Name: fabricating multi-component lipid nanotube networks using the gliding kinesin motility assay
Uploaded: 2021-07-26T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fabricating Multi-Component Lipid Nanotube Networks Using the Gliding Kinesin Motility Assay at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי מחלקת האנרגיה של ארה"ב, המשרד למדעי האנרגיה הבסיסיים, המחלקה למדעי החומרים וההנדסה (BES-MSE). סינתזת קינסין ומיקרוסקופיה פלואורסצנטית בוצעו באמצעות פרויקט משתמש (ZIM) במרכז לננו-טכנולוגיה משולבת, מתקן משתמשים של משרד המדע המופעל עבור משרד המדע האמריקאי (DOE).

1. הכנת פתרונות מיקרוטובול מלאי
אזהרה: תמיד יש לענוד משקפי בטיחות, כפפות ומעיל מעבדה לאורך כל הפרוטוקול.
<ol><li>הכן 5x BRB80 buffer: הוסף 24.19 גרם של PIPES (piperazine-N,N′-bis[2-חומצה אתאנסולפונית]) ו-0.38 גרם של EGTA (אתילן גליקול-ביס[אתר β-אמינואתיל]-N,N,N,N′,N′,N′-חומצה טטראצטית) לבקבוק זכוכית בנפח 1 ליט...

<ol>
	<li>Bouxsein, N. F., Carroll-Portillo, A., Bachand, M., Sasaki, D. Y., Bachand, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+continuous+network+of+lipid+nanotubes+fabricated+from+the+gliding+motility+of+kinesin+powered+microtubule+filaments.">A continuous network of lipid nanotubes fabricated from the gliding motility of kinesin powered microtubule filaments.</a> Langmuir. 29 (9), 2992-2999 (2013).</li><li>Paxton, W. F., Bouxsein, N. F., Henderson, I. M., Gomez, A., Bachand, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+assembly+of+polymer+nanotube+networks+via+kinesin+powered+microtubule+filaments.">Dynamic assembly of polymer nanotube networks via kinesin powered microtubule filaments.</a> Nanoscale. 7 (25), 10998-11004 (2015).</li><li>Leduc, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperative+extraction+of+membrane+nanotubes+by+molecular+motors.">Cooperative extraction of membrane nanotubes by molecular motors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (49), 17096-17101 (2004).</li><li>Lippincott-Schwartz, J., Roberts, T. H., Hirschberg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secretory+protein+trafficking+and+organelle+dynamics+in+living+cells.">Secretory protein trafficking and organelle dynamics in living cells.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 16, 557-589 (2000).</li><li>Belting, M., Wittrup, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanotubes,+exosomes,+and+nucleic+acid-binding+peptides+provide+novel+mechanisms+of+intercellular+communication+in+eukaryotic+cells:+implications+in+health+and+disease.">Nanotubes, exosomes, and nucleic acid-binding peptides provide novel mechanisms of intercellular communication in eukaryotic cells: implications in health and disease.</a> Journal of Cell Biology. 183 (7), 1187-1191 (2008).</li><li>Rustom, A., Saffrich, R., Markovic, I., Walther, P., Gerdes, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanotubular+highways+for+intercellular+organelle+transport.">Nanotubular highways for intercellular organelle transport.</a> Science. 303 (5660), 1007-1010 (2004).</li><li>Onfelt, B., Nedvetzki, S., Yanagi, K., Davis, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutting+edge:+Membrane+nanotubes+connect+immune+cells.">Cutting edge: Membrane nanotubes connect immune cells.</a> Journal of Immunology. 173 (3), 1511-1513 (2004).</li><li>Sciaky, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Golgi+tubule+traffic+and+the+effects+of+brefeldin+A+visualized+in+living+cells.">Golgi tubule traffic and the effects of brefeldin A visualized in living cells.</a> J Cell Biol. 139 (5), 1137-1155 (1997).</li><li>Sprong, H., van der Sluijs, P., van Meer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+proteins+move+lipids+and+lipids+move+proteins.">How proteins move lipids and lipids move proteins.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2 (7), 504-513 (2001).</li><li>Keenan, T. W., Morre, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospholipid+class+and+fatty+acid+composition+of+golgi+apparatus+isolated+from+rat+liver+and+comparison+with+other+cell+fractions.">Phospholipid class and fatty acid composition of golgi apparatus isolated from rat liver and comparison with other cell fractions.</a> Biochemistry. 9 (1), 19-25 (1970).</li><li>Imam, Z. I., Bachand, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicomponent+and+Multiphase+Lipid+Nanotubes+Formed+by+Gliding+Microtubule-Kinesin+Motility+and+Phase-Separated+Giant+Unilamellar+Vesicles.">Multicomponent and Multiphase Lipid Nanotubes Formed by Gliding Microtubule-Kinesin Motility and Phase-Separated Giant Unilamellar Vesicles.</a> Langmuir. 35 (49), 16281-16289 (2019).</li><li>Wesolowska, O., Michalak, K., Maniewska, J., Hendrich, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Giant+unilamellar+vesicles+-+a+perfect+tool+to+visualize+phase+separation+and+lipid+rafts+in+model+systems.">Giant unilamellar vesicles - a perfect tool to visualize phase separation and lipid rafts in model systems.</a> Acta Biochimica Polonica. 56 (1), 33-39 (2009).</li><li>Momin, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designing+lipids+for+selective+partitioning+into+liquid+ordered+membrane+domains.">Designing lipids for selective partitioning into liquid ordered membrane domains.</a> Soft Matter. 11 (16), 3241-3250 (2015).</li><li>Fygenson, D. K., Braun, E., Libchaber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+diagram+of+microtubules.">Phase diagram of microtubules.</a> Physical Review E. 50, 1579 (1994).</li><li>Greene, A. C., Sasaki, D. Y., Bachand, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forming+Giant-sized+Polymersomes+Using+Gel-assisted+Rehydration.">Forming Giant-sized Polymersomes Using Gel-assisted Rehydration.</a> Journal of Visualized Experiments. (111), (2016).</li><li>Bachand, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+self-assembly+of+1D+microtubule+nano-arrays.">Directed self-assembly of 1D microtubule nano-arrays.</a> Royal Society of Chemistry Advances. 4 (97), 54641-54649 (2014).</li></ol>

