Name: fabricating multi-component lipid nanotube networks using the gliding kinesin motility assay
Uploaded: 2021-07-26T13:00:00
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इस काम को अमेरिकी ऊर्जा विभाग, बुनियादी ऊर्जा विज्ञान कार्यालय, सामग्री विज्ञान और इंजीनियरिंग विभाग (बीईएस-एमएसई) द्वारा समर्थित किया गया था। किन्सिन संश्लेषण और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी सेंटर फॉर इंटीग्रेटेड नैनोटेक्नोलॉजीज में एक उपयोगकर्ता परियोजना (जेडआईएम) के माध्यम से किया गया था, जो अमेरिकी ऊर्जा विभाग (डीओई) विज्ञान कार्यालय के लिए संचालित विज्ञान उपयोगकर्ता सुविधा का एक कार्यालय है।

1. स्टॉक सूक्ष्मनलिका समाधान की तैयारी
सावधानी: सुरक्षा चश्मे, दस्ताने और एक प्रयोगशाला कोट हमेशा प्रोटोकॉल भर में पहना जाना चाहिए।
<ol><li>5x बीआरबी 80 बफर तैयार करें: 1 एल ग्लास की बोतल में 24.19 ग्राम ...

<ol>
	<li>Bouxsein, N. F., Carroll-Portillo, A., Bachand, M., Sasaki, D. Y., Bachand, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+continuous+network+of+lipid+nanotubes+fabricated+from+the+gliding+motility+of+kinesin+powered+microtubule+filaments.">A continuous network of lipid nanotubes fabricated from the gliding motility of kinesin powered microtubule filaments.</a> Langmuir. 29 (9), 2992-2999 (2013).</li><li>Paxton, W. F., Bouxsein, N. F., Henderson, I. M., Gomez, A., Bachand, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+assembly+of+polymer+nanotube+networks+via+kinesin+powered+microtubule+filaments.">Dynamic assembly of polymer nanotube networks via kinesin powered microtubule filaments.</a> Nanoscale. 7 (25), 10998-11004 (2015).</li><li>Leduc, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperative+extraction+of+membrane+nanotubes+by+molecular+motors.">Cooperative extraction of membrane nanotubes by molecular motors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (49), 17096-17101 (2004).</li><li>Lippincott-Schwartz, J., Roberts, T. H., Hirschberg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secretory+protein+trafficking+and+organelle+dynamics+in+living+cells.">Secretory protein trafficking and organelle dynamics in living cells.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 16, 557-589 (2000).</li><li>Belting, M., Wittrup, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanotubes,+exosomes,+and+nucleic+acid-binding+peptides+provide+novel+mechanisms+of+intercellular+communication+in+eukaryotic+cells:+implications+in+health+and+disease.">Nanotubes, exosomes, and nucleic acid-binding peptides provide novel mechanisms of intercellular communication in eukaryotic cells: implications in health and disease.</a> Journal of Cell Biology. 183 (7), 1187-1191 (2008).</li><li>Rustom, A., Saffrich, R., Markovic, I., Walther, P., Gerdes, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanotubular+highways+for+intercellular+organelle+transport.">Nanotubular highways for intercellular organelle transport.</a> Science. 303 (5660), 1007-1010 (2004).</li><li>Onfelt, B., Nedvetzki, S., Yanagi, K., Davis, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutting+edge:+Membrane+nanotubes+connect+immune+cells.">Cutting edge: Membrane nanotubes connect immune cells.</a> Journal of Immunology. 173 (3), 1511-1513 (2004).</li><li>Sciaky, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Golgi+tubule+traffic+and+the+effects+of+brefeldin+A+visualized+in+living+cells.">Golgi tubule traffic and the effects of brefeldin A visualized in living cells.</a> J Cell Biol. 139 (5), 1137-1155 (1997).</li><li>Sprong, H., van der Sluijs, P., van Meer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+proteins+move+lipids+and+lipids+move+proteins.">How proteins move lipids and lipids move proteins.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2 (7), 504-513 (2001).</li><li>Keenan, T. W., Morre, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospholipid+class+and+fatty+acid+composition+of+golgi+apparatus+isolated+from+rat+liver+and+comparison+with+other+cell+fractions.">Phospholipid class and fatty acid composition of golgi apparatus isolated from rat liver and comparison with other cell fractions.</a> Biochemistry. 9 (1), 19-25 (1970).</li><li>Imam, Z. I., Bachand, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicomponent+and+Multiphase+Lipid+Nanotubes+Formed+by+Gliding+Microtubule-Kinesin+Motility+and+Phase-Separated+Giant+Unilamellar+Vesicles.">Multicomponent and Multiphase Lipid Nanotubes Formed by Gliding Microtubule-Kinesin Motility and Phase-Separated Giant Unilamellar Vesicles.</a> Langmuir. 35 (49), 16281-16289 (2019).</li><li>Wesolowska, O., Michalak, K., Maniewska, J., Hendrich, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Giant+unilamellar+vesicles+-+a+perfect+tool+to+visualize+phase+separation+and+lipid+rafts+in+model+systems.">Giant unilamellar vesicles - a perfect tool to visualize phase separation and lipid rafts in model systems.</a> Acta Biochimica Polonica. 56 (1), 33-39 (2009).</li><li>Momin, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designing+lipids+for+selective+partitioning+into+liquid+ordered+membrane+domains.">Designing lipids for selective partitioning into liquid ordered membrane domains.</a> Soft Matter. 11 (16), 3241-3250 (2015).</li><li>Fygenson, D. K., Braun, E., Libchaber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+diagram+of+microtubules.">Phase diagram of microtubules.</a> Physical Review E. 50, 1579 (1994).</li><li>Greene, A. C., Sasaki, D. Y., Bachand, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forming+Giant-sized+Polymersomes+Using+Gel-assisted+Rehydration.">Forming Giant-sized Polymersomes Using Gel-assisted Rehydration.</a> Journal of Visualized Experiments. (111), (2016).</li><li>Bachand, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+self-assembly+of+1D+microtubule+nano-arrays.">Directed self-assembly of 1D microtubule nano-arrays.</a> Royal Society of Chemistry Advances. 4 (97), 54641-54649 (2014).</li></ol>

