Name: assembly and characterization of polyelectrolyte complex micelles
Uploaded: 2020-03-02T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assembly and Characterization of Polyelectrolyte Complex Micelles at JoVE.com

Chicago Üniversitesi'ndeki Yumuşak Madde Karakterizasyon Tesisi ve İleri Elektron Mikroskobu Tesisi'nden Phil Griffin ve Tera Lavoie'ye teşekkür ederiz. Ayrıca Xiaobing Zuo ve Soenke Seifert Gelişmiş Foton Kaynak Argonne Ulusal Laboratuvarı ve NIST Merkezi Hiyerarşik Malzeme Tasarımı (CHiMaD) destek için teşekkür ederiz. Jeff Ting ve Michael Lueckheide'ye bu işe yaptıkları katkılar için teşekkür ederiz.

1. Malzemelerin Hazırlanması
<ol><li>Lyophilized diblock polimeri tartın ve 10 mg/mL son konsantrasyondaki stok çözeltisi için gereken hacmin neredeyse üzerine su ekleyin. 2 dakika maksimum hızda girdap.</li>
	<li>Sonicate için 5 dk. Çok uzun diblocks ek sonication gerektirebilir. Stok çözeltisi tamamen saydam ve homojen görünmelidir.</li>
	<li>Gerektiğinde NaOH veya HCl kullanarak pH'ı 7,4'e ayarlayın. Son hacme su ekleyin. pLys-PEG çözeltileri oldukça kararlıdır ancak uzun süreli depolama için...

Yukarıda da belirtildiği gibi, burada sunulan protokoller, poliyanion bileşeni olarak oligonükleotidlere ve katyonik-nötr blok kopolimer olarak pLys-PEG'e odaklanarak yazılmıştır, ancak bunları polikonik asit, poliglutamat ve PEG(vinilbenzyl trimethylammonium) gibi çeşitli polimerlerle test ettik ve bunların çoğu polielektrolit çifti için genel olarak geçerli olacağına inanıyoruz. Optimize edilmesi gereken bir parametre, annealing için kullanılan tuz konsantrasyonudur, çünkü PCM'lerin anneal'ın...

