Name: fabricating multi-component lipid nanotube networks using the gliding kinesin motility assay
Uploaded: 2021-07-26T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fabricating Multi-Component Lipid Nanotube Networks Using the Gliding Kinesin Motility Assay at JoVE.com

Diese Arbeit wurde vom U.S. Department of Energy, Office of Basic Energy Sciences, Division of Materials Sciences and Engineering (BES-) unterstützt. Kinesinsynthese und Fluoreszenzmikroskopie wurden im Rahmen eines Nutzerprojekts (ZIM) am Center for Integrated Nanotechnologies durchgeführt, einer Office of Science User Facility, die für das Office of Science des US-Energieministeriums (DOE) betrieben wird.

1. Herstellung von Stamm-Mikrotubuli-Lösungen
ACHTUNG: Schutzbrille, Handschuhe und ein Laborkittel sollten während des gesamten Protokolls immer getragen werden.
<ol><li>5x BRB80-Puffer vorbereiten: 24,19 g PIPES (Piperazin-N,N′-bis[2-Ethansulfonsäure]) und 0,38 g EGTA (Ethylenglykol-bis[β-aminoethylether]-N,N,N′,N′-Tetraessigsäure) in eine 1 L Glasflasche geben. Fügen Sie 1 ml 1 M MgCl2 hinzu und stellen Sie den pH-Wert mit KOH auf 6,9 ein. Fügen Sie deionisiertes W...

<ol>
	<li>Bouxsein, N. F., Carroll-Portillo, A., Bachand, M., Sasaki, D. Y., Bachand, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+continuous+network+of+lipid+nanotubes+fabricated+from+the+gliding+motility+of+kinesin+powered+microtubule+filaments.">A continuous network of lipid nanotubes fabricated from the gliding motility of kinesin powered microtubule filaments.</a> Langmuir. 29 (9), 2992-2999 (2013).</li><li>Paxton, W. F., Bouxsein, N. F., Henderson, I. M., Gomez, A., Bachand, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+assembly+of+polymer+nanotube+networks+via+kinesin+powered+microtubule+filaments.">Dynamic assembly of polymer nanotube networks via kinesin powered microtubule filaments.</a> Nanoscale. 7 (25), 10998-11004 (2015).</li><li>Leduc, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperative+extraction+of+membrane+nanotubes+by+molecular+motors.">Cooperative extraction of membrane nanotubes by molecular motors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (49), 17096-17101 (2004).</li><li>Lippincott-Schwartz, J., Roberts, T. H., Hirschberg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secretory+protein+trafficking+and+organelle+dynamics+in+living+cells.">Secretory protein trafficking and organelle dynamics in living cells.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 16, 557-589 (2000).</li><li>Belting, M., Wittrup, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanotubes,+exosomes,+and+nucleic+acid-binding+peptides+provide+novel+mechanisms+of+intercellular+communication+in+eukaryotic+cells:+implications+in+health+and+disease.">Nanotubes, exosomes, and nucleic acid-binding peptides provide novel mechanisms of intercellular communication in eukaryotic cells: implications in health and disease.</a> Journal of Cell Biology. 183 (7), 1187-1191 (2008).</li><li>Rustom, A., Saffrich, R., Markovic, I., Walther, P., Gerdes, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanotubular+highways+for+intercellular+organelle+transport.">Nanotubular highways for intercellular organelle transport.</a> Science. 303 (5660), 1007-1010 (2004).</li><li>Onfelt, B., Nedvetzki, S., Yanagi, K., Davis, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutting+edge:+Membrane+nanotubes+connect+immune+cells.">Cutting edge: Membrane nanotubes connect immune cells.</a> Journal of Immunology. 173 (3), 1511-1513 (2004).</li><li>Sciaky, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Golgi+tubule+traffic+and+the+effects+of+brefeldin+A+visualized+in+living+cells.">Golgi tubule traffic and the effects of brefeldin A visualized in living cells.</a> J Cell Biol. 139 (5), 1137-1155 (1997).</li><li>Sprong, H., van der Sluijs, P., van Meer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+proteins+move+lipids+and+lipids+move+proteins.">How proteins move lipids and lipids move proteins.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2 (7), 504-513 (2001).</li><li>Keenan, T. W., Morre, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospholipid+class+and+fatty+acid+composition+of+golgi+apparatus+isolated+from+rat+liver+and+comparison+with+other+cell+fractions.">Phospholipid class and fatty acid composition of golgi apparatus isolated from rat liver and comparison with other cell fractions.</a> Biochemistry. 9 (1), 19-25 (1970).</li><li>Imam, Z. I., Bachand, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicomponent+and+Multiphase+Lipid+Nanotubes+Formed+by+Gliding+Microtubule-Kinesin+Motility+and+Phase-Separated+Giant+Unilamellar+Vesicles.">Multicomponent and Multiphase Lipid Nanotubes Formed by Gliding Microtubule-Kinesin Motility and Phase-Separated Giant Unilamellar Vesicles.</a> Langmuir. 35 (49), 16281-16289 (2019).</li><li>Wesolowska, O., Michalak, K., Maniewska, J., Hendrich, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Giant+unilamellar+vesicles+-+a+perfect+tool+to+visualize+phase+separation+and+lipid+rafts+in+model+systems.">Giant unilamellar vesicles - a perfect tool to visualize phase separation and lipid rafts in model systems.</a> Acta Biochimica Polonica. 56 (1), 33-39 (2009).</li><li>Momin, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designing+lipids+for+selective+partitioning+into+liquid+ordered+membrane+domains.">Designing lipids for selective partitioning into liquid ordered membrane domains.</a> Soft Matter. 11 (16), 3241-3250 (2015).</li><li>Fygenson, D. K., Braun, E., Libchaber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+diagram+of+microtubules.">Phase diagram of microtubules.</a> Physical Review E. 50, 1579 (1994).</li><li>Greene, A. C., Sasaki, D. Y., Bachand, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forming+Giant-sized+Polymersomes+Using+Gel-assisted+Rehydration.">Forming Giant-sized Polymersomes Using Gel-assisted Rehydration.</a> Journal of Visualized Experiments. (111), (2016).</li><li>Bachand, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+self-assembly+of+1D+microtubule+nano-arrays.">Directed self-assembly of 1D microtubule nano-arrays.</a> Royal Society of Chemistry Advances. 4 (97), 54641-54649 (2014).</li></ol>