एलएनटी नेटवर्क झिल्ली गुणों और ट्रांसमेम्ब्रेन प्रोटीन जैसे बायोमोलेक्यूल्स के परिवहन के लिए इन विट्रो अध्ययन के लिए एक उपयोगी उपकरण है। इसके अलावा, एलएनटी नेटवर्क बनाने के लिए जटिल लिपिड योगों का उ...

लिपिड नैनोट्यूब (एलएनटी) नेटवर्क का निर्माण नॉनक्विलिब्रियम लिपिड संरचनाओं 1,2,3 की इन विट्रो परीक्षा के लिए बढ़ती रुचि का है। कोशिकाएं प्रोटीन4 और न्यूक्लिक एसिड5 के साथ-साथ सेल-टू-सेल संचार 6,7 के विसारक परिवहन के लिए लिपिड नलिकाओं का उपयोग करती हैं। एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम और गोल्गी तंत्र विशेष रूप से दिलचस्प हैं, क्योंकि ये झिल्ली-बाउंड ऑर्गेनेल लिपिड और प्रोटीन संश्लेषण के साथ-साथ सेल 8,9 के साइटोप्लाज्म के भीतर इन अभिन्न बायोमोलेक्यूल्स के परिवहन के लिए प्राथमिक स्थान हैं। इन ऑर्गेनेल की झिल्ली में स्फिंगोलिपिड्स, कोलेस्ट्रॉल और फॉस्फोलिपिड्स10 सहित कई लिपिड प्रजातियां शामिल हैं जो अंततः उनकी कार्यक्षमता को परिभाषित करने में मदद करती हैं। इस प्रकार, इन ऑर्गेनेल को अधिक बारीकी से दोहराने और अध्ययन करने के लिए, इन विट्रो एलएनटी को तेजी से जटिल लिपिड योगों के साथ पुटिकाओं से गढ़ा जाना चाहिए11.
विशाल यूनिलामेलर पुटिकाओं (जीयूवी) का उपयोग लिपिड झिल्ली व्यवहार का अध्ययन करने के लिए व्यापक रूप से किया जाता है क्योंकि उन्हें जटिल योगों के साथ मज़बूती से संश्लेषित किया जा सकता है जिसमें कोलेस्ट्रॉल, फॉस्फेटिडिलकोलाइन (पीसी), फॉस्फेटिडिलइथेनॉलमाइन (पीई), फॉस्फेटिडिलसेरिन (पीएस), और फॉस्फेटिडिलिनोसिटोल (पीआई) 12,13 शामिल हैं। यहां वर्णित ग्लाइडिंग गतिशीलता परख (जीएमए) का उपयोग करके अलग-अलग लिपिड योगों के साथ जीयूवी से एलएनटी बनाने की एक विधि है, जिसमें एलएनटी को जीयूवी पर अभिनय करने वाले किन्सिन मोटर्स और सूक्ष्मनलिका फिलामेंट्स द्वारा किए गए काम के आधार पर बाहर निकाला जाता है। इस प्रणाली में, एक सतह पर अधिशोषित किन्सिन मोटर प्रोटीन बायोटिनिलेटेड सूक्ष्मनलिकाएं को प्रेरित करते हैं, एटीपी के हाइड्रोलिसिस से रासायनिक ऊर्जा को उपयोगी काम में परिवर्तित करते हैं (विशेष रूप से, बायोटिनिलेटेड पुटिकाओं से एलएनटी का बाहर निकालना)11. परिणामी एलएनटी नेटवर्क एलएनटी आकृति विज्ञान में परिवर्तन पर लिपिड चरणों में अंतर के प्रभावों का अध्ययन करने के लिए एक मॉडल मंच प्रदान करता है।
संक्षेप में, किन्सिन मोटर प्रोटीन को कैसिइन युक्त समाधान में एक प्रवाह कक्ष में पेश किया जाता है, जो कक्ष की कांच की सतह पर मोटर्स के सोखना को सक्षम बनाता है। अगला, कक्ष के माध्यम से एटीपी प्रवाह वाले समाधान में बायोटिनिलेटेड सूक्ष्मनलिकाएं और किन्सिन मोटर्स को बांधने और गतिशीलता शुरू करने की अनुमति दी जाती है। एक स्ट्रेप्टाविडिन समाधान तब कक्ष में पेश किया जाता है और सूक्ष्मनलिकाएं के लिए गैर-सहसंयोजक रूप से बांधने की अनुमति दी जाती है। अंत में, बायोटिनिलेटेड लिपिड युक्त जीयूवी को कक्ष में पेश किया जाता है और स्ट्रेप्टाविडिन-लेपित सूक्ष्मनलिकाएं से बांधा जाता है, फिर 15-30 मिनट के दौरान बड़े पैमाने पर नेटवर्क बनाने के लिए एलएनटी को बाहर निकालता है। यह विधि कम लागत पर मानक प्रयोगशाला उपकरण और अभिकर्मकों का उपयोग करके बड़े, शाखित एलएनटी नेटवर्क का उत्पादन करतीहै 11.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1071px;" width="1071">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:65px;width:328px;">100x/1.4 Numerical Aperture Oil Immersion Objective</td>
			<td style="width:104px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;">1-U2B836</td>
			<td style="width:520px;">Olympus UPlanSApo 100x/1.40 Oil Objective Infinity Corrected, RMS Thread 
			Working Distance 0.12mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">3.0 ND Filter</td>
			<td style="width:104px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Neutral Density Filter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">AMP-PNP</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A2647</td>
			<td>(&#946;,&#947;-imidoadenosine 5&#8242;-triphosphate)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">ATP</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A7699</td>
			<td>Adenosine 5&#39;-triphosphate disodium salt hydrate BioXtra</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:328px;">Brightline Pinkel DA/FI/TR/Cy5/Cy7-5X-A000 filter set</td>
			<td style="width:104px;">Semrock</td>
			<td style="width:119px;">LED-DA/FI/TR/Cy5/Cy7-5X-A-000</td>
			<td style="width:520px;"> 
			BrightLine Pinkel filter set, optimized for DAPI, FITC, TRITC, Cy5 &#38; Cy7 and other like fluorophores, illuminated with LED-based light sources</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Casein</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">22090</td>
			<td>Casein hydrolysate for microbiology</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Catalase</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C9322</td>
			<td>Catalase from Bovine Liver</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Chloroform</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">288306</td>
			<td>Chloroform anhydrous contains 0.5-1.0% ethanol as stabilizer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Cholesterol</td>
			<td style="width:104px;">Avanti</td>
			<td style="width:119px;">700000P</td>