Karşı yüklenmiş polielektrolitler sulu çözeltide karıştırıldığında, karşıtlıklarının serbest bırakılmasından elde edilen entropi kazancı çözeltinin polimer açısından zengin yoğunlaştırılmış faza ve polimer-tükenmiş süpernatant1,2,3,4,5,polielektrolit kompleksi olarak bilinen bir fenomen haline karışmasına neden olur. Nötr bir hidrofilik blok polielektrolitlerden birine veya her ikisine konjuge edilirse, bunun yerine nanoölçekli faz ayrımı gerçekleşir (Şekil 1A). Ortaya çıkan kendi kendine monte çekirdek kabuğu nano tanecikleri çeşitli polielektrolit karmaşık micelles (PCMs), poliyon karmaşık micelles, blok iyonomer kompleksleri, ya da yüzey aktif micellizasyon benzetme ile koacervate çekirdekli micelles olarak adlandırılır, sistemin tüm bileşenleri hidrofilikolmasınarağmen6 ,7. Bir PCM yeteneği proteinler ve nükleik asitler gibi hidrofilik molekülleri kapsüllemek için, hem de blok kopolimer taşıyıcı mimarisi tarafından sunulan geniş alabilme onları vivo 8 terapötik molekülleri sunmak için cazip adaylar yapar8,9,10,11,12,13.
Hücresel hedeflere terapötik nükleik asitler indelivering özellikle önemli bir sorundur, ve pcms çeşitli avantajlar sunan biri. Terapötik nükleik asitler (genetik DNA, mRNA, ve siRNA gibi oligonükleotidler) insan sağlığını iyileştirmek için büyük bir potansiyele sahip, ancak bu potansiyel14gerçekleştirmek için çok sayıda biyolojik ve fiziksel engelleri aşmak gerekir14 ,15,16. Çıplak nükleik asitler serum ve hücresel nükleazlar tarafından bozulur, hızlı bir şekilde dolaşımdan temizlenir ve güçlü negatif yükleri, yardım almadan hücre zarlarına girmelerini zorlaştırır. Bu engelleri aşmak için mevcut yaklaşımlar hidrofobik etkileşimleri15,17,18ile monte çeşitli lipid nano tanecikleri içine çekirdekleri ve / veya kapsülleme hasarı önlemek için pahalı kimyasal değişiklikler içerir. Bu yöntemler lokal enjeksiyonlar ve karaciğer hedeflemeiçin etkili olduğu kanıtlansa da, sistemik kullanım toksisite, immünojenite ve sınırlı biyodağıtım önemli sınırlamalar sunar16. Buna karşılık, PCM'ler çekirdekasitlerin negatif yüklerini fazdan ayrılmış çekirdek içinde yoğunlaştırmak için kullanırken, nötr korona bozulmaya karşı sterik bariyerin yanı sıra hedefleme yi veya içselleştirmeyi artırmak için ligandları birleştirmek için bir platform sağlar11,19. In vitro ve hayvan çalışmaları PCM'ler etkili çeşitli nükleik asit yükleri teslim edebilirsiniz göstermiştir20,21,22,23,24, ama bizim yeteneğimizde zayıflıkları gibi PCM özellikleri tahmin etmek için boyut, şekil, ve kurucu polimerlerin özelliklerinden istikrar onların daha geniş benimsenmesini engelledi.
Bizim grup ve alanında diğerleri tarafından son çalışma yapısı-mülkiyet geliştirerek bu sorunu çözmek için başladı, ve bazı durumlarda nükleik asitler ve çeşitli katyonik-nötr polimerler7oluşan PCM'ler için yapı-özellik-fonksiyon ilişkileri 7,25,26,27. Bu çalışmalardan ortaya çıkan iki tutarlı tema, PCM montajı için iyi kontrol edilen, tekrarlanabilir protokoller geliştirmenin önemi ve ortaya çıkan nano parçacıkları karakterize etmek için birden fazla teknik kullanmanın yararıdır. Polielektrolitler, özellikle nükleik asitler gibi yüksek yük yoğunluğuna sahip olanlar, birbirleriyle çok güçlü bir şekilde etkileşime girerek karıştırma üzerine kolayca kInetik olarak kapana kısılmış gibi görünerek, işlemdeki küçük varyasyonlara karşı son derece hassas olan pcm preparatları ile sonuçlanır ve toplu iş lerden toplu işleme kadar yüksek polidispersit ve kötü tekrarlanabilirlik gösterir. PCM'lerin ayrıca bileşenlerinin atomik düzey yapılandırmalarına bağlı olarak çok çeşitli şekil ve boyutlarda benimsedikleri gösterilmiştir ve bu çeşitliliği herhangi bir bireysel karakterizasyon tekniğiyle yakalamak çok zordur, özellikle de dinamik ışık saçılımı (DLS) gibi bazı yaygın teknikler yorumlamaları için parçacık şekli hakkında varsayımlar gerektirdiğinden.
