Name: 3d modeling of dendritic spines with synaptic plasticity
Uploaded: 2020-05-18T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about 3D Modeling of Dendritic Spines with Synaptic Plasticity at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado em parte pela Fundação de Ciência do Estado de São Paulo (FAPESP) #2015/50122-0 e IRTG-GRTK 1740/2, pela bolsa IBM/FAPESP #2016/18825-4, e pela concessão da FAPESP #2018/06504-4.

NOTA: Consulte o arquivo suplementar 1 para o glossário dos termos utilizados neste protocolo.
1. Instale liquidificador, CellBlender e MCell
NOTA: Este protocolo requer a instalação de MCell, Blender e Blender de células.
<ol><li>Baixe e instale o software na página inicial do MCell (https://mcell.org/tutorials_iframe.html). Vá para downloads na parte superior da página e siga as instruções passo a passo para baixar e instalar o software...

<ol>
	<li>Sweatt, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+plasticity+and+behavior+-+sixty+years+of+conceptual+advances.">Neural plasticity and behavior - sixty years of conceptual advances.</a> Journal of Neurochemistry. 139, 179-199 (2016).</li><li>Heine, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+mobility+of+postsynaptic+AMPARs+tunes+synaptic+transmission.">Surface mobility of postsynaptic AMPARs tunes synaptic transmission.</a> Science. 320 (5873), 201-205 (2008).</li><li>Buonarati, O. R., Hammes, E. A., Watson, J. F., Greger, I. H., Hell, J. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+AMPA+receptor+trafficking+and+synaptic+plasticity.">Regulation of AMPA receptor trafficking and synaptic plasticity.</a> Current Opinion in Neurobiology. 22 (3), 461-469 (2012).</li><li>Matsuda, S., Launey, T., Mikawa, S., Hirai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+AMPA+receptor+GluR2+clusters+following+long-term+depression+induction+in+cerebellar+Purkinje+neurons.">Disruption of AMPA receptor GluR2 clusters following long-term depression induction in cerebellar Purkinje neurons.</a> EMBO Journal. 19 (12), 2765-2774 (2000).</li><li>Ahmad, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postsynaptic+Complexin+Controls+AMPA+Receptor+Exocytosis+during+LTP.">Postsynaptic Complexin Controls AMPA Receptor Exocytosis during LTP.</a> Neuron. 73 (2), 260-267 (2012).</li><li>Sheng, M., Hoogenraad, C. 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Este artigo apresenta um método para a construção de malhas 3D para modelagem de processos de plasticidade sináptica de reação-difusão em um segmento dendrático com espinhas dendríticas. O modelo desenvolvido contém um segmento dendrítica com poucas espinhas dendríticas. A difusão lateral e a reação de AMPARs com âncoras sinápticas permitem a simulação da dinâmica basal. Os passos críticos do protocolo são o corte da esfera para a criação da parte superior da cabeça da coluna vertebral (<strong c...

