Name: fabricating multi-component lipid nanotube networks using the gliding kinesin motility assay
Uploaded: 2021-07-26T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fabricating Multi-Component Lipid Nanotube Networks Using the Gliding Kinesin Motility Assay at JoVE.com

Questo lavoro è stato supportato dal Dipartimento dell'Energia degli Stati Uniti, Office of Basic Energy Sciences, Division of Materials Sciences and Engineering (BES-MSE). La sintesi della kinesina e la microscopia a fluorescenza sono state eseguite attraverso un progetto utente (ZIM) presso il Center for Integrated Nanotechnologies, una struttura per utenti dell'Office of Science gestita per l'Office of Science del Dipartimento dell'Energia degli Stati Uniti (DOE).

1. Preparazione di soluzioni di microtubuli di riserva
ATTENZIONE: occhiali di sicurezza, guanti e un camice da laboratorio devono essere sempre indossati durante tutto il protocollo.
<ol><li>Preparare 5x tampone BRB80: aggiungere 24,19 g di PIPES (piperazina-N,N′-bis[acido 2-etansolfonico]) e 0,38 g di EGTA (glicole etilenico-bis[β-aminoetiletere]-N,N,N′,N′-acido tetraacetico) in un flacone di vetro da 1 L. Aggiungere 1 mL di 1 M MgCl2 e regolare il pH a 6,9 con KOH. Aggiu...

<ol>
	<li>Bouxsein, N. F., Carroll-Portillo, A., Bachand, M., Sasaki, D. Y., Bachand, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+continuous+network+of+lipid+nanotubes+fabricated+from+the+gliding+motility+of+kinesin+powered+microtubule+filaments.">A continuous network of lipid nanotubes fabricated from the gliding motility of kinesin powered microtubule filaments.</a> Langmuir. 29 (9), 2992-2999 (2013).</li><li>Paxton, W. F., Bouxsein, N. F., Henderson, I. M., Gomez, A., Bachand, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+assembly+of+polymer+nanotube+networks+via+kinesin+powered+microtubule+filaments.">Dynamic assembly of polymer nanotube networks via kinesin powered microtubule filaments.</a> Nanoscale. 7 (25), 10998-11004 (2015).</li><li>Leduc, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperative+extraction+of+membrane+nanotubes+by+molecular+motors.">Cooperative extraction of membrane nanotubes by molecular motors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (49), 17096-17101 (2004).</li><li>Lippincott-Schwartz, J., Roberts, T. H., Hirschberg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secretory+protein+trafficking+and+organelle+dynamics+in+living+cells.">Secretory protein trafficking and organelle dynamics in living cells.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 16, 557-589 (2000).</li><li>Belting, M., Wittrup, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanotubes,+exosomes,+and+nucleic+acid-binding+peptides+provide+novel+mechanisms+of+intercellular+communication+in+eukaryotic+cells:+implications+in+health+and+disease.">Nanotubes, exosomes, and nucleic acid-binding peptides provide novel mechanisms of intercellular communication in eukaryotic cells: implications in health and disease.</a> Journal of Cell Biology. 183 (7), 1187-1191 (2008).</li><li>Rustom, A., Saffrich, R., Markovic, I., Walther, P., Gerdes, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanotubular+highways+for+intercellular+organelle+transport.">Nanotubular highways for intercellular organelle transport.</a> Science. 303 (5660), 1007-1010 (2004).</li><li>Onfelt, B., Nedvetzki, S., Yanagi, K., Davis, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutting+edge:+Membrane+nanotubes+connect+immune+cells.">Cutting edge: Membrane nanotubes connect immune cells.</a> Journal of Immunology. 173 (3), 1511-1513 (2004).</li><li>Sciaky, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Golgi+tubule+traffic+and+the+effects+of+brefeldin+A+visualized+in+living+cells.">Golgi tubule traffic and the effects of brefeldin A visualized in living cells.</a> J Cell Biol. 139 (5), 1137-1155 (1997).</li><li>Sprong, H., van der Sluijs, P., van Meer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+proteins+move+lipids+and+lipids+move+proteins.">How proteins move lipids and lipids move proteins.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2 (7), 504-513 (2001).</li><li>Keenan, T. W., Morre, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospholipid+class+and+fatty+acid+composition+of+golgi+apparatus+isolated+from+rat+liver+and+comparison+with+other+cell+fractions.">Phospholipid class and fatty acid composition of golgi apparatus isolated from rat liver and comparison with other cell fractions.</a> Biochemistry. 9 (1), 19-25 (1970).</li><li>Imam, Z. I., Bachand, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicomponent+and+Multiphase+Lipid+Nanotubes+Formed+by+Gliding+Microtubule-Kinesin+Motility+and+Phase-Separated+Giant+Unilamellar+Vesicles.">Multicomponent and Multiphase Lipid Nanotubes Formed by Gliding Microtubule-Kinesin Motility and Phase-Separated Giant Unilamellar Vesicles.</a> Langmuir. 35 (49), 16281-16289 (2019).</li><li>Wesolowska, O., Michalak, K., Maniewska, J., Hendrich, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Giant+unilamellar+vesicles+-+a+perfect+tool+to+visualize+phase+separation+and+lipid+rafts+in+model+systems.">Giant unilamellar vesicles - a perfect tool to visualize phase separation and lipid rafts in model systems.</a> Acta Biochimica Polonica. 56 (1), 33-39 (2009).</li><li>Momin, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designing+lipids+for+selective+partitioning+into+liquid+ordered+membrane+domains.">Designing lipids for selective partitioning into liquid ordered membrane domains.</a> Soft Matter. 11 (16), 3241-3250 (2015).</li><li>Fygenson, D. K., Braun, E., Libchaber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+diagram+of+microtubules.">Phase diagram of microtubules.</a> Physical Review E. 50, 1579 (1994).</li><li>Greene, A. C., Sasaki, D. Y., Bachand, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forming+Giant-sized+Polymersomes+Using+Gel-assisted+Rehydration.">Forming Giant-sized Polymersomes Using Gel-assisted Rehydration.</a> Journal of Visualized Experiments. (111), (2016).</li><li>Bachand, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+self-assembly+of+1D+microtubule+nano-arrays.">Directed self-assembly of 1D microtubule nano-arrays.</a> Royal Society of Chemistry Advances. 4 (97), 54641-54649 (2014).</li></ol>