Bu makalede, oligonükleotidler ve katyonik-nötr diblok kopolimerler üzerinde odaklanarak, PCM'ler için malzeme tasarımı ve seçimi tartışılmaktadır. Daha sonra PCM montajı sırasında kinetik bindirmeönlemek için yavaş diyaliz ardından yüksek tuz konsantrasyonları kullanan bir tuz tavlama protokolü açıklar. Polielektrolitler elektrostatik konumlar taranır yüksek tuz koşullarında karıştırılır, daha sonra tuz konsantrasyonu yavaş yavaş polielektrolitler en enerjik uygun yapılandırmaları yerleşmek için izin indirilir, termal annealing yavaş soğutma sürecine benzer. Bu protokolü kullanarak, düzenli olarak oligonükleotid PCMs7,26için son derece düşük polidispersity ve yüksek tekrarlanabilirlik elde edebiliyoruz. Son olarak, pcm'leri dış morfolojiden iç yapıya kadar çok geniş bir uzunluk ölçeği nde karakterize etmek için dört ayrı ölçüm tekniğinin nasıl kullanılabileceğini anlatıyoruz: DLS, çok açılı ışık saçılımı (MALS), küçük açılı X-ışını saçılımı (SAXS) ve iletim elektron mikroskobu (TEM). Bu protokollerin daha fazla araştırmacının bu ilginç nano parçacıkların yeteneklerini etkili bir şekilde keşfetmesini sağlayacağını umuyoruz.
Polimer Seçimi ve Hazırlanması PCM özellikleri, kurucu polimerlerin fiziksel ve kimyasal özelliklerinden güçlü bir şekilde etkilenerek polimer seçimini tasarım sürecinde kritik bir adım haline getirir. Nükleik asit PCM'ler için en iyi karakterize blok kopolimerler poli(lizin)-poli (etilen glikol) (pLys-PEG) gibi lineer bloklardır, ancak pcm'ler polielektrolitler ve yüksek işlenme usulünde üretilebilen çeşitli hidrofilik nötr yüklü polimerler arasında oluşturulabilir28. Yüklü grup seçimi güçlü iyon eşleştirme ve micelles şekli istikrarı etkiler26, ve PCM boyutu yüklü blok uzunluğu ile artırmak için gösterilmiştir5,7,26 (Şekil 2), böylece PCM özellikleri istenen bir uygulamanın gereksinimleri için ayarlanmasına izin. Doğrusal bloklar için, yüklü bloğun en az 10 şarjı olması ve istenilen pH'da güçlü bir şekilde şarj edilmesi gerektiğini bulduk. Daha uzun şarjlı bloklar, daha kısa bloklarla karmaşıkolması zor olan siRNA gibi oligonükleotidlerle PCM oluşumunu teşvik edebilir21. 200'e kadar blok uzunlukları ile PCM oluşumunu başarıyla gözlemledik ve literatürde daha uzun polimerler tanımlanmaktadır. Daha fazla esneklik nötr bloklar24seçiminde mevcuttur, ancak deneyim çok kısa nötr blokları nanofioluşumu yerine toplama yol göstermiştir, ve minimum nötr uzunluğu yüklü blok uzunluğu ile artar. PLys-PEG için, ~50'nin altındaki pLy'ler için en az 3.000-5.000 PEG MW gerekir ve şarj edilen blok daha da artırıldıkça daha uzun uzunluklar gereklidir. Nötr polimerlerin sterik kalabalıklığı nedeniyle, özellikle kabuk kalınlığı, artan PCM boyutu, artan nötr blok uzunluğu sonuçları.
Bu el yazması, pcm'lerin lyophilized yüksek saflıkta pLys-PEG ve bilinen miktarda oligonükleotidlerden hazırlanması için bir protokol sunar, ancak diğer sistemlere de kolayca uyarlanabilir olmalıdır. Biz başarılı polyarginin ve poliglutamik asit de dahil olmak üzere çeşitli yüklü polipeptidler ile test ettik, yanı sıra çeşitli sentetik polielektrolitler, poliakrilik asit ve poli (vinilbenzyl trimethylammonium) gibi. Ayrıca polielektrolit ücretlerise stokiyometrik oranı ile PCM'ler hazırlanması açıklar, ama bu kolayca değiştirilebilir. Biz de doğal olarak tam olarak şarj olmayan polimerler barındıran şarj konsantrasyon üniteleri (c.c.), çalışmak için en kolay bulabilirsiniz. Eğer her iki polimer de iyi karakterize değilse, polimer uzunluklarını/kütlelerini doğru bir şekilde belirlemeye ve örneğin diyaliz ile şarj nötralizasyonu için gerekenin ötesinde fazla tuz bulunmadığından emin olmaya özen verilmelidir. Konsantrasyonlar hesaplandığında herhangi bir korunan suyun varlığı da hesaba katılmalıdır. Nükleik asit konsantrasyonu 260 nm'de absorbance ile uygun bir şekilde ölçülebilir ve c.c hesaplanırken terminal fosfatların varlığı veya yokluğu göz önünde bulundurulmalıdır.
Polianiyonlar olarak oligonükleotid kullanırken, hibridizasyon durumu ve kimyasal yapı kendi kendine montaj eğilimi ni ve ortaya çıkan PCM5,7,26özelliklerini belirlemeye yardımcı olur. Bunların, teslimat için PCM'ler kullanılması durumunda biyolojik etkinlik gereksinimleri dahilinde optimize etmek, istenilen yapıların oluşma olasılığını artıracaktır. Hibridizasyon analiz etmek için yararlı araçlar nükleik asitler için MATLAB fonksiyonları, NUPACK29ve IDT OligoAnalyzer içerir. Bir saç tokası oluşumunda 1) kendisine bağlanmanın gücünü anlamak için bir aday dizisini analiz etmenizi öneririz; 2) aynı sıranın başka bir kopyası (self-dimer); ve 3) sistemde bulunan diğer oligonükleotidlere. Belirli bir dizi için DNA ve RNA erime sıcaklıkları da en yakın komşu yöntemi 30 ,31kullanılarak hesaplanabilir. Nükleik asitlerin Termal annealing (adım 2.3) bireysel nükleotitler herhangi bir kalıntı ikincil yapı denatüre ve denge katlama teşvik.