			<td>cholesterol (ovine wool, &#62;98%) (powder)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:328px;">D-Glucose</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G7021</td>
			<td style="width:520px;">D-(+)-Glucose powder, BioReagent, suitable for cell culture, suitable for insect cell culture, suitable for plant cell culture, &#8805;99.5%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">DOPC</td>
			<td style="width:104px;">Avanti</td>
			<td style="width:119px;">850375C</td>
			<td>1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (in chloroform)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">DOPE-Biotin</td>
			<td style="width:104px;">Avanti</td>
			<td style="width:119px;">870282C</td>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(biotinyl) (sodium salt)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">DPPC</td>
			<td style="width:104px;">Avanti</td>
			<td style="width:119px;">850355P</td>
			<td>1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (powder)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">DPPE-Biotin</td>
			<td style="width:104px;">Avanti</td>
			<td style="width:119px;">870285P</td>
			<td>1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(biotinyl) (sodium salt)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">DTT</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">43816</td>
			<td>DL-Dithiothreitol solution 1 M</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:328px;">EGTA</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">E4378</td>
			<td style="width:520px;">EGTA, Egtazic acid, Ethylene-bis(oxyethylenenitrilo)tetraacetic acid, Glycol ether diamine tetraacetic acid</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:328px;">Glucose Oxidase</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G6125</td>
			<td style="width:520px;">Glucose Oxidase from Aspergillus niger 
			Type II, &#8805;10,000 units/g solid (without added oxygen)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Glycerol</td>
			<td style="width:104px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">G33</td>
			<td>Glycerol (Certified ACS), Fisher Chemical</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">GTP</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G8877</td>
			<td>Guanosine 5&#8242;-triphosphate sodium salt hydrate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">IX-81 Olympus Microscope</td>
			<td style="width:104px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>IX81 Inverted Microscope from Olympus</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">KOH</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">1050121000</td>
			<td>Potassium Hydroxide</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Magnesium Chloride</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M1028</td>
			<td>1.00 M magnesium chloride solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Orca Flash 4.0 Digital Camera</td>
			<td style="width:104px;">Hamamatsu</td>
			<td style="width:119px;">C13440-20CU</td>
			<td>ORCA-Flash 4.0 V3 Digital CMOS camera</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Oregon Green-DHPE</td>
			<td style="width:104px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">O12650</td>
			<td>Oregon Green 488 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Paclitaxel</td>
			<td style="width:104px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">P3456</td>
			<td>Paclitaxel (Taxol Equivalent) - for use in research only</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:328px;">PIPES</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P6757</td>
			<td style="width:520px;">1,4-Piperazinediethanesulfonic acid, Piperazine-1,4-bis(2-ethanesulfonic acid), Piperazine-N,N&#8242;-bis(2-ethanesulfonic acid)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:328px;">Texas Red-DHPE</td>
			<td style="width:104px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">T1395MP</td>
			<td style="width:520px;">Texas Red 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine, 
			Triethylammonium Salt</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Trolox</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">238813</td>
			<td>(&#177;)-6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Tubulin, Biotin</td>
			<td style="width:104px;">Cytoskeleton</td>
			<td style="width:119px;">T333P</td>
			<td>Tubulin protein (biotin) porcine brain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Tubulin, Hy-Lite 488</td>
			<td style="width:104px;">Cytoskeleton</td>
			<td style="width:119px;">TL488M</td>
			<td>Tubulin protein (fluorescent HiLyte 488) porcine brain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Tubulin, Unlabeled</td>
			<td style="width:104px;">Cytoskeleton</td>
			<td style="width:119px;">T240</td>
			<td>Tubulin protein porcine brain</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fabricating multi-component lipid nanotube networks using the gliding kinesin motility assay