רשתות LNT הן כלי שימושי למחקרים במבחנה לתכונות הממברנה ולהובלת ביומולקולות כגון חלבוני טרנס-ממברנה. יתר על כן, שימוש בפורמולות ליפידים מורכבות לייצור רשתות LNT מאפשר מחקרים רלוונטיים יותר מבחינה ביולוגית. מחקרי ייצור אחרים השתמשו ב-1) ניסוחי ליפידים פשוטים ושלפוחיות מולטי-למלר או 2) טכניקות ?...

ייצור רשתות ננו-צינוריות שומנים (LNT) מעורר עניין גובר בבדיקה חוץ גופית של מבנים שומניים ללא שיווי משקל 1,2,3. תאים משתמשים בצינוריות ליפידים להובלה מפוזרת של חלבונים4 וחומצות גרעין5, כמו גם תקשורת בין תאים לתא 6,7. הרשתית האנדופלסמית ומנגנון גולג'י מעניינים במיוחד, שכן אברונים אלה הקשורים לממברנה הם המיקומים העיקריים לסינתזת שומנים וחלבונים, כמו גם להובלה של ביומולקולות אינטגרליות אלה בתוך הציטופלסמה של תא 8,9. הממברנות של אברונים אלה מורכבות ממיני שומנים מרובים כולל ספינגולפידים, כולסטרול ופוספוליפידים10 שבסופו של דבר עוזרים להגדיר את הפונקציונליות שלהם. לפיכך, כדי לשכפל ולחקור בצורה הדוקה יותר את האברונים הללו, יש לייצר LNTs במבחנה משלפוחית עם נוסחאות שומנים מורכבות יותר ויותר11.
בועיות חד-שכבתיות ענקיות (GUVs) משמשות באופן נרחב לחקר התנהגות קרום השומנים מכיוון שניתן לסנתז אותן באופן אמין עם פורמולציות מורכבות הכוללות כולסטרול, פוספטידילכולין (PC), פוספטידיל-ילתנולמין (PE), פוספטידיל-סרין (PS) ופוספטידילינוזיטול (PI)12,13. מתוארת כאן שיטה לייצור LNTs מ- GUVs עם נוסחאות ליפידים משתנות באמצעות בדיקת תנועתיות גלישה (GMA), שבה LNTs מובלטים על סמך העבודה המבוצעת על ידי מנועי קינזין וחוטים מיקרוטובולים הפועלים על גבי GUVs. במערכת זו, חלבונים מוטוריים של קינסין נספגים אל פני השטח מניעים מיקרוטובולים שעברו ביוטינילציה, וממירים אנרגיה כימית מהידרוליזה של ATP לעבודה שימושית (במיוחד, שחול של LNTs משלפוחיות ביוטינילציה)11. רשת LNT המתקבלת מספקת פלטפורמת מודל לחקר ההשפעות של ההבדלים בשלבי השומנים על שינויים במורפולוגיה של LNT.
בקצרה, חלבונים מוטוריים של קינזין מוכנסים לתא זרימה בתמיסה המכילה קזאין, המאפשרת את ספיגת המנועים על פני הזכוכית של התא. לאחר מכן, מיקרוטובולים שעברו ביוטינילציה בתמיסה המכילה ATP זורמים דרך התא ומותר להם להיקשר למנועי הקינזין ולהתחיל בתנועתיות. לאחר מכן מכניסים תמיסת סטרפטווידין לתוך התא ומאפשרים לה להיקשר באופן לא קוולנטי למיקרוטובולים. לבסוף, GUVs המכילים שומנים ביולוגיים מוכנסים לחדר ונקשרים למיקרוטובולים המצופה סטרפטווידין, ולאחר מכן מוציאים LNTs ליצירת רשתות בקנה מידה גדול במהלך 15-30 דקות. שיטה זו מייצרת רשתות LNT גדולות ומסועפות באמצעות ציוד מעבדה וריאגנטים סטנדרטיים בעלות נמוכה11.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1071px;" width="1071">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:65px;width:328px;">100x/1.4 Numerical Aperture Oil Immersion Objective</td>
			<td style="width:104px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;">1-U2B836</td>
			<td style="width:520px;">Olympus UPlanSApo 100x/1.40 Oil Objective Infinity Corrected, RMS Thread 
			Working Distance 0.12mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">3.0 ND Filter</td>
			<td style="width:104px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Neutral Density Filter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">AMP-PNP</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A2647</td>
			<td>(&#946;,&#947;-imidoadenosine 5&#8242;-triphosphate)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">ATP</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A7699</td>
			<td>Adenosine 5&#39;-triphosphate disodium salt hydrate BioXtra</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:328px;">Brightline Pinkel DA/FI/TR/Cy5/Cy7-5X-A000 filter set</td>
			<td style="width:104px;">Semrock</td>
			<td style="width:119px;">LED-DA/FI/TR/Cy5/Cy7-5X-A-000</td>
			<td style="width:520px;"> 
			BrightLine Pinkel filter set, optimized for DAPI, FITC, TRITC, Cy5 &#38; Cy7 and other like fluorophores, illuminated with LED-based light sources</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Casein</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">22090</td>
			<td>Casein hydrolysate for microbiology</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Catalase</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C9322</td>
			<td>Catalase from Bovine Liver</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Chloroform</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">288306</td>
			<td>Chloroform anhydrous contains 0.5-1.0% ethanol as stabilizer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Cholesterol</td>
			<td style="width:104px;">Avanti</td>
			<td style="width:119px;">700000P</td>
			<td>cholesterol (ovine wool, &#62;98%) (powder)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:328px;">D-Glucose</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G7021</td>
			<td style="width:520px;">D-(+)-Glucose powder, BioReagent, suitable for cell culture, suitable for insect cell culture, suitable for plant cell culture, &#8805;99.5%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">DOPC</td>