LNT-Netzwerke sind ein nützliches Werkzeug für In-vitro-Studien zu Membraneigenschaften und dem Transport von Biomolekülen wie Transmembranproteinen. Darüber hinaus ermöglicht die Verwendung komplexer Lipidformulierungen zur Herstellung von LNT-Netzwerken biologisch relevantere Studien. Andere Herstellungsstudien haben entweder 1) einfache Lipidformulierungen und mehrfeldrige Vesikel oder 2) umständlichere Motilitätstechniken verwendet, um Netzwerke aus GUVs herzustellen, die aus komplexen Lipidformulierungen best...

Die Herstellung von Lipid-Nanoröhrchen-Netzwerken (LNT) ist von zunehmendem Interesse für die In-vitro-Untersuchung von Nichtgleichgewichtslipidstrukturen 1,2,3. Zellen verwenden Lipidtubuli für den diffusiven Transport der Proteine4 und Nukleinsäuren5 sowie für die Zell-zu-Zell-Kommunikation 6,7. Das endoplasmatische Retikulum und der Golgi-Apparat sind besonders interessant, da diese membrangebundenen Organellen die primären Orte für die Lipid- und Proteinsynthese sowie den Transport dieser integralen Biomoleküle innerhalb des Zytoplasmas einer Zellesind 8,9. Die Membranen dieser Organellen bestehen aus mehreren Lipidspezies, einschließlich Sphingolipiden, Cholesterin und Phospholipiden10, die letztendlich dazu beitragen, ihre Funktionalität zu definieren. Um diese Organellen genauer zu replizieren und zu untersuchen, müssen daher in vitro LNTs aus Vesikeln mit immer komplexeren Lipidformulierungen hergestellt werden11.
Riesige unilamellare Vesikel (GUVs) werden häufig zur Untersuchung des Lipidmembranverhaltens verwendet, da sie zuverlässig mit komplexen Formulierungen synthetisiert werden können, die Cholesterin, Phosphatidylcholin (PC), Phosphatidylethanolamin (PE), Phosphatidylserin (PS) und Phosphatidylinositol (PI) 12,13 enthalten. Beschrieben wird hier ein Verfahren zur Herstellung von LNTs aus GUVs mit unterschiedlichen Lipidformulierungen unter Verwendung des Gleitmotilitätsassays (GMA), bei dem LNTs auf der Grundlage der Arbeit von Kinesin-Motoren und Mikrotubuli-Filamenten, die auf GUVs wirken, extrudiert werden. In diesem System treiben Kinesin-Motorproteine, die an einer Oberfläche adsorbiert werden, biotinylierte Mikrotubuli an und wandeln chemische Energie aus der Hydrolyse von ATP in nützliche Arbeit um (insbesondere die Extrusion von LNTs aus biotinylierten Vesikeln)11. Das resultierende LNT-Netzwerk bietet eine Modellplattform, um die Auswirkungen der Unterschiede in den Lipidphasen auf Veränderungen in der LNT-Morphologie zu untersuchen.
Kurz gesagt, Kinesin-Motorproteine werden in einer caseinhaltigen Lösung in eine Strömungskammer eingebracht, die die Adsorption der Motoren auf die Glasoberfläche der Kammer ermöglicht. Als nächstes fließen biotinylierte Mikrotubuli in einer ATP-haltigen Lösung durch die Kammer und dürfen an die Kinesin-Motoren binden und die Motilität beginnen. Eine Streptavidinlösung wird dann in die Kammer eingeführt und lässt nicht-kovalent an die Mikrotubuli binden. Schließlich werden GUVs, die ein biotinyliertes Lipid enthalten, in die Kammer eingeführt und binden an die Streptavidin-beschichteten Mikrotubuli, extrudieren dann LNTs, um im Laufe von 15-30 min großräumige Netzwerke zu bilden. Diese Methode erzeugt große, verzweigte LNT-Netzwerke unter Verwendung von Standardlaborgeräten und Reagenzien zu niedrigen Kosten11.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1071px;" width="1071">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:65px;width:328px;">100x/1.4 Numerical Aperture Oil Immersion Objective</td>
			<td style="width:104px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;">1-U2B836</td>
			<td style="width:520px;">Olympus UPlanSApo 100x/1.40 Oil Objective Infinity Corrected, RMS Thread 
			Working Distance 0.12mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">3.0 ND Filter</td>
			<td style="width:104px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Neutral Density Filter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">AMP-PNP</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A2647</td>
			<td>(&#946;,&#947;-imidoadenosine 5&#8242;-triphosphate)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">ATP</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A7699</td>
			<td>Adenosine 5&#39;-triphosphate disodium salt hydrate BioXtra</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:328px;">Brightline Pinkel DA/FI/TR/Cy5/Cy7-5X-A000 filter set</td>
			<td style="width:104px;">Semrock</td>
			<td style="width:119px;">LED-DA/FI/TR/Cy5/Cy7-5X-A-000</td>
			<td style="width:520px;"> 
			BrightLine Pinkel filter set, optimized for DAPI, FITC, TRITC, Cy5 &#38; Cy7 and other like fluorophores, illuminated with LED-based light sources</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Casein</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">22090</td>
			<td>Casein hydrolysate for microbiology</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Catalase</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C9322</td>
			<td>Catalase from Bovine Liver</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Chloroform</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">288306</td>