लिपिड नैनोट्यूब (एलएनटी) नेटवर्क यूकेरियोटिक कोशिकाओं में पाए जाने वाले सर्वव्यापी लिपिड नलिकाओं की प्रासंगिकता के साथ आणविक परिवहन और लिपिड बायोफिजिक्स का अध्ययन करने के लिए एक इन विट्रो मॉडल प्रणाली का प्रतिनिधित्व करते हैं। हालांकि, विवो एलएनटी में अत्यधिक गैर-संतुलन संरचनाएं हैं जिन्हें रासायनिक ऊर्जा और आणविक मोटर्स को इकट्ठा करने, बनाए रखने और पुनर्गठित करने की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, विवो एलएनटी की संरचना जटिल है, जिसमें कई अलग-अलग लिपिड प्रजातियां शामिल हैं। एलएनटी को बाहर निकालने के विशिष्ट तरीके समय और श्रम-गहन दोनों हैं, और उन्हें विशाल लिपिड पुटिकाओं से नैनोट्यूब को जबरन खींचने के लिए ऑप्टिकल चिमटी, माइक्रोबीड्स और माइक्रोपिपेट्स की आवश्यकता होती है। यहां प्रस्तुत ग्लाइडिंग गतिशीलता परख (जीएमए) के लिए एक प्रोटोकॉल है, जिसमें बड़े पैमाने पर एलएनटी नेटवर्क तेजी से किनेसिन संचालित सूक्ष्मनलिका गतिशीलता का उपयोग करके विशाल यूनिलामेलर पुटिकाओं (जीयूवी) से उत्पन्न होते हैं। इस पद्धति का उपयोग करके, एलएनटी नेटवर्क लिपिड योगों की एक विस्तृत श्रृंखला से बनते हैं जो जैविक एलएनटी की जटिलता की नकल करते हैं, जिससे वे लिपिड बायोफिजिक्स और झिल्ली से जुड़े परिवहन के इन विट्रो अध्ययनों के लिए तेजी से उपयोगी होते हैं। इसके अतिरिक्त, यह विधि आमतौर पर उपयोग किए जाने वाले प्रयोगशाला उपकरणों का उपयोग करके थोड़े समय (<30 मिनट) में मज़बूती से एलएनटी नेटवर्क का उत्पादन करने में सक्षम है। लंबाई, चौड़ाई और लिपिड विभाजन जैसी एलएनटी नेटवर्क विशेषताओं को नेटवर्क बनाने के लिए उपयोग किए जाने वाले जीयूवी की लिपिड संरचना को बदलकर भी ट्यून किया जा सकता है।