Le reti LNT sono uno strumento utile per studi in vitro sulle proprietà della membrana e sul trasporto di biomolecole come le proteine transmembrana. Inoltre, l'utilizzo di formulazioni lipidiche complesse per fabbricare reti LNT consente studi più rilevanti dal punto di vista biologico. Altri studi di fabbricazione hanno utilizzato 1) semplici formulazioni lipidiche e vescicole multilamellari o 2) tecniche di motilità più ingombranti per fabbricare reti da GUV composte da formulazioni lipidiche complesse. Il metodo ...

La fabbricazione di reti di nanotubi lipidici (LNT) è di crescente interesse per l'esame in vitro delle strutture lipidiche non equivalenti 1,2,3. Le cellule utilizzano tubuli lipidici per il trasporto diffusivo delle proteine4 e degli acidi nucleici5 e per la comunicazione cellula-cellula 6,7. Il reticolo endoplasmatico e l'apparato di Golgi sono particolarmente interessanti, in quanto questi organelli legati alla membrana sono le posizioni primarie per la sintesi lipidica e proteica, nonché per il trasporto di queste biomolecole integrali all'interno del citoplasma di una cellula 8,9. Le membrane di questi organelli sono composte da più specie lipidiche tra cui sfingolipidi, colesterolo e fosfolipidi10 che alla fine aiutano a definire la loro funzionalità. Pertanto, per replicare e studiare più da vicino questi organelli, gli LNT in vitro devono essere fabbricati da vescicole con formulazioni lipidiche sempre più complesse11.
Le vescicole unilamellari giganti (GUV) sono utilizzate in modo pervasivo per studiare il comportamento della membrana lipidica perché possono essere sintetizzate in modo affidabile con formulazioni complesse che includono colesterolo, fosfatidilcolina (PC), fosfatidiletanolammina (PE), fosfatidilserina (PS) e fosfatidilinositolo (PI) 12,13. Qui è descritto un metodo per fabbricare LNT da GUV con diverse formulazioni lipidiche utilizzando il test di motilità planante (GMA), in cui gli LNT vengono estrusi in base al lavoro svolto dai motori kinesin e dai filamenti di microtubuli che agiscono sui VAV. In questo sistema, le proteine motorie della chinesina adsorbite in superficie spingono microtubuli biotinilati, convertendo l'energia chimica dall'idrolisi dell'ATP in lavoro utile (in particolare, l'estrusione di LNT da vescicole biotinilate)11. La rete LNT risultante fornisce una piattaforma modello per studiare gli effetti delle differenze nelle fasi lipidiche sui cambiamenti nella morfologia LNT.
In breve, le proteine motorie della chinesina vengono introdotte in una camera di flusso in una soluzione contenente caseina, che consente l'adsorbimento dei motori sulla superficie di vetro della camera. Successivamente, i microtubuli biotinilati in una soluzione contenente ATP fluiscono attraverso la camera e vengono lasciati legare ai motori della kinesina e iniziare la motilità. Una soluzione di streptavidina viene quindi introdotta nella camera e lasciata legare in modo non covalente ai microtubuli. Infine, i GUV contenenti un lipide biotinilato vengono introdotti nella camera e si legano ai microtubuli rivestiti di streptavidina, quindi estrudono gli LNT per formare reti su larga scala nel corso di 15-30 minuti. Questo metodo produce grandi reti LNT ramificate utilizzando apparecchiature di laboratorio standard e reagenti a basso costo11.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1071px;" width="1071">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:65px;width:328px;">100x/1.4 Numerical Aperture Oil Immersion Objective</td>
			<td style="width:104px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;">1-U2B836</td>
			<td style="width:520px;">Olympus UPlanSApo 100x/1.40 Oil Objective Infinity Corrected, RMS Thread 
			Working Distance 0.12mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">3.0 ND Filter</td>
			<td style="width:104px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Neutral Density Filter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">AMP-PNP</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A2647</td>
			<td>(&#946;,&#947;-imidoadenosine 5&#8242;-triphosphate)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">ATP</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A7699</td>
			<td>Adenosine 5&#39;-triphosphate disodium salt hydrate BioXtra</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:328px;">Brightline Pinkel DA/FI/TR/Cy5/Cy7-5X-A000 filter set</td>
			<td style="width:104px;">Semrock</td>
			<td style="width:119px;">LED-DA/FI/TR/Cy5/Cy7-5X-A-000</td>
			<td style="width:520px;"> 
			BrightLine Pinkel filter set, optimized for DAPI, FITC, TRITC, Cy5 &#38; Cy7 and other like fluorophores, illuminated with LED-based light sources</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Casein</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">22090</td>
			<td>Casein hydrolysate for microbiology</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Catalase</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C9322</td>
			<td>Catalase from Bovine Liver</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Chloroform</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">288306</td>