			<td>Chloroform anhydrous contains 0.5-1.0% ethanol as stabilizer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Cholesterol</td>
			<td style="width:104px;">Avanti</td>
			<td style="width:119px;">700000P</td>
			<td>cholesterol (ovine wool, &#62;98%) (powder)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:328px;">D-Glucose</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G7021</td>
			<td style="width:520px;">D-(+)-Glucose powder, BioReagent, suitable for cell culture, suitable for insect cell culture, suitable for plant cell culture, &#8805;99.5%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">DOPC</td>
			<td style="width:104px;">Avanti</td>
			<td style="width:119px;">850375C</td>
			<td>1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (in chloroform)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">DOPE-Biotin</td>
			<td style="width:104px;">Avanti</td>
			<td style="width:119px;">870282C</td>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(biotinyl) (sodium salt)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">DPPC</td>
			<td style="width:104px;">Avanti</td>
			<td style="width:119px;">850355P</td>
			<td>1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (powder)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">DPPE-Biotin</td>
			<td style="width:104px;">Avanti</td>
			<td style="width:119px;">870285P</td>
			<td>1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(biotinyl) (sodium salt)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">DTT</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">43816</td>
			<td>DL-Dithiothreitol solution 1 M</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:328px;">EGTA</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">E4378</td>
			<td style="width:520px;">EGTA, Egtazic acid, Ethylene-bis(oxyethylenenitrilo)tetraacetic acid, Glycol ether diamine tetraacetic acid</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:328px;">Glucose Oxidase</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G6125</td>
			<td style="width:520px;">Glucose Oxidase from Aspergillus niger 
			Type II, &#8805;10,000 units/g solid (without added oxygen)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Glycerol</td>
			<td style="width:104px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">G33</td>
			<td>Glycerol (Certified ACS), Fisher Chemical</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">GTP</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G8877</td>
			<td>Guanosine 5&#8242;-triphosphate sodium salt hydrate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">IX-81 Olympus Microscope</td>
			<td style="width:104px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>IX81 Inverted Microscope from Olympus</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">KOH</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">1050121000</td>
			<td>Potassium Hydroxide</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Magnesium Chloride</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M1028</td>
			<td>1.00 M magnesium chloride solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Orca Flash 4.0 Digital Camera</td>
			<td style="width:104px;">Hamamatsu</td>
			<td style="width:119px;">C13440-20CU</td>
			<td>ORCA-Flash 4.0 V3 Digital CMOS camera</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Oregon Green-DHPE</td>
			<td style="width:104px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">O12650</td>
			<td>Oregon Green 488 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Paclitaxel</td>
			<td style="width:104px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">P3456</td>
			<td>Paclitaxel (Taxol Equivalent) - for use in research only</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:328px;">PIPES</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P6757</td>
			<td style="width:520px;">1,4-Piperazinediethanesulfonic acid, Piperazine-1,4-bis(2-ethanesulfonic acid), Piperazine-N,N&#8242;-bis(2-ethanesulfonic acid)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:328px;">Texas Red-DHPE</td>
			<td style="width:104px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">T1395MP</td>
			<td style="width:520px;">Texas Red 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine, 
			Triethylammonium Salt</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Trolox</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">238813</td>
			<td>(&#177;)-6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Tubulin, Biotin</td>
			<td style="width:104px;">Cytoskeleton</td>
			<td style="width:119px;">T333P</td>
			<td>Tubulin protein (biotin) porcine brain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Tubulin, Hy-Lite 488</td>
			<td style="width:104px;">Cytoskeleton</td>
			<td style="width:119px;">TL488M</td>
			<td>Tubulin protein (fluorescent HiLyte 488) porcine brain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Tubulin, Unlabeled</td>
			<td style="width:104px;">Cytoskeleton</td>
			<td style="width:119px;">T240</td>
			<td>Tubulin protein porcine brain</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fabricating multi-component lipid nanotube networks using the gliding kinesin motility assay