एलएनटी नेटवर्क (चित्रा 4) वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग करके गढ़े गए थे, जो जीयूवी से एलएनटी को बाहर निकालने के लिए सूक्ष्मनलिकाएं के किन्सिन परिवहन द्वारा किए गए कार्य का उपयोग करता है। संक्षेप...

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Fabricating Multi-Component Lipid Nanotube Networks Using the Gliding Kinesin Motility Assay

यह प्रोटोकॉल विशाल यूनिलामेलर लिपिड पुटिकाओं के साथ संयोजन के रूप में ग्लाइडिंग किनेसिन गतिशीलता का उपयोग करके लिपिड नैनोट्यूब नेटवर्क बनाने के लिए एक प्रक्रिया का वर्णन करता है।

ग्लाइडिंग किन्सिन गतिशीलता परख का उपयोग करके मल्टी-घटक लिपिड नैनोट्यूब नेटवर्क बनाना

Lipid nanotube (LNT) networks represent an in vitro model system for studying molecular transport and lipid biophysics with relevance to the ubiquitous ...

यह प्रोटोकॉल बड़े पैमाने पर लिपिड नैनोट्यूब नेटवर्क की सरल पीढ़ी के लिए अनुमति देता है जिसमें व्यक्तिगत नैनोट्यूब माता-पिता पुटिका के समान चरण पृथक्करण व्यवहार प्रदर्शित करते हैं। इस दृष्टिकोण का मुख्य लाभ यह है कि हम आणविक मोटर्स द्वारा किए गए काम को अत्यधिक समानांतर तरीके से और मानव हस्तक्षेप के बिना लिपिड नैनोट्यूब को आत्म-इकट्ठा करने के लिए सह-ऑप्ट करते हैं। एक ग्लाइडिंग गतिशीलता परख स्थापित करने के लिए, सबसे पहले, एक गिलास स्लाइड पांच मिलीमीटर अलग पर डबल पक्षीय टेप स्ट्रिप्स के तीन सेट चिपकाएं।धीरे-धीरे टेप पर एक कवर पर्ची दबाएं और तैयार प्रवाह सेल में एक-माइक्रोमोलर किन्सिन समाधान के 30 माइक्रोलीटर जोड़ें। पांच मिनट के बाद, सेल में 10-माइक्रोग्राम / मिलीलीटर सूक्ष्मनलिका समाधान के 30 माइक्रोलीटर जोड़ें, समाधान विनिमय की सुविधा के लिए प्रवाह चैनल के विपरीत छोर के खिलाफ धीरे से एक प्रयोगशाला पोंछ दबाएं। एक और पांच मिनट इनक्यूबेशन के बाद, प्रवाह सेल में 10-माइक्रोग्राम / मिलीलीटर स्ट्रेप्टाविडिन समाधान के 30 माइक्रोलीटर जोड़ने से पहले प्रति धोने के कमरे के तापमान गतिशीलता समाधान के 50 माइक्रोलीटर के साथ सेल को एक से तीन बार धो लें।10 मिनट के बाद, कमरे के तापमान पर 30 मिनट की इनक्यूबेशन के लिए 10 एक्स जीयूवी समाधान के 30 माइक्रोलीटर जोड़ें। फिर, 100-मिलीमोलर एएमपी-पीएनपी समाधान के दो माइक्रोलीटर जोड़ें और सीलेंट के साथ कक्ष को बंद करें। इमेजिंग के लिए एक उल्टे माइक्रोस्कोप के लिए प्रवाह कक्ष स्थानांतरण और उपयुक्त फिल्टर सेट का चयन करें।