PCM Karakterizasyonu ve Analizi Statik ve dinamik ışık saçılımı, elektron veya nötron ların küçük açı saçılımı ve elektron mikroskobu gibi nano partikülleri karakterize etmek için çok çeşitli teknikler mevcuttur. Bu makalede, iki ışık saçılma teknikleri, küçük açılı X-ışını saçılımı ve iki elektron mikroskobu teknikleri için protokoller salıyoruz.
DLS, numunenin Brownian hareketinden bir açıyla saçılma yoğunluğundaki zamansal dalgalanmaların otokorelasyonuna göre ölçer. Bu verilerin takılması küresel miseller için hidrodinamik yarıçap ve polidispersitlik sağlayabilir(Şekil 3). Çoklu açılı ışık saçılımı (MALS) statik saçılma yoğunluğunu birçok açıda ölçer. Bu açısal bağımlılık nanopartikülün şeklini açıklar, ancak görünür ışık için ~50 nm'den daha uzun uzunluk ölçekleri ile sınırlıdır, bu da küçük nano taneciklerin etkinliğini sınırlar. Her iki teknik de kırılma indisi uyuşmazlığı temel alır ve öncelikle nanopartikülün dış boyutlarını açıklar.
Küçük açılı X-ışını saçılımı (SAXS) x-ışını'nı saçılma sondası olarak kullanır ve daha kısa dalga boyu ~0.1-100 nm aralığında ölçüm yapılmasına olanak tanır. Gözlemlenen saçılma yoğunluğu ve açısının (geleneksel olarak momentum transferi qolarak ifade edilmesi) montajı, PCM morfolojisi (yani boyut ve şekil) ve iç yapısı hakkında bilgi sağlar. Mutlak yoğunluk kalibrasyonu varsa ve saçılma yoğunluğu sıfır açıya çıkarılabilirse, PCM kütlesi ve toplama sayısı da32olarak tahmin edilebilir ve bu da SAXS'ı son derece çok yönlü ve değerli bir yöntem haline getirir. Küçük açı nötron saçılma (SANS) uzunluk ölçekleri benzer bir dizi üzerinde duyarlı dır ama sadece özel tesislerde mevcuttur ve açıkça bu makalede ele alınmayacaktır33,34,35.
Son yıllarda benchtop SAXS aletleri gelişini gördük, ama biz senkrotron kaynakları daha iyi PCM karakterizasyonu için uygun olduğunu bulmak, onların yüksek yoğunluklu veri bu düşük kontrastlı örnekler için çok daha hızlı toplanması için izin verir gibi. Kullanıcı açısından Gelişmiş Foton Kaynağı'nda (Argonne National Laboratory, ABD) Beamline 12-ID-B'de PCM SAXS verilerinin elde etmek için kısa bir protokol salıyoruz. Bu protokol çoğu senkrotron kaynağı için geçerli olmalıdır, ancak bir deneme önermeden önce yerel personele danışmak şiddetle tavsiye edilir. Igor Pro için yazılmış ücretsiz bir makro kümesi olan Irena36'yıkullanarak veri azaltma ve analiz protokolü de salıyoruz. Irena, SAXS verilerini modellemek için çok yönlü bir form faktörü kümesi içerir ve PCM'lerin karmaşık saçılma profilini tanımlama yeteneğine sahip çok bileşenli modellerin yapımına olanak tanır (Bkz. Temsili Sonuçlar, Şekil 4). Irena da kapsamlı belgeler ve öğreticiler online mevcuttur. Aşağıdaki yordamları denemeden önce, özellikle "SAXS verilerinin iki ana saçılım popülasyonuyla modellenmesi" öğreticisi olan bu yordamlara aşina lığı öneririz.
Radyasyon hasarı X-ışını saçılma için bir endişe, ama çeşitli önlemler bunu en aza indirmek için kullanılabilir. Özellikle, bir şırınga pompası ve PCM örnek veri toplama sırasında akan bir akış hücresi kurulum kullanmanızı öneririz, yerine kapalı bir kılcal. Bu da büyük ölçüde arka plan çıkarma kolaylaştırır. Ayrıca, herhangi bir örnek hacminin gördüğü akışı sınırlamak ve herhangi bir hasarı belirlemek için pozlama verilerinin karşılaştırılmasına olanak sağlamak için, akan numunenin daha uzun bir numune yerine birden fazla pozlama sını almanızı öneririz.
Genellikle yorumlamak için uygun gerektiren saçılma tekniklerinin aksine, iletim elektron mikroskobu (TEM), numunenin içinden bir elektron ışını geçirerek ve bir görüntüyü bir ışıltı ekranına yansıtarak nano taneciklerin gerçek bir uzay görsel görüntüsünü sağlar(Şekil 5). Bu makalede iki TEM tekniği için protokoller salıyoruz. Cryo TEM, mikel örneklerini ince bir vitreus buz tabakasında dondurarak, en az yabancı maddelerle yapısal konformasyonu korur, yarıçaptaki miseller ≤~10-100 nm için en uygun. Negatif leke TEM, bir ızgara yüzeyinde kuruduktan sonra numuneyi çevrelemek için ağır metal tuzu (örneğin, uranyum) kullanır. Yoğun leke, kontrast ekleyerek ve numunenin negatif bir görüntü üreten, örnek daha fazla elektron dağılım olacaktır. Yüksek kaliteli görüntüler için Cryo TEM önerilir. Ancak, daha pahalı, zaman alıcı ve yeterli kontrast sağlamayabilir. Bu bir sorun olduğunda negatif lekeli numuneler kullanılmalıdır. Her birinin örnekleri Şekil 5'tegösterilmiştir.