Lipid-Nanoröhrchen-Netzwerke (LNT) stellen ein In-vitro-Modellsystem zur Untersuchung des molekularen Transports und der Lipidbiophysik dar, das für die ubiquitären Lipidtubuli in eukaryotischen Zellen relevant ist. In-vivo-LNTs sind jedoch stark ungleichgewichtsgleiche Strukturen, die chemische Energie und molekulare Motoren erfordern, um zusammengesetzt, aufrechterhalten und reorganisiert zu werden. Darüber hinaus ist die Zusammensetzung von in vivo LNTs komplex und besteht aus mehreren verschiedenen Lipidspezies. Typische Methoden zum Extrudieren von LNTs sind sowohl zeit- als auch arbeitsintensiv und erfordern optische Pinzetten, Mikroperlen und Mikropipetten, um Nanoröhrchen gewaltsam aus riesigen Lipidvesikeln zu ziehen. Hier wird ein Protokoll für den Gleitmotilitätsassay (GMA) vorgestellt, bei dem großflächige LNT-Netzwerke schnell aus riesigen unilamellären Vesikeln (GUVs) unter Verwendung von Kinesin-betriebener Mikrotubuli-Motilität erzeugt werden. Mit dieser Methode werden LNT-Netzwerke aus einer Vielzahl von Lipidformulierungen gebildet, die die Komplexität biologischer LNTs nachahmen, was sie für In-vitro-Studien der Lipidbiophysik und des membranassoziierten Transports immer nützlicher macht. Darüber hinaus ist diese Methode in der Lage, LNT-Netzwerke in kurzer Zeit (<30 min) mit gängigen Laborgeräten zuverlässig herzustellen. LNT-Netzwerkeigenschaften wie Länge, Breite und Lipidpartitionierung sind ebenfalls abstimmbar, indem die Lipidzusammensetzung der GUVs, die für die Herstellung der Netzwerke verwendet werden, geändert wird.