ब्याज के नेटवर्क की छवि प्राप्त करने से पहले कवर पर्ची की सतह पर ध्यान केंद्रित करने के लिए 100X तेल उद्देश्य का उपयोग करें। फिर छवि को इमेजजे में खोलें और समग्र छवि बनाने के लिए लाल और हरे रंग के चैनलों को ओवरले करने के लिए छवि, रंग और समग्र पर क्लिक करें। इमेजिंग के बाद, ब्याज की छवि खोलें और माइक्रोस्कोप के लिए पैमाने को कैलिब्रेट करने के लिए विश्लेषण और सेट स्केल पर क्लिक करें।माइक्रोमीटर रूपांतरण कारक में पिक्सेल भरें और ठीक क्लिक करें। माता-पिता जीयूवी से शुरू होने वाले नैनोट्यूब का पता लगाने के लिए मल्टी-पॉइंट लाइन टूल का उपयोग करें और लंबाई को मापने के लिए कंट्रोल और एम दबाएं और दबाए रखें। छवि प्रसंस्करण उपकरण परिणाम विंडो में प्रत्येक नए माप को बचाएगा। जब सभी ट्यूबों को मापा गया है, तो छवि, समायोजित करें और थ्रेशोल्ड का चयन करें और थ्रेशोल्ड लागू करने के लिए लागू करें पर क्लिक करें।फिर, वांछित ट्यूब पर ज्ञात लंबाई का एक आयत खींचें। क्षेत्र के एकीकृत घनत्व को मापने के लिए, विश्लेषण और मापें क्लिक करें तरल नैनोट्यूब नोड्स में लिपिड विभाजन का निर्धारण करने के लिए, ब्याज के नोड पर एक रेखा खींचने और हरे और लाल दोनों चैनलों में नोड तीव्रता को मापने के लिए लाइन टूल का उपयोग करें। इस प्रतिनिधि विश्लेषण में, तरल नैनोट्यूब नेटवर्क को तरल-अव्यवस्थित और आदेशित चरणों के साथ-साथ चरण-पृथक पुटिकाओं को उत्पन्न करने के लिए प्रदर्शित किया गया था।उदाहरण के लिए, 45% संतृप्त लिपिड और 55% असंतृप्त लिपिड के साथ संश्लेषित पुटिकाओं के परिणामस्वरूप पुटिकाएं होती हैं जो सह-मौजूदा तरल-अव्यवस्थित और ठोस चरणों में अलग हो जाती हैं। यदि कोलेस्ट्रॉल शामिल है, हालांकि, तरल-तरल सह-अस्तित्व को तब देखा जा सकता है, जिससे जीयूवी का निर्माण होता है जो सह-मौजूदा तरल-आदेशित और तरल-अव्यवस्थित चरणों में अलग हो जाते हैं। इसके अलावा, नोड्स को चरण-पृथक मिश्रण के भीतर देखा जा सकता है।याद रखने वाली सबसे महत्वपूर्ण बात यह है कि फ्लोरोफोरस को फोटो-ब्लीचिंग के बिना लिपिड नैनोट्यूब की कल्पना करने में सक्षम होने के लिए उपयुक्त एक्सपोजर समय और एनडी फ़िल्टर सेट चुनना है। लिपिड नैनोट्यूब के चरण व्यवहार की संरचना को सिलाई करने से हमें कोशिकाओं को जोड़ने वाले टनलिंग नैनोट्यूब के बायोफिजिक्स का अध्ययन शुरू करने के लिए एक न्यूनतर मॉडल प्रणाली का उपयोग करने की अनुमति मिलती है।