			<td>Chloroform anhydrous contains 0.5-1.0% ethanol as stabilizer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Cholesterol</td>
			<td style="width:104px;">Avanti</td>
			<td style="width:119px;">700000P</td>
			<td>cholesterol (ovine wool, &#62;98%) (powder)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:328px;">D-Glucose</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G7021</td>
			<td style="width:520px;">D-(+)-Glucose powder, BioReagent, suitable for cell culture, suitable for insect cell culture, suitable for plant cell culture, &#8805;99.5%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">DOPC</td>
			<td style="width:104px;">Avanti</td>
			<td style="width:119px;">850375C</td>
			<td>1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (in chloroform)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">DOPE-Biotin</td>
			<td style="width:104px;">Avanti</td>
			<td style="width:119px;">870282C</td>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(biotinyl) (sodium salt)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">DPPC</td>
			<td style="width:104px;">Avanti</td>
			<td style="width:119px;">850355P</td>
			<td>1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (powder)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">DPPE-Biotin</td>
			<td style="width:104px;">Avanti</td>
			<td style="width:119px;">870285P</td>
			<td>1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(biotinyl) (sodium salt)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">DTT</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">43816</td>
			<td>DL-Dithiothreitol solution 1 M</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:328px;">EGTA</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">E4378</td>
			<td style="width:520px;">EGTA, Egtazic acid, Ethylene-bis(oxyethylenenitrilo)tetraacetic acid, Glycol ether diamine tetraacetic acid</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:328px;">Glucose Oxidase</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G6125</td>
			<td style="width:520px;">Glucose Oxidase from Aspergillus niger 
			Type II, &#8805;10,000 units/g solid (without added oxygen)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Glycerol</td>
			<td style="width:104px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">G33</td>
			<td>Glycerol (Certified ACS), Fisher Chemical</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">GTP</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G8877</td>
			<td>Guanosine 5&#8242;-triphosphate sodium salt hydrate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">IX-81 Olympus Microscope</td>
			<td style="width:104px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>IX81 Inverted Microscope from Olympus</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">KOH</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">1050121000</td>
			<td>Potassium Hydroxide</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Magnesium Chloride</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M1028</td>
			<td>1.00 M magnesium chloride solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Orca Flash 4.0 Digital Camera</td>
			<td style="width:104px;">Hamamatsu</td>
			<td style="width:119px;">C13440-20CU</td>
			<td>ORCA-Flash 4.0 V3 Digital CMOS camera</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Oregon Green-DHPE</td>
			<td style="width:104px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">O12650</td>
			<td>Oregon Green 488 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Paclitaxel</td>
			<td style="width:104px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">P3456</td>
			<td>Paclitaxel (Taxol Equivalent) - for use in research only</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:328px;">PIPES</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P6757</td>
			<td style="width:520px;">1,4-Piperazinediethanesulfonic acid, Piperazine-1,4-bis(2-ethanesulfonic acid), Piperazine-N,N&#8242;-bis(2-ethanesulfonic acid)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:328px;">Texas Red-DHPE</td>
			<td style="width:104px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">T1395MP</td>
			<td style="width:520px;">Texas Red 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine, 
			Triethylammonium Salt</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Trolox</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">238813</td>
			<td>(&#177;)-6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Tubulin, Biotin</td>
			<td style="width:104px;">Cytoskeleton</td>
			<td style="width:119px;">T333P</td>
			<td>Tubulin protein (biotin) porcine brain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Tubulin, Hy-Lite 488</td>
			<td style="width:104px;">Cytoskeleton</td>
			<td style="width:119px;">TL488M</td>
			<td>Tubulin protein (fluorescent HiLyte 488) porcine brain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Tubulin, Unlabeled</td>
			<td style="width:104px;">Cytoskeleton</td>
			<td style="width:119px;">T240</td>
			<td>Tubulin protein porcine brain</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fabricating multi-component lipid nanotube networks using the gliding kinesin motility assay