Bu tekniklerin her biri farklı güçlü ve sınırlamaları ile, nano tanecikleri biraz farklı yönlerini raporlar. Işık saçılma kolayca kullanılabilir ve genellikle en hızlı yaklaşımdır, ancak boyut ve şekil çözünürlüğü önemli sınırlamaları vardır. SAXS, oldukça yüksek iş gücünde çok çeşitli uzunluk ölçekleri üzerinden bilgi sağlayabilir, ancak verileri elde etmek için özel ekipman ın yanı sıra yorumlamak için modelleme gerektirir. TEM görüntüleri yorumlamak kolaydır ancak kontrast olarak sınırlı olabilir ve doğal olarak düşük iş kolu vardır. Deneyimlerimiz, karakterizasyon için birden fazla teknik kullanmanın PCM özellikleri hakkında elde edilebilen bilgileri büyük ölçüde artırdığını ve yalnızca her birinden elde edilen veri kümelerinin yorumlanmasını kolaylaştırdığını göstermiştir. Örneğin, SAXS ve TEM öncelikle bir PCM'nin yoğun çekirdeğini incelerken, ışık saçılma raporları nanoparçacığın genel boyutları hakkında dır. Böylece, bunları birleştirerek hem çekirdek hem de korona boyutu ölçümü sağlar. TEM'in gerçek alan görüntüleri elde etme becerisi, aksi takdirde belirsiz olabilecek SAXS verilerinin modelalınması için uygun form faktörlerinin seçilmesini sağlamak için zemin gerçeği verileri sağlayabilir. Bu makalede, dört tekniğin protokolleri açıklanır ve bilinmeyen bir örneği karakterize etmek için bunları kullanmak için örnek bir işlem Tartışma bölümünde verilmiştir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>70 mm circle filter paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1001-070</td>
			<td>Filter paper for wicking during grid prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon Film TEM grid</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>CF200-Cu</td>
			<td>TEM grid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAWN</td>
			<td>Wyatt Technology</td>
			<td>DAWN</td>
			<td>MALS instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA oligonucleotide</td>
			<td>Integrated DNA Nanotechnologies Inc</td>
			<td></td>
			<td>Custom oligonucleotide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lacey Carbon TEM grid</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>LC200-Cu</td>
			<td>TEM grid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methoxy-poly(ethylene glycol)-block-poly(l-lysine hydrochloride) PEG5k - PLKC50</td>
			<td>Alamanda Polymers Inc</td>
			<td>mPEG5K-b-PLKC50</td>
			<td>Example block copolymer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td></td>
			<td>Ultrapure water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>For measuring nucleic acid concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>negative-action tweezers</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>N7</td>
			<td>Tweezers for grid preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm &#34;M&#34;</td>
			<td>Bemis Company Inc</td>
			<td>PM996</td>
			<td>Laboratory film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantifoil Holey Carbon TEM grid</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>Q210CR1.3</td>
			<td>TEM grid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Research Goniometer and Laser Light Scattering System</td>
			<td>Brookhaven Instruments</td>
			<td>BI-200SM</td>
			<td>DLS/MALS instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide-A-Lyzer G2 2K 0.5 mL</td>
			<td>Thermo Scientific Pierce Protein Biology</td>
			<td>87723</td>
			<td>Dialysis cartridge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>small volume cuvette</td>
			<td>Brookhaven Instruments</td>
			<td>BI-SVC</td>
			<td>Cuvette for DLS/MALS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solarus 950 Advanced Plasma System</td>
			<td>Gatan</td>
			<td>Solarus 950</td>
			<td>Plasma system for TEM grids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Talos TEM</td>
			<td>FEI</td>
			<td>Talos</td>
			<td>TEM used for cryo samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tecnai Spirit TEM</td>
			<td>FEI</td>
			<td>Spirit</td>
			<td>TEM used for dry samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl Formate</td>
			<td>SPI-Chem</td>
			<td>16984-59-1</td>
			<td>For negative staining samples for TEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitrobot</td>
			<td>FEI</td>
			<td>Vitrobot</td>
			<td>Vitrification robot for cryo grid preparation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assembly and characterization of polyelectrolyte complex micelles

