Name: fabricating multi-component lipid nanotube networks using the gliding kinesin motility assay
Uploaded: 2021-07-26T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fabricating Multi-Component Lipid Nanotube Networks Using the Gliding Kinesin Motility Assay at JoVE.com

تم دعم هذا العمل من قبل وزارة الطاقة الأمريكية ، ومكتب علوم الطاقة الأساسية ، وقسم علوم وهندسة المواد (BES-MSE). تم إجراء تركيب Kinesin والفحص المجهري الفلوري من خلال مشروع مستخدم (ZIM) في مركز تقنيات النانو المتكاملة ، وهو مرفق مستخدم تابع لمكتب العلوم التابع لوزارة الطاقة الأمريكية (DOE).

1. إعداد حلول الأنابيب الدقيقة للمخزون
تنبيه: يجب دائما ارتداء نظارات السلامة والقفازات ومعطف المختبر طوال البروتوكول.
<ol><li>تحضير 5x BRB80 العازل: إضافة 24.19 غرام من الأنابيب (بيبيرازين-N، N′-مكرر [2-حمض الإيثان سلفونيك]) و 0.38 غرام من EGTA (الإيثيلين جلايكول-بيس [β-أمينو إيثيل الأثير]-...

<ol>
	<li>Bouxsein, N. F., Carroll-Portillo, A., Bachand, M., Sasaki, D. Y., Bachand, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+continuous+network+of+lipid+nanotubes+fabricated+from+the+gliding+motility+of+kinesin+powered+microtubule+filaments.">A continuous network of lipid nanotubes fabricated from the gliding motility of kinesin powered microtubule filaments.</a> Langmuir. 29 (9), 2992-2999 (2013).</li><li>Paxton, W. F., Bouxsein, N. F., Henderson, I. M., Gomez, A., Bachand, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+assembly+of+polymer+nanotube+networks+via+kinesin+powered+microtubule+filaments.">Dynamic assembly of polymer nanotube networks via kinesin powered microtubule filaments.</a> Nanoscale. 7 (25), 10998-11004 (2015).</li><li>Leduc, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperative+extraction+of+membrane+nanotubes+by+molecular+motors.">Cooperative extraction of membrane nanotubes by molecular motors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (49), 17096-17101 (2004).</li><li>Lippincott-Schwartz, J., Roberts, T. H., Hirschberg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secretory+protein+trafficking+and+organelle+dynamics+in+living+cells.">Secretory protein trafficking and organelle dynamics in living cells.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 16, 557-589 (2000).</li><li>Belting, M., Wittrup, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanotubes,+exosomes,+and+nucleic+acid-binding+peptides+provide+novel+mechanisms+of+intercellular+communication+in+eukaryotic+cells:+implications+in+health+and+disease.">Nanotubes, exosomes, and nucleic acid-binding peptides provide novel mechanisms of intercellular communication in eukaryotic cells: implications in health and disease.</a> Journal of Cell Biology. 183 (7), 1187-1191 (2008).</li><li>Rustom, A., Saffrich, R., Markovic, I., Walther, P., Gerdes, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanotubular+highways+for+intercellular+organelle+transport.">Nanotubular highways for intercellular organelle transport.</a> Science. 303 (5660), 1007-1010 (2004).</li><li>Onfelt, B., Nedvetzki, S., Yanagi, K., Davis, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutting+edge:+Membrane+nanotubes+connect+immune+cells.">Cutting edge: Membrane nanotubes connect immune cells.</a> Journal of Immunology. 173 (3), 1511-1513 (2004).</li><li>Sciaky, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Golgi+tubule+traffic+and+the+effects+of+brefeldin+A+visualized+in+living+cells.">Golgi tubule traffic and the effects of brefeldin A visualized in living cells.</a> J Cell Biol. 139 (5), 1137-1155 (1997).</li><li>Sprong, H., van der Sluijs, P., van Meer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+proteins+move+lipids+and+lipids+move+proteins.">How proteins move lipids and lipids move proteins.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2 (7), 504-513 (2001).</li><li>Keenan, T. W., Morre, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospholipid+class+and+fatty+acid+composition+of+golgi+apparatus+isolated+from+rat+liver+and+comparison+with+other+cell+fractions.">Phospholipid class and fatty acid composition of golgi apparatus isolated from rat liver and comparison with other cell fractions.</a> Biochemistry. 9 (1), 19-25 (1970).</li><li>Imam, Z. I., Bachand, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicomponent+and+Multiphase+Lipid+Nanotubes+Formed+by+Gliding+Microtubule-Kinesin+Motility+and+Phase-Separated+Giant+Unilamellar+Vesicles.">Multicomponent and Multiphase Lipid Nanotubes Formed by Gliding Microtubule-Kinesin Motility and Phase-Separated Giant Unilamellar Vesicles.</a> Langmuir. 35 (49), 16281-16289 (2019).</li><li>Wesolowska, O., Michalak, K., Maniewska, J., Hendrich, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Giant+unilamellar+vesicles+-+a+perfect+tool+to+visualize+phase+separation+and+lipid+rafts+in+model+systems.">Giant unilamellar vesicles - a perfect tool to visualize phase separation and lipid rafts in model systems.</a> Acta Biochimica Polonica. 56 (1), 33-39 (2009).</li><li>Momin, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designing+lipids+for+selective+partitioning+into+liquid+ordered+membrane+domains.">Designing lipids for selective partitioning into liquid ordered membrane domains.</a> Soft Matter. 11 (16), 3241-3250 (2015).</li><li>Fygenson, D. K., Braun, E., Libchaber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+diagram+of+microtubules.">Phase diagram of microtubules.</a> Physical Review E. 50, 1579 (1994).</li><li>Greene, A. C., Sasaki, D. Y., Bachand, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forming+Giant-sized+Polymersomes+Using+Gel-assisted+Rehydration.">Forming Giant-sized Polymersomes Using Gel-assisted Rehydration.</a> Journal of Visualized Experiments. (111), (2016).</li><li>Bachand, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+self-assembly+of+1D+microtubule+nano-arrays.">Directed self-assembly of 1D microtubule nano-arrays.</a> Royal Society of Chemistry Advances. 4 (97), 54641-54649 (2014).</li></ol>