Le reti di nanotubi lipidici (LNT) rappresentano un sistema modello in vitro per lo studio del trasporto molecolare e della biofisica lipidica con rilevanza per i tubuli lipidici ubiquitari presenti nelle cellule eucariotiche. Tuttavia, gli LNT in vivo sono strutture altamente in equilibrio che richiedono energia chimica e motori molecolari per essere assemblati, mantenuti e riorganizzati. Inoltre, la composizione degli LNT in vivo è complessa, comprendente più specie lipidiche diverse. I metodi tipici per estrudere gli LNT sono sia dispendiosi in termini di tempo che di lavoro e richiedono pinzette ottiche, microsfere e micropipette per estrarre forzatamente nanotubi da vescicole lipidiche giganti. Qui viene presentato un protocollo per il test di motilità planante (GMA), in cui le reti LNT su larga scala vengono rapidamente generate da vescicole unilamellari giganti (GUV) utilizzando la motilità dei microtubuli alimentati da chinesina. Utilizzando questo metodo, le reti LNT sono formate da una vasta gamma di formulazioni lipidiche che imitano la complessità degli LNT biologici, rendendoli sempre più utili per studi in vitro di biofisica lipidica e trasporto associato alla membrana. Inoltre, questo metodo è in grado di produrre in modo affidabile reti LNT in breve tempo (<30 min) utilizzando apparecchiature di laboratorio comunemente utilizzate. Anche le caratteristiche della rete LNT come lunghezza, larghezza e partizionamento lipidico sono sintonizzabili alterando la composizione lipidica dei GUV utilizzati per fabbricare le reti.

Le reti LNT (Figura 4) sono state fabbricate utilizzando il protocollo descritto, che utilizza il lavoro svolto dal trasporto kinesin di microtubuli per estrudere LNT dai GUV. In breve, i VAV sono stati preparati utilizzando la reidratazione del gel di agarosio utilizzando soluzione di saccarosio e i microtubuli sono stati polimerizzati in soluzione GPEM e stabilizzati in BRB80T. Successivamente, i motori kinesin sono stati introdotti in una cella di flusso formando uno strato attivo di moto...

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Fabricating Multi-Component Lipid Nanotube Networks Using the Gliding Kinesin Motility Assay

Questo protocollo descrive un processo per fabbricare reti di nanotubi lipidici utilizzando la motilità della kinesina planante in combinazione con vescicole lipidiche unilamellari giganti.

Fabbricazione di reti di nanotubi lipidici multicomponenti utilizzando il test di motilità di Kinesin gliding

Lipid nanotube (LNT) networks represent an in vitro model system for studying molecular transport and lipid biophysics with relevance to the ubiquitous ...