LNT-Netzwerke (Abbildung 4) wurden unter Verwendung des beschriebenen Protokolls hergestellt, das die Arbeit des Kinesin-Transports von Mikrotubuli verwendet, um LNTs aus GUVs zu extrudieren. Kurz gesagt, GUVs wurden unter Verwendung von Agarosegel-Rehydratation unter Verwendung von Saccharoselösung hergestellt, und Mikrotubuli wurden in GPEM-Lösung polymerisiert und in BRB80T stabilisiert. Als nächstes wurden Kinesin-Motoren in eine Durchflusszelle eingeführt, die eine aktive Schicht vo...

Watch this Scientific Journal Video about Fabricating Multi-Component Lipid Nanotube Networks Using the Gliding Kinesin Motility Assay at JoVE.com

Fabricating Multi-Component Lipid Nanotube Networks Using the Gliding Kinesin Motility Assay

Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von Lipid-Nanoröhrchen-Netzwerken unter Verwendung der Gleitkinesin-Motilität in Verbindung mit riesigen unilamellären Lipidvesikeln.

Herstellung von Mehrkomponenten-Lipid-Nanoröhrchen-Netzwerken unter Verwendung des Gliding Kinesin Motility Assays

Lipid nanotube (LNT) networks represent an in vitro model system for studying molecular transport and lipid biophysics with relevance to the ubiquitous ...