A plasticidade sináptica tem sido associada ao aprendizado e à memória1. A plasticidade sináptica, como a potencialização a longo prazo (LTP) e a depressão de longo prazo (LTD), está associada, respectivamente, à inserção e remoção de receptores AMPA (AMPARs) dentro e fora da membrana sináptica2. As sinapses AMPAR estão localizadas no topo das pequenas estruturas de volume chamadas espinhos dendríticas3. Cada coluna contém uma região densa de proteína na membrana pós-sináptica chamada densidade pós-sináptica (PSD). Proteínas âncoras no PSD prendem AMPARs na região sináptica. Há poucas cópias de AMPARs dentro de uma única sinapse e o tráfico e reação de AMPARs com outras espécies em espinhas dendríticas é um processo estocástico2,4. Existem vários modelos compartimentais de tráfico de receptores sinápticos em lombadas dendríticas5,,6,,7,8. No entanto, há falta de modelos computacionais estocásticos do tráfico de AMPARs associados à plasticidade sináptica nas estruturas 3D dos dendritos e suas espinhas dendríticas.
A modelagem computacional é uma ferramenta útil para investigar os mecanismos subjacentes à dinâmica de sistemas complexos, como a retração-difusão de AMPARs em lombadas dendríticas durante a ocorrência de plasticidade sináptica9,,10,,11,,12. O modelo pode ser utilizado para visualizar cenários complexos, variando parâmetros sensíveis e fazendo previsões importantes em condições científicas envolvendo muitas variáveis difíceis ou impossíveis de controlar o experimental12,13. Definir o nível de detalhe de um modelo computacional é um passo fundamental na obtenção de informações precisas sobre o fenômeno modelado. Um modelo computacional ideal é um delicado equilíbrio entre complexidade e simplicidade para capturar as características essenciais dos fenômenos naturais sem ser computacionalmente proibitivo. Modelos computacionais muito detalhados podem ser caros para calcular. Por outro lado, sistemas pouco detalhados podem não ter os componentes fundamentais essenciais para capturar a dinâmica do fenômeno. Embora a modelagem 3D de lombadas dendríticas seja computacionalmente mais cara que 2D e 1D, existem condições, como em sistemas complexos com muitas variáveis não lineares reagindo e difundindo no tempo e espaço 3D, para o qual a modelagem em nível 3D é essencial para obter insights sobre o funcionamento do sistema. Além disso, a complexidade pode ser reduzida cuidadosamente para preservar as características essenciais de um modelo de dimensão inferior.
Em um sistema estocástico com poucas cópias de uma determinada espécie dentro de um pequeno volume, a dinâmica média do sistema se desvia da dinâmica média de uma grande população. Neste caso, é necessária a modelagem computacional estocástica de partículas de difusão de reação. Este trabalho introduz um método para modelagem estocástica de difusão de reação de algumas cópias de AMPARs em espinhas dendríticas 3D. O objetivo deste método é desenvolver um modelo computacional 3D de um segmento dendrático com espinhas dendríticas e suas sinapses para modelagem da plasticidade sináptica.
O método usa o software MCell para resolver o modelo numericamente, Blender para a construção de malhas 3D e CellBlender para criar e visualizar as simulações MCell, incluindo a reação espessora-difusão de moléculas em malhas 3D14,,15,,16. Blender é uma suíte para a criação de malhas e CellBlender é um complemento para o liquidificador de software base. MCell é um simulador de Monte Carlo para a difusão de reação de moléculas únicas17.
A lógica por trás do uso desse método consiste na modelagem da plasticidade sináptica para obter uma melhor compreensão desse fenômeno no ambiente microfisiológico das espinhas dendríticas14. Particularmente, este método permite a simulação de potencialização homossináptica, depressão homossináptica e plasticidade heterossináptica entre espinhas dendríticas14.
As características deste método incluem a modelagem da estrutura geométrica 3D do dendrite e suas sinapses, a difusão por caminhada aleatória e as reações químicas das moléculas envolvidas com a plasticidade sináptica. Este método oferece a vantagem de criar ambientes ricos para testar hipóteses e fazer previsões sobre o funcionamento de um sistema complexo não linear com um grande número de variáveis. Além disso, este método pode ser aplicado não apenas para estudar a plasticidade sináptica, mas também para estudar a difusão de reações estocásticas de moléculas em estruturas de malha 3D em geral.
Alternativamente, as malhas 3D de estruturas dendríticas podem ser construídas diretamente no Liquidificador a partir de reconstruções seriais de microscópio eletrônico18. Embora as malhas baseadas em reconstruções seriais forneçam estruturas 3D, o acesso aos dados experimentais nem sempre está disponível. Assim, a construção de malhas adaptadas a partir de estruturas geométricas básicas, conforme descrito no presente protocolo, proporciona flexibilidade para desenvolver segmentos dendríticos personalizados com colunas dendríticas.
Outro método computacional alternativo é a simulação em massa de reações bem mistas em um volume regular9,10,11,19,20,21,22. As simulações a granel são muito eficientes na resolução das reações de muitas espécies dentro de um único volume bem misturado23,mas a abordagem em massa é extremamente lenta para resolver a difusão de reação de moléculas dentro de muitos voxels bem misturados em uma malha 3D de alta resolução. Por outro lado, o presente método utilizando simulações MCell de difusão de reação de partículas individuais funciona eficientemente em malhas 3D de alta resolução15.
Antes de usar este método, deve-se perguntar se o fenômeno estudado requer uma abordagem de retração estocástica em uma malha 3D. Se o fenômeno tem poucas cópias (menos de 1.000) de pelo menos uma das espécies reagindo difundindo em uma estrutura geométrica complexa com pequenos compartimentos de volume, como espinhos dendráticos, então a modelagem estocástica de difusão de reação em malhas 3D é apropriada para a aplicação.
Existem várias etapas necessárias para a construção de um modelo computacional 3D de um segmento dendrático contendo espinhos dendráticos com plasticidade sináptica. As principais etapas são a instalação do software adequado para a construção do modelo, a construção de uma única coluna dendrítica a ser usada como modelo para criar múltiplas lombadas, e a criação de um segmento dendrático conectado com múltiplas espinhas dendríticas. O passo para modelagem da plasticidade sináptica consiste na inserção de âncoras na região do PSD e AMPARs no segmento dendrático e colunas dendríticas. Em seguida, são definidas reações cinéticas entre as âncoras localizadas no PSD e AMPARs para produzir espécies complexas de anchor-AMPAR que prendem os AMPARs na região sináptica. Respectivamente, o aumento e diminuição da afinidade entre as âncoras e as AMPARs sinápticas criam o processo de LTP e LTD.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Blender</td>
			<td>Blender Foundation</td>
			<td></td>
			<td>https://www.blender.org/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellBlender</td>
			<td>University of Pittsburgh</td>
			<td></td>
			<td>https://mcell.org/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mcell</td>
			<td>University of Pittsburgh</td>
			<td></td>
			<td>https://mcell.org/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