Polielektrolit kompleks miseller (PCM'ler), sulu çözeltide yüklü polimerlerin kendi kendine biraraya toplanması yla oluşan çekirdek kabuğu nano tanecikleri, polielektrolit etkileşimlerinin fiziğinin araştırılması için güçlü bir platform sağlar ve aynı zamanda vivo terapötik oligonükleotid teslim acil sorun. PCM'ler için öngörülü yapı-özellik ilişkileri geliştirmek, kısmen nanopartikül kendi kendine montaj sırasında güçlü kinetik tuzakların varlığı nedeniyle zor olmuştur. Bu makalede, PCM yapısı için polimer seçimiiçin kriterler açıklanabilir ve tekrarlanabilir, düşük polidispersitlik nano tanecikleri montajı sağlayan tuz annealing dayalı protokoller sağlar. Ayrıca ışık saçılımı, küçük açılı X-ışını saçılımı ve elektron mikroskobu kullanarak PCM karakterizasyonu tartışılmaktadır.

Yukarıda açıklanan karakterizasyon yöntemlerini göstermek için, oligonükleotidlerden biraraya getirilen PCM'ler ve çeşitli uzunluklarda ve kimyalardan blok kopolimerler için tipik sonuçlar gösteririz(Şekil 1). Şekil 2, PCM çekirdek boyutunun (SAXS ve TEM, Şekil 4 ve Şekil 5'tenbelirlendiği gibi) yüklü blok uzunluğuyla nasıl değiştiğini niçin bir örnek olarak sunmaktadır. <str...