Dieses Protokoll ermöglicht die einfache Erzeugung von großflächigen Lipid-Nanoröhrchen-Netzwerken, in denen die einzelnen Nanoröhrchen ein Phasentrennungsverhalten aufweisen, das dem des Elternvesikels ähnelt. Der entscheidende Vorteil dieses Ansatzes besteht darin, dass wir die Arbeit der molekularen Motoren kooptieren, um die Lipidnanoröhren hochgradig parallel und ohne menschliches Zutun selbst zusammenzusetzen. Um einen gleitenden Motilitätsassay einzurichten, befestigen Sie zunächst drei Sätze doppelseitiger Bandstreifen auf einem Glasobjektträger, der fünf Millimeter voneinander entfernt ist.Drücken Sie vorsichtig einen Deckzettel auf das Band und geben Sie 30 Mikroliter einer einmikromolaren Kinesinlösung in die vorbereitete Durchflusszelle. Fügen Sie nach fünf Minuten 30 Mikroliter einer 10-Mikrogramm / Milliliter-Mikrotubuli-Lösung in die Zelle hinzu und drücken Sie ein Labortuch vorsichtig gegen das gegenüberliegende Ende des Strömungskanals, um den Lösungsaustausch zu erleichtern. Nach einer weiteren fünfminütigen Inkubation waschen Sie die Zelle ein- bis dreimal mit 50 Mikrolitern Raumtemperatur-Motilitätslösung pro Waschgang, bevor Sie 30 Mikroliter 10-Mikrogramm / Milliliter Streptavidin-Lösung in die Durchflusszelle geben.Nach 10 Minuten 30 Mikroliter einer 10-fachen GUV-Lösung für eine 30-minütige Inkubation bei Raumtemperatur hinzufügen. Dann fügen Sie zwei Mikroliter einer 100-Millimolaren AMP-PNP-Lösung hinzu und schließen Sie die Kammer mit Dichtmittel. Übertragen Sie die Durchflusskammer zur Bildgebung auf ein inverses Mikroskop und wählen Sie den entsprechenden Filtersatz aus.Verwenden Sie ein 100X-Ölobjektiv, um zuerst die Oberfläche des Deckglases zu fokussieren, bevor Sie ein Bild eines interessanten Netzwerks aufnehmen. Öffnen Sie dann das Bild in ImageJ, und klicken Sie auf Bild, Farbe und Komposit, um die roten und grünen Kanäle zu überlagern und ein zusammengesetztes Bild zu erstellen. Öffnen Sie nach der Bildgebung das Bild von Interesse und klicken Sie auf Analysieren und Skala einstellen, um die Skala für das Mikroskop zu kalibrieren.Geben Sie die Pixel in den Mikrometer-Umrechnungsfaktor ein und klicken Sie auf OK. Verwenden Sie das Multi-Point-Line-Tool, um die Nanoröhrchen ausgehend vom übergeordneten GUV zu verfolgen, und halten Sie Control und M gedrückt, um die Länge zu messen. Das Bildverarbeitungswerkzeug speichert jede neue Messung im Ergebnisfenster. Wenn alle Röhren gemessen wurden, wählen Sie Bild, Anpassen und Schwellenwert aus, und klicken Sie auf Anwenden, um den Schwellenwert anzuwenden.Zeichnen Sie dann ein Rechteck bekannter Länge über das gewünschte Rohr. Um die integrierte Dichte des Bereichs zu messen, klicken Sie auf Analysieren und Messen Um die Lipidpartitionierung in den flüssigen Nanoröhrenknoten zu bestimmen, verwenden Sie das Linienwerkzeug, um eine Linie über den interessierenden Knoten zu zeichnen und die Knotenintensität sowohl im grünen als auch im roten Kanal zu messen. In dieser repräsentativen Analyse wurden flüssige Nanoröhrchennetzwerke hergestellt, wie gezeigt wurde, um flüssigkeitsungeordnete und geordnete Phasen sowie phasengetrennte Vesikel zu erzeugen.Zum Beispiel führen Vesikel, die mit 45% gesättigtem Lipid und 55% ungesättigtem Lipid synthetisiert werden, zu Vesikeln, die sich in koexistierende flüssigkeitsungeordnete und feste Phasen trennen. Wenn jedoch Cholesterin einbezogen wird, kann dann eine Flüssigkeit-Flüssig-Koexistenz beobachtet werden, wodurch GUVs entstehen, die sich in koexistierende flüssig geordnete und flüssigkeitsungeordnete Phasen trennen. Darüber hinaus können Knoten innerhalb der phasengetrennten Gemische beobachtet werden.Das Wichtigste, woran Sie sich erinnern sollten, ist, die geeignete Belichtungszeit und das ND-Filterset auszuwählen, um die Lipidnanoröhren visualisieren zu können, ohne die Fluorophore photobleichen zu müssen. Die Anpassung der Zusammensetzung des Phasenverhaltens der Lipidnanoröhren ermöglicht es uns, ein minimalistisches Modellsystem zu verwenden, um die Biophysik der tunnelnden Nanoröhren zu untersuchen, die Zellen verbinden.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Plasma Lithography Surface Patterning for Creation of Cell Networks