3d modeling of dendritic spines with synaptic plasticity

A modelagem computacional da difusão e reação de espécies químicas em uma geometria tridimensional (3D) é um método fundamental para entender os mecanismos de plasticidade sináptica em espinhas dendríticas. Neste protocolo, a estrutura 3D detalhada dos dendritos e colunas dendríticas é modelada com malhas no blender de software com CellBlender. As regiões sinápticas e extrassinápticas são definidas na malha. Em seguida, o receptor sináptico e as moléculas de âncora sináptica são definidas com suas constantes de difusão. Finalmente, as reações químicas entre receptores sinápticos e âncoras sinápticas são incluídas e o modelo computacional é resolvido numericamente com o software MCell. Este método descreve o caminho espacial de cada molécula em uma estrutura geométrica 3D. Assim, é muito útil estudar o tráfico de receptores sinápticos dentro e fora das espinhas dendríticas durante a ocorrência de plasticidade sináptica. Uma limitação deste método é que o alto número de moléculas diminui a velocidade das simulações. A modelagem das espinhas dendríticas com este método permite o estudo da potencialização homossináptica e da depressão dentro de espinhas simples e plasticidade heterossináptica entre as espinhas dendríticas vizinhas.

Esses resultados fornecem os passos para a construção de uma malha 3D que simula uma coluna dendrítica com cabeça de coluna e pescoço de coluna(Figura 1 a Figura 4). Além disso, múltiplas espinhas dendríticas podem ser inseridas em um único segmento dendrático (Figura 5) para estudar a plasticidade heterossináptica de AMPARs14. O PSD na parte superior da cabeça da coluna vertebral (<strong class="...

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3D Modeling of Dendritic Spines with Synaptic Plasticity

O protocolo desenvolve um modelo tridimensional (3D) de um segmento dendrático com espinhos dendráticos para modelagem da plasticidade sináptica. A malha construída pode ser usada para modelagem computacional do tráfico de receptores AMPA na plasticidade sináptica de longo prazo usando o programa de software Blender com CellBlender e MCell.

Modelagem 3D de Espinhos Dendríticas com Plasticidade Sináptica

Computational modeling of diffusion and reaction of chemical species in a three-dimensional (3D) geometry is a fundamental method to understand the ...