تعد شبكات LNT أداة مفيدة للدراسات المخبرية لخصائص الغشاء ونقل الجزيئات الحيوية مثل البروتينات عبر الغشاء. علاوة على ذلك ، فإن استخدام تركيبات الدهون المعقدة لتصنيع شبكات LNT يتيح إجراء المزيد من الدراسات ذات الصلة بيولوجيا. استخدمت دراسات تصنيع أخرى إما 1) تركيبات دهنية بسيطة وحويصلات متعدد...

إن تصنيع شبكات الأنابيب النانوية الدهنية (LNT) ذو أهمية متزايدة للفحص المختبري للهياكل الدهنية غير المتوازنة1،2،3. تستخدم الخلايا أنابيب الدهون للنقل المنتشر للبروتينات4 والأحماض النووية5 وكذلك الاتصال من خلية إلى خلية 6,7. تعتبر الشبكة الإندوبلازمية وجهاز غولجي مثيرة للاهتمام بشكل خاص ، حيث أن هذه العضيات المرتبطة بالغشاء هي المواقع الرئيسية لتخليق الدهون والبروتين وكذلك نقل هذه الجزيئات الحيوية المتكاملة داخل سيتوبلازم الخلية 8,9. تتكون أغشية هذه العضيات من أنواع متعددة من الدهون بما في ذلك الدهون السفينغولية والكوليسترول والفوسفوليبيد10 التي تساعد في نهاية المطاف على تحديد وظائفها. وبالتالي ، لتكرار هذه العضيات ودراستها عن كثب ، يجب تصنيع LNTs في المختبر من الحويصلات ذات تركيبات الدهون المعقدة بشكل متزايد11.
تستخدم حويصلات أحادية الصفيحة العملاقة (GUVs) على نطاق واسع لدراسة سلوك الغشاء الدهني لأنه يمكن تصنيعها بشكل موثوق مع تركيبات معقدة تشمل الكوليسترول والفوسفاتيديل كولين (PC) والفوسفاتيديل إيثانولامين (PE) والفوسفاتيديل سيرين (PS) والفوسفاتيديلينوسيتول (PI) 12,13. الموصوفة هنا هي طريقة لتصنيع LNTs من GUVs مع تركيبات دهنية مختلفة باستخدام مقايسة الحركة الانزلاقية (GMA) ، حيث يتم بثق LNTs بناء على العمل الذي تقوم به محركات kinesin وخيوط microtubule التي تعمل على GUVs. في هذا النظام ، تدفع البروتينات الحركية كينيسين الممتصة إلى سطح الأنابيب الدقيقة البيوتينيل ، وتحول الطاقة الكيميائية من التحلل المائي ل ATP إلى عمل مفيد (على وجه التحديد ، بثق LNTs من الحويصلات البيوتينيلية)11. توفر شبكة LNT الناتجة منصة نموذجية لدراسة آثار الاختلافات في مراحل الدهون على التغيرات في مورفولوجيا LNT.
باختصار ، يتم إدخال بروتينات محرك كينيسين في غرفة تدفق في محلول يحتوي على الكازين ، مما يتيح امتزاز المحركات على السطح الزجاجي للغرفة. بعد ذلك ، تتدفق الأنابيب الدقيقة البيوتينيل في محلول يحتوي على ATP عبر الغرفة ويسمح لها بالارتباط بمحركات kinesin وتبدأ الحركة. ثم يتم إدخال محلول ستربتافيدين في الغرفة ويسمح له بالارتباط بشكل غير تساهمي بالأنابيب الدقيقة. وأخيرا ، يتم إدخال GUVs التي تحتوي على دهون البيوتينيل إلى الغرفة وترتبط بالأنابيب الدقيقة المغلفة بالستربتافيدين ، ثم تقذف LNTs لتشكيل شبكات واسعة النطاق على مدار 15-30 دقيقة. تنتج هذه الطريقة شبكات LNT كبيرة ومتفرعة باستخدام معدات المختبرات القياسية والكواشف بتكلفة منخفضة11.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1071px;" width="1071">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:65px;width:328px;">100x/1.4 Numerical Aperture Oil Immersion Objective</td>
			<td style="width:104px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;">1-U2B836</td>
			<td style="width:520px;">Olympus UPlanSApo 100x/1.40 Oil Objective Infinity Corrected, RMS Thread 
			Working Distance 0.12mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">3.0 ND Filter</td>
			<td style="width:104px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Neutral Density Filter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">AMP-PNP</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A2647</td>
			<td>(&#946;,&#947;-imidoadenosine 5&#8242;-triphosphate)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">ATP</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A7699</td>
			<td>Adenosine 5&#39;-triphosphate disodium salt hydrate BioXtra</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:328px;">Brightline Pinkel DA/FI/TR/Cy5/Cy7-5X-A000 filter set</td>
			<td style="width:104px;">Semrock</td>
			<td style="width:119px;">LED-DA/FI/TR/Cy5/Cy7-5X-A-000</td>
			<td style="width:520px;"> 
			BrightLine Pinkel filter set, optimized for DAPI, FITC, TRITC, Cy5 &#38; Cy7 and other like fluorophores, illuminated with LED-based light sources</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Casein</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">22090</td>
			<td>Casein hydrolysate for microbiology</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Catalase</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C9322</td>
			<td>Catalase from Bovine Liver</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Chloroform</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">288306</td>
			<td>Chloroform anhydrous contains 0.5-1.0% ethanol as stabilizer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Cholesterol</td>
			<td style="width:104px;">Avanti</td>
			<td style="width:119px;">700000P</td>
			<td>cholesterol (ovine wool, &#62;98%) (powder)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:328px;">D-Glucose</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G7021</td>