Plasma Lithography Oberflächenstrukturierung für die Erzeugung von Cell Networks

Systematic manipulation of a cell microenvironment with micro- and nanoscale resolution is often required for deciphering various cellular and molecular ...

Forschung

Biotechnik

Flexural Rigidity Measurements of Biopolymers Using Gliding Assays

Biegesteifigkeit Maße von Biopolymeren mit Gliding Assays

Microtubules are cytoskeletal polymers which  play a role in cell division, cell mechanics, and intracellular transport. Each of these functions requires ...

Generation of Shear Adhesion Map Using SynVivo Synthetic Microvascular Networks

Erzeugung von Scherhaft Karte Mit SynVivo Synthetische mikrovaskuläre Networks

Cell/particle adhesion assays are critical to understanding the biochemical interactions involved in disease pathophysiology and have important ...

Electric Cell-substrate Impedance Sensing for the Quantification of Endothelial Proliferation, Barrier Function, and Motility

Elektro-Zell-Substrat-Impedance Sensing zur Quantifizierung der endothelialen Proliferation, Barrierefunktion und Beweglichkeit

Electric Cell-substrate Impedance Sensing (ECIS) is an in vitro impedance measuring system to quantify the behavior of cells within adherent cell layers. ...

Lipid Bilayer Vesicle Generation Using Microfluidic Jetting

Lipiddoppelschicht Vesicle Erzeugung anhand Mikrofluidik Jetting

Bottom-up synthetic biology presents a novel approach for investigating and reconstituting biochemical systems and, potentially, minimal organisms. This ...

Fabricating Complex Culture Substrates Using Robotic Microcontact Printing (R-&#181;CP) and Sequential Nucleophilic Substitution

Fabricating Complex Culture Substrates Using Robotic Microcontact Printing R-Ãƒâ€šÃ‚ÂµCP and Sequential Nucleophilic Substitution

Herstellung von komplexen Kultursubstrate verwenden Robotic Mikrokontaktdrucken (R-mCP) und Sequential Nucleophile Substitution

In tissue engineering, it is desirable to exhibit spatial control of tissue morphology and cell fate in culture on the micron scale. Culture substrates ...

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer (SALB) Method

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer SALB Method

Biomembran Fabrication durch das Lösungsmittel-unterstützten Lipiddoppelschicht (SALB) Methode

In order to mimic cell membranes, the supported lipid bilayer (SLB) is an attractive platform which enables in vitro investigation of membrane-related ...

Solid Lipid Nanoparticles (SLNs) for Intracellular Targeting Applications

Solid Lipid Nanoparticles SLNs for Intracellular Targeting Applications

Feste Lipidnanopartikel (SLN) für die intrazelluläre Targeting-Anwendungen

Nanoparticle-based delivery vehicles have shown great promise for intracellular targeting applications, providing a mechanism to specifically alter ...

Fabricating Superhydrophobic Polymeric Materials for Biomedical Applications

Herstellung Superhydrophobe Polymere Materialien für biomedizinische Anwendungen

Superhydrophobic materials, with surfaces possessing permanent or metastable non-wetted states, are of interest for a number of biomedical and industrial ...

Fabricating Cotton Analytical Devices

Die Herstellung von Baumwolle Analytische Geräte

A robust, low-cost analytical device should be user-friendly, rapid, and affordable. Such devices should also be able to operate with scarce samples and ...