Name: fabricating multi-component lipid nanotube networks using the gliding kinesin motility assay
Uploaded: 2021-07-26T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fabricating Multi-Component Lipid Nanotube Networks Using the Gliding Kinesin Motility Assay at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af U.S. Department of Energy, Office of Basic Energy Sciences, Division of Materials Sciences and Engineering (BES-MSE). Kinesinsyntese og fluorescensmikroskopi blev udført gennem et brugerprojekt (ZIM) på Center for Integrated Nanotechnologies, et Office of Science User Facility, der drives for US Department of Energy (DOE) Office of Science.

1. Fremstilling af lagermikrotubululeopløsninger
FORSIGTIG: Sikkerhedsbriller, handsker og en kittel skal altid bæres under hele protokollen.
<ol><li>5x BRB80-bufferen klargøres: Der tilsættes 24,19 g RØR (piperazin-N,N′-bis[2-ethanesulfonsyre]) og 0,38 g EGTA (ethylenglycol-bis[β-aminoethylether]-N,N,N′,N′-tetraeddikesyre) til en 1 L glasflaske. Tilsæt 1 ml 1 M MgCl2 og juster pH til 6,9 med KOH. Tilsæt deioniseret vand for at bringe opløsningen til et slutvolumen ...

<ol>
	<li>Bouxsein, N. F., Carroll-Portillo, A., Bachand, M., Sasaki, D. Y., Bachand, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+continuous+network+of+lipid+nanotubes+fabricated+from+the+gliding+motility+of+kinesin+powered+microtubule+filaments.">A continuous network of lipid nanotubes fabricated from the gliding motility of kinesin powered microtubule filaments.</a> Langmuir. 29 (9), 2992-2999 (2013).</li><li>Paxton, W. F., Bouxsein, N. F., Henderson, I. M., Gomez, A., Bachand, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+assembly+of+polymer+nanotube+networks+via+kinesin+powered+microtubule+filaments.">Dynamic assembly of polymer nanotube networks via kinesin powered microtubule filaments.</a> Nanoscale. 7 (25), 10998-11004 (2015).</li><li>Leduc, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperative+extraction+of+membrane+nanotubes+by+molecular+motors.">Cooperative extraction of membrane nanotubes by molecular motors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (49), 17096-17101 (2004).</li><li>Lippincott-Schwartz, J., Roberts, T. H., Hirschberg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secretory+protein+trafficking+and+organelle+dynamics+in+living+cells.">Secretory protein trafficking and organelle dynamics in living cells.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 16, 557-589 (2000).</li><li>Belting, M., Wittrup, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanotubes,+exosomes,+and+nucleic+acid-binding+peptides+provide+novel+mechanisms+of+intercellular+communication+in+eukaryotic+cells:+implications+in+health+and+disease.">Nanotubes, exosomes, and nucleic acid-binding peptides provide novel mechanisms of intercellular communication in eukaryotic cells: implications in health and disease.</a> Journal of Cell Biology. 183 (7), 1187-1191 (2008).</li><li>Rustom, A., Saffrich, R., Markovic, I., Walther, P., Gerdes, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanotubular+highways+for+intercellular+organelle+transport.">Nanotubular highways for intercellular organelle transport.</a> Science. 303 (5660), 1007-1010 (2004).</li><li>Onfelt, B., Nedvetzki, S., Yanagi, K., Davis, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutting+edge:+Membrane+nanotubes+connect+immune+cells.">Cutting edge: Membrane nanotubes connect immune cells.</a> Journal of Immunology. 173 (3), 1511-1513 (2004).</li><li>Sciaky, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Golgi+tubule+traffic+and+the+effects+of+brefeldin+A+visualized+in+living+cells.">Golgi tubule traffic and the effects of brefeldin A visualized in living cells.</a> J Cell Biol. 139 (5), 1137-1155 (1997).</li><li>Sprong, H., van der Sluijs, P., van Meer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+proteins+move+lipids+and+lipids+move+proteins.">How proteins move lipids and lipids move proteins.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2 (7), 504-513 (2001).</li><li>Keenan, T. W., Morre, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospholipid+class+and+fatty+acid+composition+of+golgi+apparatus+isolated+from+rat+liver+and+comparison+with+other+cell+fractions.">Phospholipid class and fatty acid composition of golgi apparatus isolated from rat liver and comparison with other cell fractions.</a> Biochemistry. 9 (1), 19-25 (1970).</li><li>Imam, Z. I., Bachand, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicomponent+and+Multiphase+Lipid+Nanotubes+Formed+by+Gliding+Microtubule-Kinesin+Motility+and+Phase-Separated+Giant+Unilamellar+Vesicles.">Multicomponent and Multiphase Lipid Nanotubes Formed by Gliding Microtubule-Kinesin Motility and Phase-Separated Giant Unilamellar Vesicles.</a> Langmuir. 35 (49), 16281-16289 (2019).</li><li>Wesolowska, O., Michalak, K., Maniewska, J., Hendrich, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Giant+unilamellar+vesicles+-+a+perfect+tool+to+visualize+phase+separation+and+lipid+rafts+in+model+systems.">Giant unilamellar vesicles - a perfect tool to visualize phase separation and lipid rafts in model systems.</a> Acta Biochimica Polonica. 56 (1), 33-39 (2009).</li><li>Momin, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designing+lipids+for+selective+partitioning+into+liquid+ordered+membrane+domains.">Designing lipids for selective partitioning into liquid ordered membrane domains.</a> Soft Matter. 11 (16), 3241-3250 (2015).</li><li>Fygenson, D. K., Braun, E., Libchaber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+diagram+of+microtubules.">Phase diagram of microtubules.</a> Physical Review E. 50, 1579 (1994).</li><li>Greene, A. C., Sasaki, D. Y., Bachand, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forming+Giant-sized+Polymersomes+Using+Gel-assisted+Rehydration.">Forming Giant-sized Polymersomes Using Gel-assisted Rehydration.</a> Journal of Visualized Experiments. (111), (2016).</li><li>Bachand, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+self-assembly+of+1D+microtubule+nano-arrays.">Directed self-assembly of 1D microtubule nano-arrays.</a> Royal Society of Chemistry Advances. 4 (97), 54641-54649 (2014).</li></ol>