			<td style="width:520px;">D-(+)-Glucose powder, BioReagent, suitable for cell culture, suitable for insect cell culture, suitable for plant cell culture, &#8805;99.5%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">DOPC</td>
			<td style="width:104px;">Avanti</td>
			<td style="width:119px;">850375C</td>
			<td>1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (in chloroform)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">DOPE-Biotin</td>
			<td style="width:104px;">Avanti</td>
			<td style="width:119px;">870282C</td>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(biotinyl) (sodium salt)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">DPPC</td>
			<td style="width:104px;">Avanti</td>
			<td style="width:119px;">850355P</td>
			<td>1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (powder)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">DPPE-Biotin</td>
			<td style="width:104px;">Avanti</td>
			<td style="width:119px;">870285P</td>
			<td>1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(biotinyl) (sodium salt)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">DTT</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">43816</td>
			<td>DL-Dithiothreitol solution 1 M</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:328px;">EGTA</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">E4378</td>
			<td style="width:520px;">EGTA, Egtazic acid, Ethylene-bis(oxyethylenenitrilo)tetraacetic acid, Glycol ether diamine tetraacetic acid</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:328px;">Glucose Oxidase</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G6125</td>
			<td style="width:520px;">Glucose Oxidase from Aspergillus niger 
			Type II, &#8805;10,000 units/g solid (without added oxygen)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Glycerol</td>
			<td style="width:104px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">G33</td>
			<td>Glycerol (Certified ACS), Fisher Chemical</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">GTP</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G8877</td>
			<td>Guanosine 5&#8242;-triphosphate sodium salt hydrate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">IX-81 Olympus Microscope</td>
			<td style="width:104px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>IX81 Inverted Microscope from Olympus</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">KOH</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">1050121000</td>
			<td>Potassium Hydroxide</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Magnesium Chloride</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M1028</td>
			<td>1.00 M magnesium chloride solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Orca Flash 4.0 Digital Camera</td>
			<td style="width:104px;">Hamamatsu</td>
			<td style="width:119px;">C13440-20CU</td>
			<td>ORCA-Flash 4.0 V3 Digital CMOS camera</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Oregon Green-DHPE</td>
			<td style="width:104px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">O12650</td>
			<td>Oregon Green 488 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Paclitaxel</td>
			<td style="width:104px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">P3456</td>
			<td>Paclitaxel (Taxol Equivalent) - for use in research only</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:328px;">PIPES</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P6757</td>
			<td style="width:520px;">1,4-Piperazinediethanesulfonic acid, Piperazine-1,4-bis(2-ethanesulfonic acid), Piperazine-N,N&#8242;-bis(2-ethanesulfonic acid)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:328px;">Texas Red-DHPE</td>
			<td style="width:104px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">T1395MP</td>
			<td style="width:520px;">Texas Red 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine, 
			Triethylammonium Salt</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Trolox</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">238813</td>
			<td>(&#177;)-6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Tubulin, Biotin</td>
			<td style="width:104px;">Cytoskeleton</td>
			<td style="width:119px;">T333P</td>
			<td>Tubulin protein (biotin) porcine brain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Tubulin, Hy-Lite 488</td>
			<td style="width:104px;">Cytoskeleton</td>
			<td style="width:119px;">TL488M</td>
			<td>Tubulin protein (fluorescent HiLyte 488) porcine brain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Tubulin, Unlabeled</td>
			<td style="width:104px;">Cytoskeleton</td>
			<td style="width:119px;">T240</td>
			<td>Tubulin protein porcine brain</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fabricating multi-component lipid nanotube networks using the gliding kinesin motility assay

