Name: fabricating multi-component lipid nanotube networks using the gliding kinesin motility assay
Uploaded: 2021-07-26T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fabricating Multi-Component Lipid Nanotube Networks Using the Gliding Kinesin Motility Assay at JoVE.com

Ce travail a été soutenu par le Département de l’énergie des États-Unis, Office of Basic Energy Sciences, Division of Materials Sciences and Engineering (BES-MSE). La synthèse de la kinésine et la microscopie à fluorescence ont été réalisées dans le cadre d’un projet utilisateur (ZIM) au Center for Integrated Nanotechnologies, une installation d’utilisateurs du Bureau des utilisateurs du Bureau des sciences du Bureau des sciences du Département de la science des États-Unis ( DOE).

1. Préparation de solutions de microtubules mères
ATTENTION : Des lunettes de sécurité, des gants et une blouse de laboratoire doivent toujours être portés tout au long du protocole.
<ol><li>Préparer 5x tampon BRB80 : ajouter 24,19 g de PIPES (pipérazine-N,N′-bis[acide 2-éthanesulfonique]) et 0,38 g d’EGTA (éthylène glycol-bis[β-aminoéthyléther]-N,N,N′,N′-tétraacétique) dans une bouteille en verre de 1 L. Ajouter 1 mL de 1 M MgCl2 et ajuster le pH à 6,9 av...

<ol>
	<li>Bouxsein, N. F., Carroll-Portillo, A., Bachand, M., Sasaki, D. Y., Bachand, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+continuous+network+of+lipid+nanotubes+fabricated+from+the+gliding+motility+of+kinesin+powered+microtubule+filaments.">A continuous network of lipid nanotubes fabricated from the gliding motility of kinesin powered microtubule filaments.</a> Langmuir. 29 (9), 2992-2999 (2013).</li><li>Paxton, W. F., Bouxsein, N. F., Henderson, I. M., Gomez, A., Bachand, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+assembly+of+polymer+nanotube+networks+via+kinesin+powered+microtubule+filaments.">Dynamic assembly of polymer nanotube networks via kinesin powered microtubule filaments.</a> Nanoscale. 7 (25), 10998-11004 (2015).</li><li>Leduc, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperative+extraction+of+membrane+nanotubes+by+molecular+motors.">Cooperative extraction of membrane nanotubes by molecular motors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (49), 17096-17101 (2004).</li><li>Lippincott-Schwartz, J., Roberts, T. H., Hirschberg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secretory+protein+trafficking+and+organelle+dynamics+in+living+cells.">Secretory protein trafficking and organelle dynamics in living cells.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 16, 557-589 (2000).</li><li>Belting, M., Wittrup, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanotubes,+exosomes,+and+nucleic+acid-binding+peptides+provide+novel+mechanisms+of+intercellular+communication+in+eukaryotic+cells:+implications+in+health+and+disease.">Nanotubes, exosomes, and nucleic acid-binding peptides provide novel mechanisms of intercellular communication in eukaryotic cells: implications in health and disease.</a> Journal of Cell Biology. 183 (7), 1187-1191 (2008).</li><li>Rustom, A., Saffrich, R., Markovic, I., Walther, P., Gerdes, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanotubular+highways+for+intercellular+organelle+transport.">Nanotubular highways for intercellular organelle transport.</a> Science. 303 (5660), 1007-1010 (2004).</li><li>Onfelt, B., Nedvetzki, S., Yanagi, K., Davis, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutting+edge:+Membrane+nanotubes+connect+immune+cells.">Cutting edge: Membrane nanotubes connect immune cells.</a> Journal of Immunology. 173 (3), 1511-1513 (2004).</li><li>Sciaky, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Golgi+tubule+traffic+and+the+effects+of+brefeldin+A+visualized+in+living+cells.">Golgi tubule traffic and the effects of brefeldin A visualized in living cells.</a> J Cell Biol. 139 (5), 1137-1155 (1997).</li><li>Sprong, H., van der Sluijs, P., van Meer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+proteins+move+lipids+and+lipids+move+proteins.">How proteins move lipids and lipids move proteins.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2 (7), 504-513 (2001).</li><li>Keenan, T. W., Morre, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospholipid+class+and+fatty+acid+composition+of+golgi+apparatus+isolated+from+rat+liver+and+comparison+with+other+cell+fractions.">Phospholipid class and fatty acid composition of golgi apparatus isolated from rat liver and comparison with other cell fractions.</a> Biochemistry. 9 (1), 19-25 (1970).</li><li>Imam, Z. I., Bachand, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicomponent+and+Multiphase+Lipid+Nanotubes+Formed+by+Gliding+Microtubule-Kinesin+Motility+and+Phase-Separated+Giant+Unilamellar+Vesicles.">Multicomponent and Multiphase Lipid Nanotubes Formed by Gliding Microtubule-Kinesin Motility and Phase-Separated Giant Unilamellar Vesicles.</a> Langmuir. 35 (49), 16281-16289 (2019).</li><li>Wesolowska, O., Michalak, K., Maniewska, J., Hendrich, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Giant+unilamellar+vesicles+-+a+perfect+tool+to+visualize+phase+separation+and+lipid+rafts+in+model+systems.">Giant unilamellar vesicles - a perfect tool to visualize phase separation and lipid rafts in model systems.</a> Acta Biochimica Polonica. 56 (1), 33-39 (2009).</li><li>Momin, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designing+lipids+for+selective+partitioning+into+liquid+ordered+membrane+domains.">Designing lipids for selective partitioning into liquid ordered membrane domains.</a> Soft Matter. 11 (16), 3241-3250 (2015).</li><li>Fygenson, D. K., Braun, E., Libchaber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+diagram+of+microtubules.">Phase diagram of microtubules.</a> Physical Review E. 50, 1579 (1994).</li><li>Greene, A. C., Sasaki, D. Y., Bachand, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forming+Giant-sized+Polymersomes+Using+Gel-assisted+Rehydration.">Forming Giant-sized Polymersomes Using Gel-assisted Rehydration.</a> Journal of Visualized Experiments. (111), (2016).</li><li>Bachand, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+self-assembly+of+1D+microtubule+nano-arrays.">Directed self-assembly of 1D microtubule nano-arrays.</a> Royal Society of Chemistry Advances. 4 (97), 54641-54649 (2014).</li></ol>