LNT-netværk er et nyttigt værktøj til in vitro-undersøgelser af membranegenskaber og transport af biomolekyler såsom transmembranproteiner. Desuden muliggør brug af komplekse lipidformuleringer til fremstilling af LNT-netværk mere biologisk relevante undersøgelser. Andre fabrikationsundersøgelser har brugt enten 1) enkle lipidformuleringer og multilamellare vesikler eller 2) mere besværlige motilitetsteknikker til fremstilling af netværk fra GUV'er bestående af komplekse lipidformuleringer. Metoden beskrevet ...

Fremstillingen af lipid nanorør (LNT) netværk er af stigende interesse for in vitro undersøgelse af ikke-ligevægt lipidstrukturer 1,2,3. Celler bruger lipidtubuli til diffus transport af proteiner4 og nukleinsyrer5 samt celle-til-celle-kommunikation 6,7. Det endoplasmatiske retikulum- og Golgi-apparat er særligt interessante, da disse membranbundne organeller er de primære steder for lipid- og proteinsyntese samt transport af disse integrerede biomolekyler i cytoplasmaet i en celle 8,9. Membranerne i disse organeller består af flere lipidarter, herunder sphingolipider, kolesterol og fosfolipider10, der i sidste ende hjælper med at definere deres funktionalitet. For nærmere at replikere og studere disse organeller skal in vitro LNT'er fremstilles af vesikler med stadig mere komplekse lipidformuleringer11.
Gigantiske unilamellare vesikler (GUV'er) anvendes gennemgribende til undersøgelse af lipidmembranadfærd, fordi de pålideligt kan syntetiseres med komplekse formuleringer, der inkluderer kolesterol, phosphatidylcholin (PC), phosphatidylethanolamin (PE), phosphatidylserin (PS) og phosphatidylinositol (PI)12,13. Beskrevet her er en metode til fremstilling af LNT'er fra GUV'er med varierende lipidformuleringer ved hjælp af glidemotilitetsassay (GMA), hvor LNT'er ekstruderes baseret på det arbejde, der udføres af kinesinmotorer og mikrotubulilofilamenter, der virker på GUV'er. I dette system adsorberes kinesinmotoriske proteiner til en overflade fremdrive biotinylerede mikrotubuli og omdanner kemisk energi fra hydrolysen af ATP til nyttigt arbejde (specifikt ekstrudering af LNT'er fra biotinylerede vesikler)11. Det resulterende LNT-netværk giver en modelplatform til at studere virkningerne af forskellene i lipidfaser på ændringer i LNT-morfologi.
Kort fortalt indføres kinesinmotoriske proteiner i et flowkammer i en opløsning indeholdende kasein, hvilket muliggør adsorption af motorerne på kammerets glasoverflade. Dernæst strømmer biotinylerede mikrotubuli i en opløsning indeholdende ATP gennem kammeret og får lov til at binde til kinesinmotorerne og begynde motilitet. En streptavidinopløsning indføres derefter i kammeret og får lov til at binde ikke-kovalent til mikrotubuli. Endelig indføres GUV'er indeholdende et biotinyleret lipid i kammeret og binder til de streptavidinbelagte mikrotubuli og ekstruderer derefter LNT'er for at danne store netværk i løbet af 15-30 minutter. Denne metode producerer store, forgrenede LNT-netværk ved hjælp af standard laboratorieudstyr og reagenser til en lav pris11.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1071px;" width="1071">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:65px;width:328px;">100x/1.4 Numerical Aperture Oil Immersion Objective</td>
			<td style="width:104px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;">1-U2B836</td>
			<td style="width:520px;">Olympus UPlanSApo 100x/1.40 Oil Objective Infinity Corrected, RMS Thread 
			Working Distance 0.12mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">3.0 ND Filter</td>
			<td style="width:104px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Neutral Density Filter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">AMP-PNP</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A2647</td>
			<td>(&#946;,&#947;-imidoadenosine 5&#8242;-triphosphate)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">ATP</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A7699</td>
			<td>Adenosine 5&#39;-triphosphate disodium salt hydrate BioXtra</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:328px;">Brightline Pinkel DA/FI/TR/Cy5/Cy7-5X-A000 filter set</td>
			<td style="width:104px;">Semrock</td>
			<td style="width:119px;">LED-DA/FI/TR/Cy5/Cy7-5X-A-000</td>
			<td style="width:520px;"> 
			BrightLine Pinkel filter set, optimized for DAPI, FITC, TRITC, Cy5 &#38; Cy7 and other like fluorophores, illuminated with LED-based light sources</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Casein</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">22090</td>
			<td>Casein hydrolysate for microbiology</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Catalase</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C9322</td>
			<td>Catalase from Bovine Liver</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Chloroform</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">288306</td>
			<td>Chloroform anhydrous contains 0.5-1.0% ethanol as stabilizer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Cholesterol</td>
			<td style="width:104px;">Avanti</td>