تمثل شبكات الأنابيب النانوية الدهنية (LNT) نظاما نموذجيا في المختبر لدراسة النقل الجزيئي والفيزياء الحيوية للدهون ذات الصلة بأنابيب الدهون الموجودة في كل مكان الموجودة في الخلايا حقيقية النواة. ومع ذلك ، في الجسم الحي LNTs هي هياكل غير متوازنة للغاية تتطلب طاقة كيميائية ومحركات جزيئية ليتم تجميعها وصيانتها وإعادة تنظيمها. علاوة على ذلك ، فإن تكوين LNTs في الجسم الحي معقد ، ويتألف من أنواع مختلفة من الدهون. الطرق النموذجية لبثق LNTs تتطلب وقتا طويلا وعمالة كثيفة ، وتتطلب ملاقط بصرية ، وبيدات دقيقة ، وماصات دقيقة لسحب الأنابيب النانوية بالقوة من حويصلات الدهون العملاقة. يظهر هنا بروتوكول لفحص حركية الانزلاق (GMA) ، حيث يتم إنشاء شبكات LNT واسعة النطاق بسرعة من حويصلات أحادية الصفيحة العملاقة (GUVs) باستخدام حركية الأنابيب الدقيقة التي تعمل بالطاقة الكينيسينية. باستخدام هذه الطريقة ، يتم تشكيل شبكات LNT من مجموعة واسعة من تركيبات الدهون التي تحاكي تعقيد LNTs البيولوجية ، مما يجعلها مفيدة بشكل متزايد للدراسات في المختبر للفيزياء الحيوية للدهون والنقل المرتبط بالغشاء. بالإضافة إلى ذلك ، هذه الطريقة قادرة على إنتاج شبكات LNT بشكل موثوق به في وقت قصير (<30 دقيقة) باستخدام معدات المختبرات شائعة الاستخدام. خصائص شبكة LNT مثل الطول والعرض وتقسيم الدهون قابلة للضبط أيضا عن طريق تغيير تكوين الدهون من GUVs المستخدمة لتصنيع الشبكات.

تم تصنيع شبكات LNT (الشكل 4) باستخدام البروتوكول الموصوف ، والذي يستخدم العمل الذي يؤديه نقل الكينيسين للأنابيب الدقيقة لبثق LNTs من GUVs. باختصار ، تم تحضير GUVs باستخدام إماهة هلام الأغاروز باستخدام محلول السكروز ، وتم بلمرة الأنابيب الدقيقة في محلول GPEM واستقرت في BRB80T. بعد ذلك ، ?...