			<td style="width:104px;">Avanti</td>
			<td style="width:119px;">850375C</td>
			<td>1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (in chloroform)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">DOPE-Biotin</td>
			<td style="width:104px;">Avanti</td>
			<td style="width:119px;">870282C</td>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(biotinyl) (sodium salt)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">DPPC</td>
			<td style="width:104px;">Avanti</td>
			<td style="width:119px;">850355P</td>
			<td>1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (powder)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">DPPE-Biotin</td>
			<td style="width:104px;">Avanti</td>
			<td style="width:119px;">870285P</td>
			<td>1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(biotinyl) (sodium salt)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">DTT</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">43816</td>
			<td>DL-Dithiothreitol solution 1 M</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:328px;">EGTA</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">E4378</td>
			<td style="width:520px;">EGTA, Egtazic acid, Ethylene-bis(oxyethylenenitrilo)tetraacetic acid, Glycol ether diamine tetraacetic acid</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:328px;">Glucose Oxidase</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G6125</td>
			<td style="width:520px;">Glucose Oxidase from Aspergillus niger 
			Type II, &#8805;10,000 units/g solid (without added oxygen)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Glycerol</td>
			<td style="width:104px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">G33</td>
			<td>Glycerol (Certified ACS), Fisher Chemical</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">GTP</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G8877</td>
			<td>Guanosine 5&#8242;-triphosphate sodium salt hydrate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">IX-81 Olympus Microscope</td>
			<td style="width:104px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>IX81 Inverted Microscope from Olympus</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">KOH</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">1050121000</td>
			<td>Potassium Hydroxide</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Magnesium Chloride</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M1028</td>
			<td>1.00 M magnesium chloride solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Orca Flash 4.0 Digital Camera</td>
			<td style="width:104px;">Hamamatsu</td>
			<td style="width:119px;">C13440-20CU</td>
			<td>ORCA-Flash 4.0 V3 Digital CMOS camera</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Oregon Green-DHPE</td>
			<td style="width:104px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">O12650</td>
			<td>Oregon Green 488 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Paclitaxel</td>
			<td style="width:104px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">P3456</td>
			<td>Paclitaxel (Taxol Equivalent) - for use in research only</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:328px;">PIPES</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P6757</td>
			<td style="width:520px;">1,4-Piperazinediethanesulfonic acid, Piperazine-1,4-bis(2-ethanesulfonic acid), Piperazine-N,N&#8242;-bis(2-ethanesulfonic acid)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:328px;">Texas Red-DHPE</td>
			<td style="width:104px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">T1395MP</td>
			<td style="width:520px;">Texas Red 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine, 
			Triethylammonium Salt</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Trolox</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">238813</td>
			<td>(&#177;)-6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Tubulin, Biotin</td>
			<td style="width:104px;">Cytoskeleton</td>
			<td style="width:119px;">T333P</td>
			<td>Tubulin protein (biotin) porcine brain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Tubulin, Hy-Lite 488</td>
			<td style="width:104px;">Cytoskeleton</td>
			<td style="width:119px;">TL488M</td>
			<td>Tubulin protein (fluorescent HiLyte 488) porcine brain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Tubulin, Unlabeled</td>
			<td style="width:104px;">Cytoskeleton</td>
			<td style="width:119px;">T240</td>
			<td>Tubulin protein porcine brain</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fabricating multi-component lipid nanotube networks using the gliding kinesin motility assay