Watch this Scientific Journal Video about Assembly and Characterization of Polyelectrolyte Complex Micelles at JoVE.com

Assembly and Characterization of Polyelectrolyte Complex Micelles

Polielektrolit kompleks misellerin, polielektrolitlerin ve hidrofilik yüklü blok kopolimerlerin oluşturduğu çekirdek kabuklu nano partiküllerin tasarımı, montajı ve karakterizasyonu için protokoller ve temsili veriler salıyoruz.

Polielektrolit Kompleksi Misellerinin Montajı ve Karakterizasyonu

Polyelectrolyte complex micelles (PCMs), core-shell nanoparticles formed by self-assembly of charged polymers in aqueous solution, provide a powerful ...

Bu yöntem, karşı yüklü polimerlerin kendi kendine biraraya getirilmesinden oluşan nano partiküller olan polielektrolit kompleks misellerinin tasarımının, montajının ve karakterizasyonunun tam yolunu açıklar. Polielektrolit kendi kendine montaj ile bazı büyük zorluklar kinetik tuzakları kaçınarak ve nano tanecikleri karakterize vardır. Tarif ettiğimiz tuz tavlama tekniği, hem boyut hem de şekil olarak düşük dağılımlı misellerin tekrarlanabilir bir şekilde birleştirilmesine olanak sağlar ve ışık saçılımı, küçük açılı x-ışını saçılımı ve elektron mikroskobu gibi karakterizasyon yöntemlerini tanımlarız.Terapötik nükleik asitlerin sağlanması nanotıp için uzun zamandır devam eden bir sorundur. Bu polielektrolit kompleks micelles nötr polimer korona nükleazlar ve bağışıklık yanıtı onları korur micelle çekirdeğinde onları tecrit etmek için nükleik asit güçlü negatif yük yararlanmak. Montaj yöntemi her türlü yüklü polimerler için geçerli olmalıdır.Biz çeşitli polianions ve polikasyonlar ile test ettik ve karakterizasyon yöntemi yüzey aktif nano tanecikleri ve diğer hidrofobik tahrikli sistemler de dahil olmak üzere herhangi bir kendi kendine monte nano tanecikleri için geçerli olmalıdır. Oligonükleotid çözeltisini 70 derecede beş dakika kuluçkaya yatırarak başlayın. Kuluçkadan sonra, nükleik asitleri termal olarak anneal etmek için oda sıcaklığında 15 dakika soğutun, ardından 40 mikrolitre 20 milimolar yüklü konsantrasyon diblock kopolimer ekleyin.Çözeltiyi hemen girdap layın ve oda sıcaklığında beş dakika kuluçkaya yatırın. Tuz anneal gerçekleştirmek için, bir azı dakikanihai konsantrasyonu için oligonükleotid çözeltisi sodyum klorür çözeltisi ekleyin ve maksimum hızda 10 saniye girdap. Karışımı oda sıcaklığında 10 dakika kuluçkaya yatırın, ardından diyaliz kartuşu içine yükleyerek devam edin.Yüklemeden önce, kartuşları kalıcı işaretle etiketleyin ve membranları nemlendirmek için en az iki dakika arabellekte bekletin. Saat yönünün tersine bükerek kapağı çıkarın ve jel yükleme pipet ucu kullanarak numuneyi yükleyin. Fazla havayı gidermek ve kapağı değiştirmek için membranı hafifçe sıkın.Kartuşları 1X PBS 0,5 azı kaşığı sodyum klorür diyaliz banyosuna koyun ve her iki membranda da banyoya maruz kalarak yüzerler. 24 saat sonra kartuşları 1X PBS'ye aktarın ve 24 saat daha bekletin. Son diyalizden sonra, kartuşları banyodan çıkararak, kapağı çıkararak ve jel yükleme pipet ucuyla numuneyi çıkararak numuneyi geri alın.Numuneyi temiz bir 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin ve kullanıma hazır olana kadar buzdolabında saklayın. Örneği el yazması talimatlara göre DLS enstrümanında hazırlayın, ardından sayım oranının tüm edinme süresi boyunca sabit olduğundan emin olmak için en az bir dakika veri alın. Otomatik korelasyon verilerini inceleyin.Uzun süre taban çizgisi düz olmalı ve otokorelasyon eğrisi en az dağılımile pürüzsüz olmalıdır. Verilerdeki gürültü, daha fazla veri edinilerek geliştirilebilir. Irena kullanarak veri azaltma ve analiz gerçekleştirmek için, arka plan veri kümelerinde micelle alarak başlayın.Bir günlük günlüğü ölçeğinde örneği ve arka planı birlikte çizin ve örneği arka plan oranına hesaplayın ve yüksek Q asimptot'u doğrulayın. Bu Q aralığı üzerindeki ortalama oranı hesaplayın ve hesaplanan oran ile arka planı ölçeklendirmek için veri işleme makrosu kullanın. Ardından arka plandaki çıkarılan sinyali Q'nun üzerine çizin ve orijinal verilerin üzerine yazmamaya emin olmak için verileri yeni bir adla kaydedin.Modelleme makrosunun açın, ardından arka plan çıkarılan verileri yükleyin ve çizin. Polielektrolit kompleksi micelle veya PCM'nin dış yüzeyi için yaklaşık bir model bulmak için, veri denetimlerinde ılımlı Q aralığına akış seçin ve varsa salınımları içerdiğinden emin olun. Model denetimlerinde, ilk saçılma popülasyonunu seçin ve yalnızca onun kullanımda olduğundan emin olun.Model için boyut dağılımını seçin, istenen dağıtım türünü seçin ve form faktörünü seçin. Bu örnek, kullanıcı formu faktörünün altına el ile eklenmesi gereken esnek bir silindir içindir. Esnek silindir form faktörünün karşıdan yüklendiği ve ekleyin, ardından silindirin uzunluğuna ve Kuhn uzunluğuna karşılık gelen birinci ve ikinci parametreler için işlev adlarını ve başlangıç değerlerini girdiniz.Bu silindirler SAXS tarafından çözülebilecek kadar uzundur, böylece silindir uzunluğu parametresi büyük bir değerde sabitlenir. Ölçek, ortalama boyut ve genişlik alanlarına değerleri girerek aramanın ilk parametrelerini ayarlayın. Ardından, ortaya çıkan form faktörlerini çizmek için modeli hesapla'yı tıklatın.Makul parametreler bulunduktan sonra, verilere uygun doğrusal olmayan en küçük kareler gerçekleştirmek için sığdır seçeneğini tıklatın. Ardından, PCM çekirdeğiiçindeki polimerlerin ayrı ayrı saçılmasını modellendirin. Aşırı saçılmanın oluştuğu Q aralığını seçmek için veri denetimlerini ayarlayın.İkinci bir saçılma popülasyonu ekleyin ve yalnızca onun kullanımda olduğundan emin olun. Model için birleşik düzeyi seçin, modelin düşük Q'da aşırı dağılım öngörmediğinden emin olmak için GDA faktörlerini G ve RG'yi ayarlayın ve bu parametreler için ilk tahmin elde etmek için imleçler makrosu arasındaki uygun PB'yi kullanın. Form faktörüne gelince, birleşik düzey modeli için doğrusal olmayan bir uyum gerçekleştirin.Kırınım tepe noktası varsa, Q ilgi aralığında kırınım tepe için üçüncü bir model ekleyin. Bireysel saçılma popülasyonları için yaklaşık uygun değerler elde edildikten sonra, üçünü birlikte açın ve birleştirilmiş uyumu optimize edin. Son olarak, her değerin fiziksel olarak makul olup olmadığını denetleyin ve klasördeki depoyu seçerek sığdırma kaydedin.Bu yordamın sonucu, küçük açılı x-ışını saçılma verilerini çok çeşitli boyut ölçekleri üzerinde açıklayan kompozit bir model olmalıdır. Bu protokol, nükleik asit polielektrolit karmaşık misellerin veya PCM'lerin tasarımı, montajı ve karakterizei için kullanılmıştır.Kısa tek iplikli oligonükleotidlerde nispeten uzun blok kopolimerlerden oluşan küresel PCM'ler için dinamik ışık saçılma verileri elde edilmiştir. Otomatik korelasyon işlevi, repIS boyut dağılımında tek boyutlu tepe noktasına ulaşan tek zaman ölçeği ile düz bir değere bozunur. Karmaşık küçük melek x-ışını saçılma veya SAXS yoğunluk spektrumları, mevcut olan birden fazla uzamsal korelasyon için modelleri birleştirerek doğru bir şekilde sığabilir ve çok açılı ışık saçılımı, saçılma ölçümlerini daha uzun uzunluk ölçeklerine genişletmek için kullanılabilir.Farklı morfolojipcms de çekirdek yarıçapı ve şekli saxs veri uydurma elde edilen değerlerle tutarlı olduğunu doğrulamak için elektron mikroskobu ile görüntülenebilir. SAXS verilerini takarken, her saçılma özelliğini hesaba katmak ve doğru form faktörlerini kullandığınızdan emin olmak için TEM gibi ücretsiz yöntemler kullanmak önemlidir.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Origami Inspired Self-assembly of Patterned and Reconfigurable Particles