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Plasma Lithography Surface Patterning for Creation of Cell Networks

सेल नेटवर्क के निर्माण के लिए प्लाज्मा लिथोग्राफी भूतल patterning

Systematic manipulation of a cell microenvironment with micro- and nanoscale resolution is often required for deciphering various cellular and molecular ...

Flexural Rigidity Measurements of Biopolymers Using Gliding Assays

ग्लाइडिंग assays का उपयोग Biopolymers की flexural कठोरता माप

Microtubules are cytoskeletal polymers which  play a role in cell division, cell mechanics, and intracellular transport. Each of these functions requires ...

Generation of Shear Adhesion Map Using SynVivo Synthetic Microvascular Networks

SynVivo सिंथेटिक microvascular नेटवर्क का प्रयोग कतरें आसंजन नक्शा की पीढ़ी

Cell/particle adhesion assays are critical to understanding the biochemical interactions involved in disease pathophysiology and have important ...

Electric Cell-substrate Impedance Sensing for the Quantification of Endothelial Proliferation, Barrier Function, and Motility

इलेक्ट्रिक सेल सब्सट्रेट विरोध Endothelial प्रसार, बाधा समारोह की मात्रा का ठहराव के लिए सेंसिंग, और गतिशीलता

Electric Cell-substrate Impedance Sensing (ECIS) is an in vitro impedance measuring system to quantify the behavior of cells within adherent cell layers. ...

Lipid Bilayer Vesicle Generation Using Microfluidic Jetting

Microfluidic Jetting का प्रयोग लिपिड bilayer पुटिका पीढ़ी

Bottom-up synthetic biology presents a novel approach for investigating and reconstituting biochemical systems and, potentially, minimal organisms. This ...

Fabricating Complex Culture Substrates Using Robotic Microcontact Printing (R-&#181;CP) and Sequential Nucleophilic Substitution

Fabricating Complex Culture Substrates Using Robotic Microcontact Printing R-Ãƒâ€šÃ‚ÂµCP and Sequential Nucleophilic Substitution

रोबोट microcontact मुद्रण (आर-μCP) का प्रयोग परिसर संस्कृति substrates और अनुक्रमिक न्युक्लेओफ़िलिक प्रतिस्थापन fabricating

In tissue engineering, it is desirable to exhibit spatial control of tissue morphology and cell fate in culture on the micron scale. Culture substrates ...

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer (SALB) Method

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer SALB Method

विलायक की सहायता लिपिड bilayer (SALB) विधि द्वारा Biomembrane निर्माण

In order to mimic cell membranes, the supported lipid bilayer (SLB) is an attractive platform which enables in vitro investigation of membrane-related ...

Solid Lipid Nanoparticles (SLNs) for Intracellular Targeting Applications

Solid Lipid Nanoparticles SLNs for Intracellular Targeting Applications

ठोस लिपिड नैनोकणों (SLNs) Intracellular लक्ष्य निर्धारण के लिए एप्लीकेशन

Nanoparticle-based delivery vehicles have shown great promise for intracellular targeting applications, providing a mechanism to specifically alter ...

Fabricating Superhydrophobic Polymeric Materials for Biomedical Applications

जैव चिकित्सा अनुप्रयोगों के लिए Superhydrophobic polymeric सामग्री fabricating

Superhydrophobic materials, with surfaces possessing permanent or metastable non-wetted states, are of interest for a number of biomedical and industrial ...

Fabricating Cotton Analytical Devices

Fabricating कपास विश्लेषणात्मक उपकरणों

A robust, low-cost analytical device should be user-friendly, rapid, and affordable. Such devices should also be able to operate with scarce samples and ...