Modelagem geométrica 3D computacional da reação de espécies químicas através da fusão. é um método útil para estudar os mecanismos de tráfico de receptores dentro e fora da coluna dendrítica está fazendo plasticidade sináptica. Essa técnica tem a vantagem de criar um ambiente rico para fazer hipóteses e projeções sobre sistemas não lineares com um grande número de variáveis.Para criar uma malha de uma única coluna dendrítica com uma cabeça de coluna e um pescoço de coluna usando uma esfera modificada. Primeiro liquidificador aberto. Com o Blender celular já instalado e pressione 5 no teclado, para mudar da perspectiva para a visão ortogonal.Pressione 1 para mudar para a visão frontal e pressione o Turno C para centralizar o cursor. Para criar a cabeça da coluna, pressione shift A para abrir a paleta Malha e selecione a Malha. Selecione esfera UV e na esfera UV adicionada, defina o tamanho para 0,25 e os anéis para 32.Para fazer a parte superior da cabeça, pressione a guia de pressione para alternar o Liquidificador do modo Objeto para o modo Editar. Pressione B para selecionar os três quartos superiores da esfera e pressione Excluir, selecione Vértices e Enter para remover os vértices. Pressione B e selecione a parte superior da esfera.Pressione E, S, 0 e Enter para selar a parte superior dos vértices ainda selecionados. E mova a seta azul para baixo para se alinhar ao topo da cabeça da coluna. Para aumentar a resolução da malha na parte superior da coluna, selecione Ferramenta e faca e use a faca para cortar um círculo ao redor do centro da parte superior.Em seguida, selecione Corte de ferramenta e loop e deslize quatro vezes para criar quatro círculos concêntricos ao redor do centro da parte superior. Para criar a pressão do pescoço da coluna B e selecione a parte inferior da malha. Pressione Excluir vértices e B e selecione a parte inferior da malha.Pressione E e Z e selecione menos 0,45 para criar uma extrusão na posição do eixo Z, a menos 0,45 micro metros. Para tornar a malha compatível com a prensa de célula M Ctrl T para triangular a malha e selecionar ferramentas e remover duplas. Para criar uma prensa dendrite de coluna múltipla Shift A para abrir a paleta Malha e selecionar Malha e Cilindro.No menu Adicionar cilindro, ajuste o raio 0,3 micrômetros e a profundidade em dois micrômetros e pressione Enter. Pressione R e digite 90 para girar o cilindro 90 graus e use a seta azul para arrastar o cilindro para o fundo da coluna. Pressione 3 para obter uma visão frontal do cilindro e pressione Z para tornar a malha transparente.Use a seta azul normal para mover a base da coluna vertebral para o interior do cilindro e clique com o botão direito do mouse para selecionar o Dendrite. Selecione Modificador e Modificador de Adoção e selecione Boolean, Operação União e selecione Coluna de Objeto. Clique em Aplicar para criar uma malha articular do Dendrite e da coluna vertebral.Em seguida, use o mouse para selecionar a malha da coluna isolada, alterando a posição e o ângulo para inserir cada nova coluna em uma posição fisiológica. Para criar AMPARs, selecione Moléculas e insira uma nova molécula. Mude o nome para AMPAR e altere o tipo de molécula para molécula de superfície.Em seguida, mude a constante de difusão 0,05 vezes 10 para o oitavo centímetro quadrado por segundo. Para traçar as âncoras vinculadas às AMPARs, no PSD1 durante a condição basal, abra as Configurações de Saída do Enredo e pressione para definir as moléculas. Em seguida, coloque a Molécula para Anchor_AMPAR, o Objeto de Dendrite e a Região para PSD1.Para executar uma simulação de Condição Basal selecione Simulação executar. E definir as iterações para 30.000 e o tempo passo para um vezes 10 para menos três segundos. Clique em Exportar e Executar e aguarde o término da simulação.No final da simulação, selecione Recarregar dados de visualização, reproduzir animação, configurações de saída de gráfico e plotar para visualizar os resultados temporais espaciais. Para executar a condição de potencialização homossináptica selecione a colocação da molécula e rel_anchorLTP_psd1. Selecione rel_anchorLTP_psd1 e altere a quantidade para liberar para 200.Em seguida, altere a quantidade para liberar para zero. Selecione rel_anchor_psd1. Alterar quantidade para liberar para zero e executar a simulação como apenas demonstrado.A plasticidade sináptica pode ser aproximadamente verificada através de alterações no número de espécies de AMPARs ligadas a âncoras em cada coluna. Para o cálculo exato da ocorrência de plasticidade sináptica. Recomenda-se calcular a variação dos números totais de AMPARs ancorados e livres na sinapse.A potencialização e a depressão homossináptica ampar podem ser verificadas através de aumentos e reduções no número de AMPARs ancorados, respectivamente, causadas por mudanças na afinidade dos AMPARs por âncoras em comparação com a condição basal. Por exemplo, a indução de potencialização homossináptica a longo prazo em uma única coluna vertebral cria um efeito depressivo heterossináptico a longo prazo nas espinhas vizinhas. Após este procedimento, o modelo pode ser expandido para investigar o processo de indução de LTP e LTD em lombadas dendríticas.Este método permite o teste de hipóteses sobre o funcionamento de sistemas complexos não lineares com um grande número de variáveis.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Preparation of Oligomeric &beta;-amyloid1-42 and Induction of Synaptic Plasticity Impairment on Hippocampal Slices