			<td style="width:119px;">700000P</td>
			<td>cholesterol (ovine wool, &#62;98%) (powder)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:328px;">D-Glucose</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G7021</td>
			<td style="width:520px;">D-(+)-Glucose powder, BioReagent, suitable for cell culture, suitable for insect cell culture, suitable for plant cell culture, &#8805;99.5%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">DOPC</td>
			<td style="width:104px;">Avanti</td>
			<td style="width:119px;">850375C</td>
			<td>1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (in chloroform)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">DOPE-Biotin</td>
			<td style="width:104px;">Avanti</td>
			<td style="width:119px;">870282C</td>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(biotinyl) (sodium salt)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">DPPC</td>
			<td style="width:104px;">Avanti</td>
			<td style="width:119px;">850355P</td>
			<td>1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (powder)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">DPPE-Biotin</td>
			<td style="width:104px;">Avanti</td>
			<td style="width:119px;">870285P</td>
			<td>1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(biotinyl) (sodium salt)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">DTT</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">43816</td>
			<td>DL-Dithiothreitol solution 1 M</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:328px;">EGTA</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">E4378</td>
			<td style="width:520px;">EGTA, Egtazic acid, Ethylene-bis(oxyethylenenitrilo)tetraacetic acid, Glycol ether diamine tetraacetic acid</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:328px;">Glucose Oxidase</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G6125</td>
			<td style="width:520px;">Glucose Oxidase from Aspergillus niger 
			Type II, &#8805;10,000 units/g solid (without added oxygen)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Glycerol</td>
			<td style="width:104px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">G33</td>
			<td>Glycerol (Certified ACS), Fisher Chemical</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">GTP</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G8877</td>
			<td>Guanosine 5&#8242;-triphosphate sodium salt hydrate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">IX-81 Olympus Microscope</td>
			<td style="width:104px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>IX81 Inverted Microscope from Olympus</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">KOH</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">1050121000</td>
			<td>Potassium Hydroxide</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Magnesium Chloride</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M1028</td>
			<td>1.00 M magnesium chloride solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Orca Flash 4.0 Digital Camera</td>
			<td style="width:104px;">Hamamatsu</td>
			<td style="width:119px;">C13440-20CU</td>
			<td>ORCA-Flash 4.0 V3 Digital CMOS camera</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Oregon Green-DHPE</td>
			<td style="width:104px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">O12650</td>
			<td>Oregon Green 488 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Paclitaxel</td>
			<td style="width:104px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">P3456</td>
			<td>Paclitaxel (Taxol Equivalent) - for use in research only</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:328px;">PIPES</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P6757</td>
			<td style="width:520px;">1,4-Piperazinediethanesulfonic acid, Piperazine-1,4-bis(2-ethanesulfonic acid), Piperazine-N,N&#8242;-bis(2-ethanesulfonic acid)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:328px;">Texas Red-DHPE</td>
			<td style="width:104px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">T1395MP</td>
			<td style="width:520px;">Texas Red 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine, 
			Triethylammonium Salt</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Trolox</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">238813</td>
			<td>(&#177;)-6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Tubulin, Biotin</td>
			<td style="width:104px;">Cytoskeleton</td>
			<td style="width:119px;">T333P</td>
			<td>Tubulin protein (biotin) porcine brain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Tubulin, Hy-Lite 488</td>
			<td style="width:104px;">Cytoskeleton</td>
			<td style="width:119px;">TL488M</td>
			<td>Tubulin protein (fluorescent HiLyte 488) porcine brain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Tubulin, Unlabeled</td>
			<td style="width:104px;">Cytoskeleton</td>
			<td style="width:119px;">T240</td>
			<td>Tubulin protein porcine brain</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fabricating multi-component lipid nanotube networks using the gliding kinesin motility assay