Les réseaux LNT sont un outil utile pour les études in vitro des propriétés membranaires et du transport de biomolécules telles que les protéines transmembranaires. De plus, l’utilisation de formulations lipidiques complexes pour fabriquer des réseaux de LNT permet des études plus pertinentes sur le plan biologique. D’autres études de fabrication ont utilisé soit 1) des formulations lipidiques simples et des vésicules multilamellaires, soit 2) des techniques de motilité plus lourdes pour fabriquer des ré...

La fabrication de réseaux de nanotubes lipidiques (LNT) présente un intérêt croissant pour l’examen in vitro des structures lipidiques non équilibrées 1,2,3. Les cellules utilisent des tubules lipidiques pour le transport diffusif des protéines4 et des acides nucléiques5 ainsi que pour la communication de cellule à cellule 6,7. Le réticulum endoplasmique et l’appareil de Golgi sont particulièrement intéressants, car ces organites liés à la membrane sont les principaux emplacements pour la synthèse des lipides et des protéines ainsi que pour le transport de ces biomolécules intégrales dans le cytoplasme d’une cellule 8,9. Les membranes de ces organites sont composées de plusieurs espèces lipidiques, y compris les sphingolipides, le cholestérol et les phospholipides10 qui aident finalement à définir leur fonctionnalité. Ainsi, pour répliquer et étudier plus étroitement ces organites, les LNT in vitro doivent être fabriqués à partir de vésicules avec des formulations lipidiques de plus en plus complexes11.
Les vésicules unilamellaires géantes (GUV) sont utilisées de manière omniprésente pour étudier le comportement de la membrane lipidique, car elles peuvent être synthétisées de manière fiable avec des formulations complexes comprenant le cholestérol, la phosphatidylcholine (PC), la phosphatidyléthanolamine (PE), la phosphatidylsérine (PS) et le phosphatidylinositol (PI)12,13. Décrit ici est une méthode pour fabriquer des LNT à partir de GUV avec différentes formulations lipidiques en utilisant le test de motilité de glissement (GMA), dans lequel les LNT sont extrudés en fonction du travail effectué par les moteurs de kinésine et les filaments de microtubules agissant sur les GUV. Dans ce système, les protéines motrices de la kinésine adsorbées à une surface propulsent des microtubules biotinylés, convertissant l’énergie chimique de l’hydrolyse de l’ATP en un travail utile (en particulier, l’extrusion de LNT à partir de vésicules biotinylées)11. Le réseau LNT qui en résulte fournit une plate-forme modèle pour étudier les effets des différences dans les phases lipidiques sur les changements dans la morphologie des LNT.
En bref, les protéines motrices de la kinésine sont introduites dans une chambre d’écoulement dans une solution contenant de la caséine, ce qui permet l’adsorption des moteurs sur la surface vitrée de la chambre. Ensuite, les microtubules biotinylés dans une solution contenant de l’ATP circulent à travers la chambre et sont autorisés à se lier aux moteurs de kinésine et à commencer la motilité. Une solution de streptavidine est ensuite introduite dans la chambre et laissée se lier de manière non covalente aux microtubules. Enfin, les GUV contenant un lipide biotinylé sont introduits dans la chambre et se lient aux microtubules recouverts de streptavidine, puis extrudent les LNT pour former des réseaux à grande échelle pendant 15 à 30 minutes. Cette méthode produit de grands réseaux LNT ramifiés en utilisant des équipements de laboratoire standard et des réactifs à faible coût11.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1071px;" width="1071">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:65px;width:328px;">100x/1.4 Numerical Aperture Oil Immersion Objective</td>
			<td style="width:104px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;">1-U2B836</td>
			<td style="width:520px;">Olympus UPlanSApo 100x/1.40 Oil Objective Infinity Corrected, RMS Thread 
			Working Distance 0.12mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">3.0 ND Filter</td>
			<td style="width:104px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Neutral Density Filter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">AMP-PNP</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A2647</td>
			<td>(&#946;,&#947;-imidoadenosine 5&#8242;-triphosphate)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">ATP</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A7699</td>
			<td>Adenosine 5&#39;-triphosphate disodium salt hydrate BioXtra</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:328px;">Brightline Pinkel DA/FI/TR/Cy5/Cy7-5X-A000 filter set</td>
			<td style="width:104px;">Semrock</td>
			<td style="width:119px;">LED-DA/FI/TR/Cy5/Cy7-5X-A-000</td>
			<td style="width:520px;"> 
			BrightLine Pinkel filter set, optimized for DAPI, FITC, TRITC, Cy5 &#38; Cy7 and other like fluorophores, illuminated with LED-based light sources</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Casein</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">22090</td>
			<td>Casein hydrolysate for microbiology</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Catalase</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C9322</td>
			<td>Catalase from Bovine Liver</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Chloroform</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">288306</td>