Watch this Scientific Journal Video about Fabricating Multi-Component Lipid Nanotube Networks Using the Gliding Kinesin Motility Assay at JoVE.com

Fabricating Multi-Component Lipid Nanotube Networks Using the Gliding Kinesin Motility Assay

يصف هذا البروتوكول عملية لتصنيع شبكات الأنابيب النانوية الدهنية باستخدام حركية كينيسين الانزلاقية بالتزامن مع الحويصلات الدهنية أحادية الصفيحة العملاقة.

تصنيع شبكات الأنابيب النانوية الدهنية متعددة المكونات باستخدام اختبار حركية Kinesin المنزلق

Lipid nanotube (LNT) networks represent an in vitro model system for studying molecular transport and lipid biophysics with relevance to the ubiquitous ...

يسمح هذا البروتوكول بالتوليد البسيط لشبكات الأنابيب النانوية الدهنية واسعة النطاق التي تعرض فيها الأنابيب النانوية الفردية سلوك فصل الطور المشابه لسلوك الحويصلة الأم. الميزة الرئيسية لهذا النهج هي أننا نستوعب العمل الذي تقوم به المحركات الجزيئية لتجميع الأنابيب النانوية الدهنية ذاتيا بطريقة متوازية للغاية ودون تدخل بشري. لإعداد فحص حركية الانزلاق ، أولا ، قم بلصق ثلاث مجموعات من شرائط الشريط على الوجهين على شريحة زجاجية تفصل بينها خمسة ملليمترات.اضغط برفق على غطاء ينزلق على الشريط وأضف 30 ميكرولتر من محلول كينيسين ميكرومولار واحد إلى خلية التدفق المحضرة. بعد خمس دقائق ، أضف 30 ميكرولتر من محلول microtubule 10 ميكروغرام / ملليلتر إلى الخلية ، مع الضغط على مسح المختبر برفق على الطرف الآخر من قناة التدفق لتسهيل تبادل المحلول. بعد خمس دقائق أخرى من الحضانة ، اغسل الخلية مرة إلى ثلاث مرات باستخدام 50 ميكرولتر من محلول حركية درجة حرارة الغرفة لكل غسل قبل إضافة 30 ميكرولتر من محلول ستربتافيدين 10 ميكروغرام / ملليلتر إلى خلية التدفق.بعد 10 دقائق ، أضف 30 ميكرولتر من محلول GUV 10X لحضانة لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ثم أضف ميكرولترين من محلول AMP-PNP 100 ملليمول وأغلق الغرفة بمادة مانعة للتسرب. انقل غرفة التدفق إلى مجهر مقلوب للتصوير وحدد مجموعة المرشحات المناسبة.استخدم هدف الزيت 100X للتركيز أولا على سطح الغطاء قبل الحصول على صورة لشبكة ذات أهمية. ثم افتح الصورة في ImageJ وانقر فوق الصورة واللون والمركب لتراكب القنوات الحمراء والخضراء لإنشاء صورة مركبة. بعد التصوير ، افتح الصورة ذات الاهتمام وانقر فوق تحليل وتعيين مقياس لمعايرة مقياس المجهر.املأ وحدات البكسل بعامل تحويل الميكرومتر وانقر فوق موافق. استخدم أداة الخط متعدد النقاط لتتبع الأنابيب النانوية بدءا من GUV الأصلي واضغط مع الاستمرار على Control و M لقياس الطول. ستقوم أداة معالجة الصور بحفظ كل قياس جديد في نافذة النتائج. عند قياس جميع الأنابيب، حدد صورة وضبط وعتبة وانقر فوق تطبيق لتطبيق العتبة.ثم ارسم مستطيلا بطول معروف فوق الأنبوب المطلوب. لقياس الكثافة المتكاملة للمنطقة، انقر فوق تحليل وقياس لتحديد تقسيم الدهون في عقد الأنابيب النانوية السائلة، استخدم أداة الخط لرسم خط فوق العقدة محل الاهتمام وقياس شدة العقدة في كل من القناتين الخضراء والحمراء. في هذا التحليل التمثيلي ، تم تصنيع شبكات الأنابيب النانوية السائلة كما ثبت لتوليد مراحل مضطربة ومرتبة بالسائل ، بالإضافة إلى حويصلات مفصولة عن الطور.على سبيل المثال ، الحويصلات التي يتم تصنيعها مع 45٪ من الدهون المشبعة و 55٪ من الدهون غير المشبعة تؤدي إلى حويصلات تنفصل إلى مراحل سائلة مضطربة وصلبة متعايشة. ومع ذلك ، إذا تم تضمين الكوليسترول ، فيمكن ملاحظة التعايش بين السائل والسائل ، مما يخلق GUVs تنفصل إلى مراحل مختلطة من السائل ومضطربة السائل. علاوة على ذلك ، يمكن ملاحظة العقد داخل المخاليط المنفصلة عن الطور.أهم شيء يجب تذكره هو اختيار وقت التعرض المناسب ومرشح ND المحدد ليكون قادرا على تصور الأنابيب النانوية الدهنية دون تبييض الفلوروفورات ضوئيا. يسمح لنا تصميم تكوين سلوك الطور للأنابيب النانوية الدهنية باستخدام نظام نموذج أضيق الحدود لبدء دراسة الفيزياء الحيوية للأنابيب النانوية النفقية التي تربط الخلايا.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Plasma Lithography Surface Patterning for Creation of Cell Networks