רשתות ננו-צינוריות ליפידים (LNT) מייצגות מערכת מודלים חוץ גופית לחקר הובלה מולקולרית וביופיסיקה של שומנים עם רלוונטיות לצינוריות השומנים הנמצאות בכל מקום בתאים אאוקריוטים. עם זאת, LNTs in vivo הם מבנים מאוד לא שיווי משקל הדורשים אנרגיה כימית ומנועים מולקולריים כדי להרכיב, לתחזק ולארגן מחדש. יתר על כן, ההרכב של LNTs in vivo הוא מורכב, ומורכב ממספר מיני שומנים שונים. שיטות אופייניות להבלטת LNTs הן עתירות זמן ועבודה, והן דורשות פינצטה אופטית, מיקרובים ומיקרופיפטים כדי למשוך בכוח ננו-צינוריות מבועיות ליפידים ענקיות. מוצג כאן פרוטוקול לבדיקת תנועתיות הגלישה (GMA), שבה רשתות LNT בקנה מידה גדול נוצרות במהירות מבועיות ענק חד-שכבתיות (GUVs) באמצעות תנועתיות מיקרוטובולים המופעלות על ידי קינזין. באמצעות שיטה זו, רשתות LNT נוצרות ממגוון רחב של פורמולציות שומנים המחקות את המורכבות של LNTs ביולוגיים, מה שהופך אותן לשימושיות יותר ויותר למחקרים חוץ גופיים של ביופיסיקה של שומנים ותחבורה הקשורה לממברנה. בנוסף, שיטה זו מסוגלת לייצר באופן אמין רשתות LNT בזמן קצר (<30 דקות) באמצעות ציוד מעבדה נפוץ. מאפייני רשת LNT כגון אורך, רוחב ומחיצות שומנים ניתנים גם לכוונון על ידי שינוי הרכב השומנים של ה- GUVs המשמשים לייצור הרשתות.

רשתות LNT (איור 4) יוצרו באמצעות הפרוטוקול המתואר, המשתמש בעבודה המבוצעת על ידי הובלת קינסין של מיקרוטובולים כדי להוציא LNTs מ-GUVs. בקצרה, GUVs הוכנו באמצעות התייבשות ג'ל אגרוז באמצעות תמיסת סוכרוז, ומיקרוטובולים פוזלו בתמיסת GPEM והתייצבו ב- BRB80T. לאחר מכן, מנועי קינסין הוכנסו לתא זר?...