			<td>Chloroform anhydrous contains 0.5-1.0% ethanol as stabilizer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Cholesterol</td>
			<td style="width:104px;">Avanti</td>
			<td style="width:119px;">700000P</td>
			<td>cholesterol (ovine wool, &#62;98%) (powder)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:328px;">D-Glucose</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G7021</td>
			<td style="width:520px;">D-(+)-Glucose powder, BioReagent, suitable for cell culture, suitable for insect cell culture, suitable for plant cell culture, &#8805;99.5%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">DOPC</td>
			<td style="width:104px;">Avanti</td>
			<td style="width:119px;">850375C</td>
			<td>1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (in chloroform)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">DOPE-Biotin</td>
			<td style="width:104px;">Avanti</td>
			<td style="width:119px;">870282C</td>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(biotinyl) (sodium salt)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">DPPC</td>
			<td style="width:104px;">Avanti</td>
			<td style="width:119px;">850355P</td>
			<td>1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (powder)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">DPPE-Biotin</td>
			<td style="width:104px;">Avanti</td>
			<td style="width:119px;">870285P</td>
			<td>1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(biotinyl) (sodium salt)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">DTT</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">43816</td>
			<td>DL-Dithiothreitol solution 1 M</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:328px;">EGTA</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">E4378</td>
			<td style="width:520px;">EGTA, Egtazic acid, Ethylene-bis(oxyethylenenitrilo)tetraacetic acid, Glycol ether diamine tetraacetic acid</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:328px;">Glucose Oxidase</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G6125</td>
			<td style="width:520px;">Glucose Oxidase from Aspergillus niger 
			Type II, &#8805;10,000 units/g solid (without added oxygen)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Glycerol</td>
			<td style="width:104px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">G33</td>
			<td>Glycerol (Certified ACS), Fisher Chemical</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">GTP</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G8877</td>
			<td>Guanosine 5&#8242;-triphosphate sodium salt hydrate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">IX-81 Olympus Microscope</td>
			<td style="width:104px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>IX81 Inverted Microscope from Olympus</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">KOH</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">1050121000</td>
			<td>Potassium Hydroxide</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Magnesium Chloride</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M1028</td>
			<td>1.00 M magnesium chloride solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Orca Flash 4.0 Digital Camera</td>
			<td style="width:104px;">Hamamatsu</td>
			<td style="width:119px;">C13440-20CU</td>
			<td>ORCA-Flash 4.0 V3 Digital CMOS camera</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Oregon Green-DHPE</td>
			<td style="width:104px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">O12650</td>
			<td>Oregon Green 488 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Paclitaxel</td>
			<td style="width:104px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">P3456</td>
			<td>Paclitaxel (Taxol Equivalent) - for use in research only</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:328px;">PIPES</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P6757</td>
			<td style="width:520px;">1,4-Piperazinediethanesulfonic acid, Piperazine-1,4-bis(2-ethanesulfonic acid), Piperazine-N,N&#8242;-bis(2-ethanesulfonic acid)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:328px;">Texas Red-DHPE</td>
			<td style="width:104px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">T1395MP</td>
			<td style="width:520px;">Texas Red 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine, 
			Triethylammonium Salt</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Trolox</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">238813</td>
			<td>(&#177;)-6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Tubulin, Biotin</td>
			<td style="width:104px;">Cytoskeleton</td>
			<td style="width:119px;">T333P</td>
			<td>Tubulin protein (biotin) porcine brain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Tubulin, Hy-Lite 488</td>
			<td style="width:104px;">Cytoskeleton</td>
			<td style="width:119px;">TL488M</td>
			<td>Tubulin protein (fluorescent HiLyte 488) porcine brain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Tubulin, Unlabeled</td>
			<td style="width:104px;">Cytoskeleton</td>
			<td style="width:119px;">T240</td>
			<td>Tubulin protein porcine brain</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fabricating multi-component lipid nanotube networks using the gliding kinesin motility assay