Lipid nanorør (LNT) netværk repræsenterer et in vitro model system til undersøgelse af molekylær transport og lipid biofysik med relevans for de allestedsnærværende lipid tubuli findes i eukaryote celler. Imidlertid er in vivo LNT'er meget ikke-ligevægtsstrukturer, der kræver kemisk energi og molekylære motorer, der skal samles, vedligeholdes og omorganiseres. Desuden er sammensætningen af in vivo LNT'er kompleks og består af flere forskellige lipidarter. Typiske metoder til ekstrudering af LNT'er er både tids- og arbejdskrævende, og de kræver optisk pincet, mikroperler og mikropipetter for med magt at trække nanorør fra gigantiske lipidvesikler. Præsenteret her er en protokol til glidende motilitetsassay (GMA), hvor store LNT-netværk hurtigt genereres fra gigantiske unilamellare vesikler (GUV'er) ved hjælp af kinesindrevet mikrotubululmotilitet. Ved hjælp af denne metode dannes LNT-netværk fra en bred vifte af lipidformuleringer, der efterligner kompleksiteten af biologiske LNT'er, hvilket gør dem mere og mere nyttige til in vitro-undersøgelser af lipidbiofysik og membranassocieret transport. Derudover er denne metode i stand til pålideligt at producere LNT-netværk på kort tid (<30 min) ved hjælp af almindeligt anvendt laboratorieudstyr. LNT-netværkskarakteristika såsom længde, bredde og lipidpartitionering kan også indstilles ved at ændre lipidsammensætningen af guv'erne, der bruges til fremstilling af netværkene.