Watch this Scientific Journal Video about Fabricating Multi-Component Lipid Nanotube Networks Using the Gliding Kinesin Motility Assay at JoVE.com

Fabricating Multi-Component Lipid Nanotube Networks Using the Gliding Kinesin Motility Assay

פרוטוקול זה מתאר תהליך לייצור רשתות ננו-צינוריות ליפידים באמצעות תנועתיות קינזין גולשת בשילוב עם שלפוחיות ליפידים חד-שכבתיות ענקיות.

ייצור רשתות ננו-צינוריות ליפידים מרובות רכיבים באמצעות בדיקת תנועתיות Kinesin Gliding

Lipid nanotube (LNT) networks represent an in vitro model system for studying molecular transport and lipid biophysics with relevance to the ubiquitous ...

פרוטוקול זה מאפשר יצירה פשוטה של רשתות ננו-צינוריות ליפידיות בקנה מידה גדול שבהן הננו-צינוריות הבודדות מציגות התנהגות הפרדת פאזות דומה לזו של שלפוחית האב. היתרון העיקרי של גישה זו הוא שאנו בוחרים במשותף את העבודה שנעשתה על ידי המנועים המולקולריים כדי להרכיב את עצמן של הננו-צינוריות השומנים באופן מקביל ביותר וללא התערבות אנושית. כדי להגדיר בדיקת תנועתיות גלישה, ראשית, הצמידו שלושה סטים של רצועות סרט דו-צדדיות על מגלשת זכוכית במרחק של חמישה מילימטרים זה מזה.לחץ בעדינות על החלקת כיסוי על הקלטת והוסף 30 מיקרוליטרים של תמיסת קינסין של מיקרומולר אחד לתוך תא הזרימה המוכן. לאחר חמש דקות, הוסיפו 30 מיקרוליטרים של תמיסת מיקרוטובול של 10 מיקרוגרם/מיליליטר לתוך התא, תוך לחיצה על מגבון מעבדה בעדינות כנגד הקצה הנגדי של תעלת הזרימה כדי להקל על חילופי התמיסות. לאחר דגירה נוספת של חמש דקות, שטפו את התא פעם עד שלוש פעמים עם 50 מיקרוליטרים של תמיסת תנועתיות בטמפרטורת החדר לכל שטיפה לפני שתוסיפו 30 מיקרוליטרים של תמיסת סטרפטווידין 10 מיקרוגרם/מיליליטר לתא הזרימה.לאחר 10 דקות, הוסיפו 30 מיקרוליטרים של תמיסת GUV 10X לדגירה של 30 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הוסיפו שני מיקרוליטרים של תמיסת AMP-PNP של 100 מילימולרי וסגרו את התא עם חומר איטום. העבר את תא הזרימה למיקרוסקופ הפוך להדמיה ובחר את ערכת המסנן המתאימה.השתמש במטרת שמן 100X כדי למקד תחילה את פני השטח של החלקת הכיסוי לפני שתרכוש תמונה של רשת מעניינת. לאחר מכן פתחו את התמונה ב-ImageJ ולחצו על 'תמונה', 'צבע' ו'קומפוזיט' כדי לכסות את הערוצים האדומים והירוקים כדי ליצור תמונה מורכבת. לאחר ההדמיה, פתח את התמונה המעניינת ולחץ על נתח והגדר קנה מידה כדי לכייל את קנה המידה עבור המיקרוסקופ.מלא את הפיקסלים למקדם ההמרה של המיקרומטר ולחץ על אישור. השתמש בכלי הקו הרב-נקודתי כדי לעקוב אחר הננו-צינוריות החל מ-GUV האב ולחץ והחזק את Control ו-M כדי למדוד את האורך. כלי עיבוד התמונה ישמור כל מדידה חדשה בחלון התוצאות. לאחר שנמדדו כל הצינורות, בחר תמונה, כוונן וסף ולחץ על החל כדי להחיל את הסף.לאחר מכן, ציירו מלבן באורך ידוע מעל הצינור הרצוי. כדי למדוד את הצפיפות המשולבת של האזור, לחץ על נתח ומדוד כדי לקבוע את חלוקת השומנים בצמתי הננו-צינוריות הנוזליות, השתמש בכלי הקו כדי לצייר קו מעל צומת העניין ולמדוד את עוצמת הצומת הן בערוצים הירוקים והן בערוצים האדומים. בניתוח מייצג זה, רשתות ננו-צינוריות נוזליות יוצרו כפי שהוכח כי הן יוצרות פאזות עם הפרעות נוזלים וסודרות, כמו גם שלפוחיות מופרדות פאזה.לדוגמה, שלפוחיות המסונתזות עם 45% שומנים רוויים ו-55% שומנים בלתי רוויים גורמות לשלפוחיות המפרידות לפאזות דו-קיום של הפרעות נוזליות ומוצקות. עם זאת, אם הכולסטרול נכלל, ניתן להבחין בדו-קיום נוזלי-נוזלי, מה שיוצר GUVs המפרידים לשלבים דו-קיום של סידור נוזלי והפרעות נוזליות. יתר על כן, צמתים ניתן לראות בתוך תערובות מופרדות פאזה.הדבר החשוב ביותר שיש לזכור הוא לבחור את זמן החשיפה המתאים ואת סט המסנן ND כדי להיות מסוגל לדמיין את הננו-צינוריות השומנים מבלי להלבין את הפלואורופורים. התאמת הרכב התנהגות הפאזה של הננו-צינוריות השומנים מאפשרת לנו להשתמש במערכת מודל מינימליסטית כדי להתחיל לחקור את הביופיזיקה של הננו-צינוריות המתעלות המחברות תאים.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Plasma Lithography Surface Patterning for Creation of Cell Networks