Les réseaux de nanotubes lipidiques (LNT) représentent un système modèle in vitro pour l’étude du transport moléculaire et de la biophysique des lipides en rapport avec les tubules lipidiques omniprésents présents dans les cellules eucaryotes. Cependant, les LNT in vivo sont des structures hautement non équilibrées qui nécessitent l’assemblage, la maintenance et la réorganisation de l’énergie chimique et des moteurs moléculaires. De plus, la composition des LNT in vivo est complexe, comprenant plusieurs espèces de lipides différentes. Les méthodes typiques d’extrusion des LNT sont à la fois chronophages et laborieuses, et nécessitent une pince optique, des microbilles et des micropipettes pour extraire de force des nanotubes de vésicules lipidiques géantes. Présenté ici est un protocole pour le test de motilité de glissement (GMA), dans lequel des réseaux LNT à grande échelle sont rapidement générés à partir de vésicules unilamellaires géantes (GUV) en utilisant la motilité de microtubule alimentée par la kinésine. En utilisant cette méthode, les réseaux LNT sont formés à partir d’un large éventail de formulations lipidiques qui imitent la complexité des LNT biologiques, ce qui les rend de plus en plus utiles pour les études in vitro de la biophysique des lipides et du transport associé à la membrane. De plus, cette méthode est capable de produire de manière fiable des réseaux LNT en peu de temps (<30 min) à l’aide d’équipements de laboratoire couramment utilisés. Les caractéristiques du réseau LNT telles que la longueur, la largeur et le partitionnement lipidique sont également accordables en modifiant la composition lipidique des GUV utilisés pour fabriquer les réseaux.

