan in och plotta bakgrunden subtraherade data. För att hitta en ungefärlig modell för den yttre ytan av polyelektrolytkomplexet micelle, eller PCM, välj flöde till måttligt Q-intervall i datakontrollerna och se till att inkludera svängningar om de finns. I modellkontroller väljer du den första spridningspopulationen och kontrollerar att den är den enda som används.Välj storleksfördelning för modell, välj önskad distributionstyp och välj formfaktor. Detta exempel är för en flexibel cylinder som måste läggas till manuellt under användarens formfaktor. Hämta och lägg till den flexibla cylinderformfaktorn, mata sedan in funktionsnamnen och initialvärdena för parametrar ett och två som motsvarar längden på cylindern respektive Kuhnlängden.Dessa cylindrar är längre än vad som kan lösas av SAXS så cylinderlängdparametern är fast på ett stort värde. Ange initialparametrar för sökningen genom att ange värden i fälten skala, medelstorlek och bredd. Klicka sedan på beräkna modell för att rita den resulterande formfaktorn.När rimliga parametrar har hittats, klicka på passa modell för att utföra en ickelinjära minst rutor passar till data. Därefter modell spridningen av de enskilda polymerer inom PCM-kärnan. Justera datakontrollerna för att välja Q-området där överflödig spridning sker vilket normalt är i det måttliga till höga intervallet.Lägg till en andra spridningspopulation och se till att den är den enda som används. Välj enhetlig nivå för modellen, justera GDA-faktorerna G och RG för att säkerställa att modellen inte förutsäga överdriven spridning vid låg Q och använda passa PB mellan markörer makro för att få en första gissning för dessa parametrar. När det gäller formfaktorn, utför en ickelinjär passform för den enhetliga nivåmodellen.Om en diffraktion topp är närvarande, lägg till en tredje modell för diffraktion topp i Q utbud av intresse. När ungefärliga passningsvärden erhållits för de enskilda spridningspopulationerna, slå på alla tre tillsammans och optimera den kombinerade passformen. Slutligen, kontrollera att varje värde förblir fysiskt rimligt och spara passformen genom att välja butik i mapp.Resultatet av denna procedur bör vara en sammansatt modell som beskriver den lilla vinkelröntgen spridningsdata väl över ett stort utbud av storleksskalor. Detta protokoll användes för att utforma, montera och karakterisera nukleinsyra polyelektrolyt komplexa micelles eller PCMs. Micelle kärna storlek drivs främst av längden på den laddade blocket av blocket copolymer och är till stor del oberoende av längden på homopolymer.Dynamiska ljusspridningsdata förvärvades för sfäriska PCMs som bildas från relativt långa block copolymers i korta enkelsträngade oligonukleotider. Autokorrelationsfunktionen förföll till ett platt värde med den enda tidsskalan som resulterade i den enda storleken topp i repIS storleksfördelning. Komplex liten änglaröntgenspridning eller SAXS-intensitetsspektra kan passa exakt genom att kombinera modeller för de flera rumsliga korrelationerna som finns och multiangle ljusspridning kan användas för att utöka spridningsmåtten till längre längdskalor.PCMs av varierande morfologi kan också avbildas med elektronmikroskopi för att verifiera att kärnradier och form överensstämmer med de värden som erhålls från montering SAXS data. När du monterar SAXS-data är det viktigt att redogöra för varje spridningsfunktion och att använda kostnadsfria metoder som TEM för att se till att du använder rätt formfaktor.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Origami Inspired Self-assembly of Patterned and Reconfigurable Particles

Origami inspirerade självorganisering av Mönstrade och omkonfigurerbara partiklar

There are numerous techniques such as photolithography, electron-beam lithography and soft-lithography that can be used to precisely pattern two ...

Formation of Ordered Biomolecular Structures by the Self-assembly of Short Peptides

Bildning av Beställda Biomolecular Structures av självorganisering av korta peptider

In nature, complex functional structures are formed by the self-assembly of biomolecules under mild conditions. Understanding the forces that control ...

Synthesis and Characterization of Functionalized Metal-organic Frameworks

Syntes och karakterisering av funktionaliserad metal-organic frame

Metal-organic frameworks have attracted extraordinary amounts of research attention, as they are attractive candidates for numerous industrial and ...

Self-assembly of Complex Two-dimensional Shapes from Single-stranded DNA Tiles

Själv montering av komplexa Tvådimensionella former från Single DNA Tiles

Current methods in DNA nano-architecture have successfully engineered a variety of 2D and 3D structures using principles of self-assembly. In this ...

Preparation and Characterization of Individual and Multi-drug Loaded Physically Entrapped Polymeric Micelles

Framställning och karakterisering av individuell och Multi-läkemedelsladdade Fysiskt Instängd polymera miceller

Amphiphilic block copolymers like polyethyleneglycol-block-polylactic acid (PEG-b-PLA) can self-assemble into micelles above their critical micellar ...

Synthesis and Characterization of Supramolecular Colloids

Syntes och karakterisering av Supramolekylära Colloids

Control over colloidal assembly is of utmost importance for the development of functional colloidal materials with tailored structural and mechanical ...

On-line Analysis of Nitrogen Containing Compounds in Complex Hydrocarbon Matrixes

On-line analys av kväveinnehållande föreningar i Komplext kolväteämne Matriser

The shift to heavy crude oils and the use of alternative fossil resources such as shale oil are a challenge for the petrochemical industry. The ...

Facile Synthesis of Worm-like Micelles by Visible Light Mediated Dispersion Polymerization Using Photoredox Catalyst

Facile Syntes av maskliknande Miceller med synligt ljus medierad dispersionspolymerisation Använda Photoredox Catalyst

Presented herein is a protocol for the facile synthesis of worm-like micelles by visible light mediated dispersion polymerization. This approach begins ...

Anionic Polymerization of an Amphiphilic Copolymer for Preparation of Block Copolymer Micelles Stabilized by &#960;-&#960; Stacking Interactions

Anionic Polymerization of an Amphiphilic Copolymer for Preparation of Block Copolymer Micelles Stabilized by ÃƒÆ’Ã‚ÂÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬-ÃƒÆ’Ã‚ÂÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ Stacking Interactions

Anjoniska polymerisationen av en amfifila sampolymeren för framställning av segmentsampolymeren Miceller stabiliseras genom π-Tt stapling interaktioner

In this study, an amphiphilic copolymer that includes a core-forming block with phenyl groups was synthesized by living anionic polymerization of phenyl ...

Preparation and Characterization of C60/Graphene Hybrid Nanostructures

Preparation and Characterization of C60/Graphene Hybrid Nanostructures

Förberedelse och karakterisering av C60/Graphene Hybrid nanostrukturer

Physical thermal deposition in a high vacuum environment is a clean and controllable method for fabricating novel molecular nanostructures on graphene. We ...