Surface פלזמה ליתוגרפיה דפוסים של יצירת רשתות Cell

Systematic manipulation of a cell microenvironment with micro- and nanoscale resolution is often required for deciphering various cellular and molecular ...

Flexural Rigidity Measurements of Biopolymers Using Gliding Assays

מדידות קשיחות כפיפה של Biopolymers שימוש במבחני דאייה

Microtubules are cytoskeletal polymers which  play a role in cell division, cell mechanics, and intracellular transport. Each of these functions requires ...

Generation of Shear Adhesion Map Using SynVivo Synthetic Microvascular Networks

דור של שאר הידבקות מפה באמצעות רשתות כלי הדם סינטטיים SynVivo

Cell/particle adhesion assays are critical to understanding the biochemical interactions involved in disease pathophysiology and have important ...

Electric Cell-substrate Impedance Sensing for the Quantification of Endothelial Proliferation, Barrier Function, and Motility

חשמל Cell-מצע עכבת חישה לכימות של האנדותל למניעת הפצת נשק, תפקוד מחסום, ותנועתיות

Electric Cell-substrate Impedance Sensing (ECIS) is an in vitro impedance measuring system to quantify the behavior of cells within adherent cell layers. ...

Lipid Bilayer Vesicle Generation Using Microfluidic Jetting

השומנים bilayer שלפוחיות דור שימוש Microfluidic jetting

Bottom-up synthetic biology presents a novel approach for investigating and reconstituting biochemical systems and, potentially, minimal organisms. This ...

Fabricating Complex Culture Substrates Using Robotic Microcontact Printing (R-&#181;CP) and Sequential Nucleophilic Substitution

Fabricating Complex Culture Substrates Using Robotic Microcontact Printing R-Ãƒâ€šÃ‚ÂµCP and Sequential Nucleophilic Substitution

בודה מצעים מורכבים תרבות באמצעות רובוטית microcontact הדפסה (R-μCP) והתמר נוקלאופילית סדרתית

In tissue engineering, it is desirable to exhibit spatial control of tissue morphology and cell fate in culture on the micron scale. Culture substrates ...

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer (SALB) Method

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer SALB Method

ייצור Biomembrane ידי השומנים bilayer (SALB) השיטה בסיוע מרכך

In order to mimic cell membranes, the supported lipid bilayer (SLB) is an attractive platform which enables in vitro investigation of membrane-related ...

Solid Lipid Nanoparticles (SLNs) for Intracellular Targeting Applications

Solid Lipid Nanoparticles SLNs for Intracellular Targeting Applications

מוצקים שומנים חלקיקים (SLNs) אפליקציות לתאיות מיקוד

Nanoparticle-based delivery vehicles have shown great promise for intracellular targeting applications, providing a mechanism to specifically alter ...

Fabricating Superhydrophobic Polymeric Materials for Biomedical Applications

בודה חומרים פולימריים עבור יישומים ביו-הידרופובי

Superhydrophobic materials, with surfaces possessing permanent or metastable non-wetted states, are of interest for a number of biomedical and industrial ...

Fabricating Cotton Analytical Devices

בודה כותנה התקנים אנליטית

A robust, low-cost analytical device should be user-friendly, rapid, and affordable. Such devices should also be able to operate with scarce samples and ...