البلازما الطباعة الحجرية الزخرفة السطحية لإنشاء شبكات الخليوي

Systematic manipulation of a cell microenvironment with micro- and nanoscale resolution is often required for deciphering various cellular and molecular ...

Flexural Rigidity Measurements of Biopolymers Using Gliding Assays

قياسات جمود العاطفة من البوليمرات الحيوية باستخدام فحوصات الانزلاق

Microtubules are cytoskeletal polymers which  play a role in cell division, cell mechanics, and intracellular transport. Each of these functions requires ...

Generation of Shear Adhesion Map Using SynVivo Synthetic Microvascular Networks

جيل من القص التصاق خريطة طريق SynVivo شبكات الاوعية الدموية الدقيقة الاصطناعية

Cell/particle adhesion assays are critical to understanding the biochemical interactions involved in disease pathophysiology and have important ...

Electric Cell-substrate Impedance Sensing for the Quantification of Endothelial Proliferation, Barrier Function, and Motility

الكهربائية الخلوي الركيزة مقاومة استشعار لتقدير حجم انتشار غشائي، الحاجز وظيفة، والحركة

Electric Cell-substrate Impedance Sensing (ECIS) is an in vitro impedance measuring system to quantify the behavior of cells within adherent cell layers. ...

Lipid Bilayer Vesicle Generation Using Microfluidic Jetting

الدهون طبقة ثنائية الحويصلة انشاء طريق ميكروفلويديك النفث

Bottom-up synthetic biology presents a novel approach for investigating and reconstituting biochemical systems and, potentially, minimal organisms. This ...

Fabricating Complex Culture Substrates Using Robotic Microcontact Printing (R-&#181;CP) and Sequential Nucleophilic Substitution

Fabricating Complex Culture Substrates Using Robotic Microcontact Printing R-Ãƒâ€šÃ‚ÂµCP and Sequential Nucleophilic Substitution

افتعال ركائز الثقافة معقدة باستخدام الروبوتية Microcontact الطباعة (R-μCP) وتبديل أليف النواة متسلسل

In tissue engineering, it is desirable to exhibit spatial control of tissue morphology and cell fate in culture on the micron scale. Culture substrates ...

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer (SALB) Method

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer SALB Method

غشاء حيوي تلفيق من المذيبات بمساعدة الدهون طبقة ثنائية (SALB) طريقة

In order to mimic cell membranes, the supported lipid bilayer (SLB) is an attractive platform which enables in vitro investigation of membrane-related ...

Solid Lipid Nanoparticles (SLNs) for Intracellular Targeting Applications

Solid Lipid Nanoparticles SLNs for Intracellular Targeting Applications

الصلبة الدهون النانوية (SLNs) لاستهداف التطبيقات بين الخلايا

Nanoparticle-based delivery vehicles have shown great promise for intracellular targeting applications, providing a mechanism to specifically alter ...

Fabricating Superhydrophobic Polymeric Materials for Biomedical Applications

افتعال فائقة الكره المواد البوليمرية للتطبيقات الطبية الحيوية

Superhydrophobic materials, with surfaces possessing permanent or metastable non-wetted states, are of interest for a number of biomedical and industrial ...

Fabricating Cotton Analytical Devices

افتعال القطن الأجهزة التحليلية

A robust, low-cost analytical device should be user-friendly, rapid, and affordable. Such devices should also be able to operate with scarce samples and ...