Preparation of Oligomeric ÃƒÅ½Ã‚Â²-amyloid1-42 and Induction of Synaptic Plasticity Impairment on Hippocampal Slices

Preparação de Oligoméricas β-amilóide 1-42 Indução e de Impairment plasticidade sináptica em fatias do hipocampo

Impairment of synaptic connections is likely to underlie the subtle amnesic changes occurring at the early stages of Alzheimer s Disease (AD). ...

Neurociência

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

Fluorescence Recovery After Photobleaching FRAP of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

Recuperação de fluorescência Após Fotodegradação (FRAP) de fluorescência Proteínas Tagged em espinhas dendríticas dos neurônios do hipocampo Cultivadas

FRAP has been used to quantify the mobility of GFP-tagged proteins. Using a strong excitation laser, the fluorescence of a GFP-tagged protein is bleached ...

Lateral Diffusion and Exocytosis of Membrane Proteins in Cultured Neurons Assessed using Fluorescence Recovery and Fluorescence-loss Photobleaching

Difusão lateral e Exocitose de proteínas de membrana em neurônios cultivados avaliada através da recuperação de fluorescência e fluorescência perda de fotobranqueamento

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This ...

Voltage-sensitive Dye Recording from Axons, Dendrites and Dendritic Spines of Individual Neurons in Brain Slices

Tensão sensível Gravação Dye de axônios, dendritos e espinhas dendríticas de neurônios individuais em fatias de cérebro

Understanding the biophysical properties and functional organization of single neurons and how they process information is fundamental for understanding ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

Rápido Micro-iontoforese de glutamato e GABA: uma ferramenta útil para investigar Integração Synaptic

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Deriving the Time Course of Glutamate Clearance with a Deconvolution Analysis of Astrocytic Transporter Currents

Derivando o Curso momento do desembaraço glutamato com uma Análise de Deconvolução das correntes Transporter astrocitárias

The highest density of glutamate transporters in the brain is found in astrocytes. Glutamate transporters couple the movement of glutamate across the ...

Imaging Dendritic Spines of Rat Primary Hippocampal Neurons using Structured Illumination Microscopy

Imagiologia espinhas dendríticas dos neurônios do hipocampo de rato primária usando Structured Illumination Microscopy

Dendritic spines are protrusions emerging from the dendrite of a neuron and represent the primary postsynaptic targets of excitatory inputs in the brain. ...

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Two-Photon<em&gt; In vivo</em&gt; Imagem de espinhas dendríticas no Rato Cortex Usando um desbaste-crânio Preparação

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as ...

Pentylenetetrazole-Induced Kindling Mouse Model

Inflamação induzida pela mielinização Mouse modelo

Pentylenetetrazole (PTZ) is a GABA-A receptor antagonist. An intraperitoneal injection of PTZ into an animal induces an acute, severe seizure at a high ...

Combining Optogenetics with Artificial microRNAs to Characterize the Effects of Gene Knockdown on Presynaptic Function within Intact Neuronal Circuits

Combinação de Optogenetics com microRNAs Artificial para caracterizar os efeitos do Gene Knockdown na função pré-sináptica dentro circuitos neuronais intacta

The purpose of this protocol is to characterize the effect of gene knockdown on presynaptic function within intact neuronal circuits. We describe a ...