Origami Inspired Desenli ve Reconfigurable Parçacıkların Self-assembly

There are numerous techniques such as photolithography, electron-beam lithography and soft-lithography that can be used to precisely pattern two ...

Formation of Ordered Biomolecular Structures by the Self-assembly of Short Peptides

Kısa Peptidlerinin Self-meclisi tarafından Sıralı Biyomoleküler Yapıların Oluşumu

In nature, complex functional structures are formed by the self-assembly of biomolecules under mild conditions. Understanding the forces that control ...

Synthesis and Characterization of Functionalized Metal-organic Frameworks

Fonksiyonlu Sentezi ve Karakterizasyonu Metal-organik Altyapıları

Metal-organic frameworks have attracted extraordinary amounts of research attention, as they are attractive candidates for numerous industrial and ...

Self-assembly of Complex Two-dimensional Shapes from Single-stranded DNA Tiles

Tek iplikli DNA Fayans Complex iki boyutlu şekiller Self-montaj

Current methods in DNA nano-architecture have successfully engineered a variety of 2D and 3D structures using principles of self-assembly. In this ...

Preparation and Characterization of Individual and Multi-drug Loaded Physically Entrapped Polymeric Micelles

Hazırlanması ve Bireysel Karakterizasyonu ve Multi-ilaç Fiziksel, polimerik misellerin Entrapped Loaded

Amphiphilic block copolymers like polyethyleneglycol-block-polylactic acid (PEG-b-PLA) can self-assemble into micelles above their critical micellar ...

Synthesis and Characterization of Supramolecular Colloids

Supramoleküler Kolloidlerin Sentezi ve Karakterizasyonu

Control over colloidal assembly is of utmost importance for the development of functional colloidal materials with tailored structural and mechanical ...

On-line Analysis of Nitrogen Containing Compounds in Complex Hydrocarbon Matrixes

Karmaşık Hidrokarbon Matrisler içinde İçeren Bileşiklerin Azot On-line Analizi

The shift to heavy crude oils and the use of alternative fossil resources such as shale oil are a challenge for the petrochemical industry. The ...

Facile Synthesis of Worm-like Micelles by Visible Light Mediated Dispersion Polymerization Using Photoredox Catalyst

Photoredox Katalizörü kullanarak görünür ışık aracılığı ile dispersiyon polimerleştirilmesi ile solucan gibi miseller Facile sentezi

Presented herein is a protocol for the facile synthesis of worm-like micelles by visible light mediated dispersion polymerization. This approach begins ...

Anionic Polymerization of an Amphiphilic Copolymer for Preparation of Block Copolymer Micelles Stabilized by &#960;-&#960; Stacking Interactions

Anionic Polymerization of an Amphiphilic Copolymer for Preparation of Block Copolymer Micelles Stabilized by ÃƒÆ’Ã‚ÂÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬-ÃƒÆ’Ã‚ÂÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ Stacking Interactions

π-π İstifleme etkileşimlerle Stabilize blok kopolimer miselleri hazırlanması için bir amfifilik kopolimerin anyonik polimerizasyonu

In this study, an amphiphilic copolymer that includes a core-forming block with phenyl groups was synthesized by living anionic polymerization of phenyl ...

Preparation and Characterization of C60/Graphene Hybrid Nanostructures

Preparation and Characterization of C60/Graphene Hybrid Nanostructures

C60/Graphene hibrid nanoyapıların malzemelerin hazırlık ve

Physical thermal deposition in a high vacuum environment is a clean and controllable method for fabricating novel molecular nanostructures on graphene. We ...