Les réseaux LNT (Figure 4) ont été fabriqués à l’aide du protocole décrit, qui utilise le travail effectué par le transport de kinésine de microtubules pour extruder des LNT à partir de GUV. En bref, les GUV ont été préparés à l’aide d’une réhydratation en gel d’agarose à l’aide d’une solution de saccharose, et les microtubules ont été polymérisés dans une solution GPEM et stabilisés dans BRB80T. Ensuite, des moteurs à kinésine ont été introduits dans une...

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Fabricating Multi-Component Lipid Nanotube Networks Using the Gliding Kinesin Motility Assay

Ce protocole décrit un processus de fabrication de réseaux de nanotubes lipidiques en utilisant la motilité de la kinésine glissante en conjonction avec des vésicules lipidiques unilamellaires géantes.

Fabrication de réseaux de nanotubes lipidiques multi-composants à l’aide du test de motilité de la kinésine glissante

Lipid nanotube (LNT) networks represent an in vitro model system for studying molecular transport and lipid biophysics with relevance to the ubiquitous ...

Ce protocole permet la génération simple de réseaux de nanotubes lipidiques à grande échelle dans lesquels les nanotubes individuels présentent un comportement de séparation de phase similaire à celui de la vésicule parente. Le principal avantage de cette approche est que nous cooptons le travail effectué par les moteurs moléculaires pour auto-assembler les nanotubes lipidiques de manière très parallèle et sans intervention humaine. Pour mettre en place un test de motilité de glissement, fixez d’abord trois ensembles de bandes de ruban adhésif double face sur une glissière de verre espacée de cinq millimètres.Appuyez doucement sur un couvercle et ajoutez 30 microlitres d’une solution de kinésine monomolaire dans la cellule d’écoulement préparée. Après cinq minutes, ajouter 30 microlitres d’une solution de microtubules de 10 microgrammes /millilitres dans la cellule, en appuyant doucement sur une lingette de laboratoire contre l’extrémité opposée du canal d’écoulement pour faciliter l’échange de solution. Après une autre incubation de cinq minutes, lavez la cellule une à trois fois avec 50 microlitres de solution de motilité à température ambiante par lavage avant d’ajouter 30 microlitres de solution de streptavidine de 10 microgrammes / millilitres à la cellule d’écoulement.Après 10 minutes, ajouter 30 microlitres d’une solution GUV 10X pour une incubation de 30 minutes à température ambiante. Ensuite, ajoutez deux microlitres d’une solution AMP-PNP de 100 millimolaires et fermez la chambre avec du scellant. Transférez la chambre d’écoulement dans un microscope inversé pour l’imagerie et sélectionnez le jeu de filtres approprié.Utilisez un objectif d’huile 100X pour focaliser d’abord la surface du couvercle avant d’acquérir une image d’un réseau d’intérêt. Ouvrez ensuite l’image dans ImageJ et cliquez sur Image, Couleur et Composite pour superposer les couches rouge et verte afin de créer une image composite. Après l’imagerie, ouvrez l’image qui vous intéresse et cliquez sur Analyser et définir l’échelle pour calibrer l’échelle du microscope.Remplissez les pixels au facteur de conversion du micromètre et cliquez sur OK. Utilisez l’outil de ligne multipoint pour tracer les nanotubes à partir du GUV parent et maintenez enfoncés Ctrl et M pour mesurer la longueur. L’outil de traitement d’image enregistrera chaque nouvelle mesure dans la fenêtre de résultats. Lorsque