LNT-netværk (figur 4) blev fremstillet ved hjælp af den beskrevne protokol, som bruger det arbejde, der udføres af kinesintransport af mikrotubuli til at ekstrudere LNT'er fra GUV'er. Kort fortalt blev GUV'er fremstillet under anvendelse af agarosegelrehydrering under anvendelse af saccharoseopløsning, og mikrotubuli blev polymeriseret i GPEM-opløsning og stabiliseret i BRB80T. Dernæst blev kinesinmotorer introduceret i en flowcelle, der dannede et aktivt lag af motorer på overfladen ...

Watch this Scientific Journal Video about Fabricating Multi-Component Lipid Nanotube Networks Using the Gliding Kinesin Motility Assay at JoVE.com

Fabricating Multi-Component Lipid Nanotube Networks Using the Gliding Kinesin Motility Assay

Denne protokol beskriver en proces til fremstilling af lipid nanorør netværk ved hjælp af glidende kinesin motilitet i forbindelse med gigantiske unilamellar lipid vesikler.

Fremstilling af multikomponent lipid nanorør netværk ved hjælp af Glidende Kinesin Motility Assay

Lipid nanotube (LNT) networks represent an in vitro model system for studying molecular transport and lipid biophysics with relevance to the ubiquitous ...

Denne protokol giver mulighed for den enkle generation af store lipid nanorør netværk, hvor de enkelte nanorør viser fase adskillelse adfærd svarende til forældre vesikel. Den vigtigste fordel ved denne tilgang er, at vi koopterer det arbejde, der udføres af molekylærmotorerne for selv at samle lipidnanorørene på en meget parallel måde og uden menneskelig indgriben. For at oprette et glidende motilitetsassay skal du først anbringe tre sæt dobbeltsidede tapestrimler på et glasglas med fem millimeter mellemrum.Tryk forsigtigt en dæksel på båndet og tilsæt 30 mikroliter af en mikromolær kinesinopløsning i den forberedte flowcelle. Efter fem minutter tilsættes 30 mikroliter af en 10 mikrogram / milliliter mikrotubuliopløsning i cellen, og tryk forsigtigt på en laboratorierisk klud mod den modsatte ende af strømningskanalen for at lette opløsningsudvekslingen. Efter yderligere fem minutters inkubation vaskes cellen en til tre gange med 50 mikroliter motilitetsopløsning ved stuetemperatur pr. vask, inden der tilsættes 30 mikroliter 10 mikrogram/milliliter strøptoavidinopløsning til flowcellen.Efter 10 minutter tilsættes 30 mikroliter af en 10X GUV-opløsning til en 30 minutters inkubation ved stuetemperatur. Derefter tilsættes to mikroliter af en 100-millimolar AMP-PNP-opløsning og lukker kammeret med fugemasse. Overfør strømningskammeret til et omvendt mikroskop til billeddannelse, og vælg det passende filtersæt.Brug et 100X oliemål til først at fokusere overfladen af dækslippet, før du får et billede af et netværk af interesse. Åbn derefter billedet i ImageJ, og klik på Billede, Farve og Sammensat for at overlejre de røde og grønne kanaler for at oprette et sammensat billede. Efter billeddannelse skal du åbne billedet af interesse og klikke på Analyser og indstil skala for at kalibrere skalaen til mikroskopet.Udfyld pixel til mikrometerkonverteringsfaktoren, og klik på OK. Brug flerpunktslinjeværktøjet til at spore nanorørene startende fra den overordnede GUV, og tryk og hold på Control og M for at måle længden. Billedbehandlingsværktøjet gemmer hver ny måling i resultatvinduet. Når alle rørene er målt, skal du vælge Billede, Justering og Tærskel og klikke på Anvend for at anvende tærsklen.Tegn derefter et rektangel af kendt længde over det ønskede rør. For at måle områdets integrerede tæthed skal du klikke på Analyser og mål For at bestemme lipidpartitioneringen i de flydende nanorørknudepunkter skal du bruge linjeværktøjet til at tegne en linje over noden af interesse og måle nodeintensiteten i både de grønne og røde kanaler. I denne repræsentative analyse blev flydende nanorørnetværk fremstillet som påvist for at generere væskeforstyrrede og ordnede faser samt faseseparerede vesikler.For eksempel resulterer vesikler syntetiseret med 45% mættet lipid og 55% umættet lipid i vesikler, der adskiller sig i sameksisterende væskeforstyrrede og faste faser. Hvis kolesterol er inkluderet, kan væske-væske sameksistens imidlertid observeres, hvilket skaber GUV'er, der adskiller sig i sameksisterende væskeordnede og væskeforstyrrede faser. Desuden kan knuder observeres inden for de faseseparerede blandinger.Den vigtigste ting at huske er at vælge den passende eksponeringstid og ND-filter indstillet til at kunne visualisere lipidnanorørene uden fotoblegning af fluorophorer. Skræddersy sammensætningen af faseadfærd af lipidnanorørene giver os mulighed for at bruge et minimalistisk modelsystem til at begynde at studere biofysikken i tunnel nanorørene, der forbinder celler.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Plasma Lithography Surface Patterning for Creation of Cell Networks