tous les tubes ont été mesurés, sélectionnez Image, Ajuster et Seuil, puis cliquez sur Appliquer pour appliquer le seuil.Ensuite, dessinez un rectangle de longueur connue sur le tube souhaité. Pour mesurer la densité intégrée de la zone, cliquez sur Analyser et mesurer Pour déterminer la partition des lipides dans les nœuds de nanotubes liquides, utilisez l’outil Ligne pour tracer une ligne sur le nœud d’intérêt et mesurer l’intensité du nœud dans les canaux vert et rouge. Dans cette analyse représentative, des réseaux de nanotubes liquides ont été fabriqués pour générer des phases désordonnées et ordonnées par des liquides, ainsi que des vésicules séparées par phase.Par exemple, les vésicules synthétisées avec 45% de lipides saturés et 55% de lipides insaturés donnent des vésicules qui se séparent en phases coexistantes désordonnées liquides et solides. Si le cholestérol est inclus, cependant, la coexistence liquide-liquide peut alors être observée, créant des GUV qui se séparent en phases coexistantes d’ordre liquide et de désordre liquide. De plus, des nœuds peuvent être observés dans les mélanges séparés par phase.La chose la plus importante à retenir est de choisir le temps d’exposition approprié et le jeu de filtres ND pour pouvoir visualiser les nanotubes lipidiques sans photo-blanchiment des fluorophores. L’adaptation de la composition du comportement de phase des nanotubes lipidiques nous permet d’utiliser un système de modèle minimaliste pour commencer à étudier la biophysique des nanotubes à effet tunnel qui relient les cellules.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Plasma Lithography Surface Patterning for Creation of Cell Networks

Modélisation Plasma surface de lithographie pour la création des réseaux cellulaires

Systematic manipulation of a cell microenvironment with micro- and nanoscale resolution is often required for deciphering various cellular and molecular ...

Recherche

Bio-ingénierie

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Microtubules are cytoskeletal polymers which  play a role in cell division, cell mechanics, and intracellular transport. Each of these functions requires ...

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Lipid Bilayer Vesicle Generation Using Microfluidic Jetting

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Fabricating Complex Culture Substrates Using Robotic Microcontact Printing (R-&#181;CP) and Sequential Nucleophilic Substitution

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Fabrication de substrats de culture complexe robotisée microcontact impression (R-uCP) et substitution nucléophile séquentielle

In tissue engineering, it is desirable to exhibit spatial control of tissue morphology and cell fate in culture on the micron scale. Culture substrates ...

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Nanoparticle-based delivery vehicles have shown great promise for intracellular targeting applications, providing a mechanism to specifically alter ...

Fabricating Superhydrophobic Polymeric Materials for Biomedical Applications

Superhydrophobes fabrication de matériaux polymères pour des applications biomédicales

Superhydrophobic materials, with surfaces possessing permanent or metastable non-wetted states, are of interest for a number of biomedical and industrial ...

Fabricating Cotton Analytical Devices

Fabrication de dispositifs d&#39;analyse de coton

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