Systematic manipulation of a cell microenvironment with micro- and nanoscale resolution is often required for deciphering various cellular and molecular ...

Flexural Rigidity Measurements of Biopolymers Using Gliding Assays

Microtubules are cytoskeletal polymers which  play a role in cell division, cell mechanics, and intracellular transport. Each of these functions requires ...

Generation of Shear Adhesion Map Using SynVivo Synthetic Microvascular Networks

Generering af Shear Vedhæftning kort Brug SynVivo Syntetisk Mikrovaskulære Networks

Cell/particle adhesion assays are critical to understanding the biochemical interactions involved in disease pathophysiology and have important ...

Electric Cell-substrate Impedance Sensing for the Quantification of Endothelial Proliferation, Barrier Function, and Motility

Elektrisk celle-substrat Impedans Sensing til kvantificering af endotelproliferation, barrierefunktion, og motilitet

Electric Cell-substrate Impedance Sensing (ECIS) is an in vitro impedance measuring system to quantify the behavior of cells within adherent cell layers. ...

Lipid Bilayer Vesicle Generation Using Microfluidic Jetting

Lipiddobbeltlaget Vesikel Generation Brug Mikrofluid højtryksspuler

Bottom-up synthetic biology presents a novel approach for investigating and reconstituting biochemical systems and, potentially, minimal organisms. This ...

Fabricating Complex Culture Substrates Using Robotic Microcontact Printing (R-&#181;CP) and Sequential Nucleophilic Substitution

Fabricating Complex Culture Substrates Using Robotic Microcontact Printing R-Ãƒâ€šÃ‚ÂµCP and Sequential Nucleophilic Substitution

Opdigte Komplekse kultur Underlag Brug Robotic mikrokontakttrykning (R-μCP) og sekventielle nukleofil substitution

In tissue engineering, it is desirable to exhibit spatial control of tissue morphology and cell fate in culture on the micron scale. Culture substrates ...

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer (SALB) Method

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer SALB Method

Biomembran Fabrication med opløsningsmidlet-assisteret lipiddobbeltlag (Salb) Metode

In order to mimic cell membranes, the supported lipid bilayer (SLB) is an attractive platform which enables in vitro investigation of membrane-related ...

Solid Lipid Nanoparticles (SLNs) for Intracellular Targeting Applications

Solid Lipid Nanoparticles SLNs for Intracellular Targeting Applications

Solid lipidnanopartikler (SLNs) til intracellulær målretning Applications

Nanoparticle-based delivery vehicles have shown great promise for intracellular targeting applications, providing a mechanism to specifically alter ...

Fabricating Superhydrophobic Polymeric Materials for Biomedical Applications

Opdigte superhydrofobe Polymere materialer til biomedicinske anvendelser

Superhydrophobic materials, with surfaces possessing permanent or metastable non-wetted states, are of interest for a number of biomedical and industrial ...

Fabricating Cotton Analytical Devices

Bearbejdning Bomuld Analytiske Devices

A robust, low-cost analytical device should be user-friendly, rapid, and affordable. Such devices should also be able to operate with scarce samples and ...