Questo protocollo consente la semplice generazione di reti di nanotubi lipidici su larga scala in cui i singoli nanotubi mostrano un comportamento di separazione di fase simile a quello della vescicola genitore. Il vantaggio principale di questo approccio è che cooptiamo il lavoro svolto dai motori molecolari per auto-assemblare i nanotubi lipidici in modo altamente parallelo e senza l'intervento umano. Per impostare un test di motilità di scorrimento, in primo luogo, apporre tre serie di strisce di nastro biadesivo su una slitta di vetro a cinque millimetri di distanza.Premere delicatamente un coperchio scivolare sul nastro e aggiungere 30 microlitri di una soluzione di kinesina monoparolare nella cella di flusso preparata. Dopo cinque minuti, aggiungere 30 microlitri di una soluzione di microtubuli da 10 microgrammi/millilitro nella cella, premendo delicatamente una salvietta da laboratorio contro l'estremità opposta del canale di flusso per facilitare lo scambio di soluzione. Dopo altri cinque minuti di incubazione, lavare la cella da una a tre volte con 50 microlitri di soluzione di motilità a temperatura ambiente per lavaggio prima di aggiungere 30 microlitri di soluzione di streptavidina da 10 microgrammi / millilitro alla cella di flusso.Dopo 10 minuti, aggiungere 30 microlitri di una soluzione 10X GUV per un'incubazione di 30 minuti a temperatura ambiente. Quindi, aggiungere due microlitri di una soluzione AMP-PNP da 100 millimolari e chiudere la camera con sigillante. Trasferire la camera di flusso su un microscopio invertito per l'imaging e selezionare il set di filtri appropriato.Utilizzare un obiettivo a olio 100X per mettere a fuoco prima la superficie dello slittamento del coperchio prima di acquisire un'immagine di una rete di interesse. Quindi aprire l'immagine in ImageJ e fare clic su Immagine, Colore e Composito per sovrapporre i canali rosso e verde per creare un'immagine composita. Dopo l'imaging, apri l'immagine di interesse e fai clic su Analizza e imposta scala per calibrare la scala per il microscopio.Inserisci i pixel fino al fattore di conversione del micrometro e fai clic su OK. Utilizzare lo strumento linea multipunto per tracciare i nanotubi a partire dal GUV padre e tenere premuti Ctrl e M per misurare la lunghezza. Lo strumento di elaborazione delle immagini salverà ogni nuova misurazione nella finestra dei risultati. Quando tutti i tubi sono stati misurati, selezionare Immagine, Regola e Soglia e fare clic su Applica per applicare la soglia.Quindi, disegnare un rettangolo di lunghezza nota sul tubo desiderato. Per misurare la densità integrata dell'area, fare clic su Analizza e misura Per determinare il partizionamento lipidico nei nodi dei nanotubi liquidi, utilizzare lo strumento linea per disegnare una linea sul nodo di interesse e misurare l'intensità del nodo sia nei canali verde che rosso. In questa analisi rappresentativa, sono state fabbricate reti di nanotubi liquidi come dimostrato per generare fasi disordinate e ordinate liquide, nonché vescicole separate da fasi.Ad esempio, le vescicole sintetizzate con il 45% di lipidi saturi e il 55% di lipidi insaturi si traducono in vescicole che si separano in fasi liquide-disordinate e solide coesistenti. Se si include il colesterolo, tuttavia, si può quindi osservare la coesistenza liquido-liquido, creando GUV che si separano in fasi coesistenti ordinate liquide e liquido-disordinate. Inoltre, i nodi possono essere osservati all'interno delle miscele separate da fase.La cosa più importante da ricordare è scegliere il tempo di esposizione appropriato e il set di filtri ND per poter visualizzare i nanotubi lipidici senza foto-sbiancare i fluorofori. Personalizzare la composizione del comportamento di fase dei nanotubi lipidici ci consente di utilizzare un sistema di modelli minimalisti per iniziare a studiare la biofisica dei nanotubi di tunneling che collegano le cellule.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Plasma Lithography Surface Patterning for Creation of Cell Networks

Plasma Surface Patterning litografia per la creazione di reti di cella

Systematic manipulation of a cell microenvironment with micro- and nanoscale resolution is often required for deciphering various cellular and molecular ...

Ricerca

Bioingegneria

Flexural Rigidity Measurements of Biopolymers Using Gliding Assays

Misure rigidezza flessionale di biopolimeri usando saggi Gliding

Microtubules are cytoskeletal polymers which  play a role in cell division, cell mechanics, and intracellular transport. Each of these functions requires ...

Generation of Shear Adhesion Map Using SynVivo Synthetic Microvascular Networks

Generazione di Shear Adesione mappa usando SynVivo reti microvascolari sintetico

Cell/particle adhesion assays are critical to understanding the biochemical interactions involved in disease pathophysiology and have important ...

Electric Cell-substrate Impedance Sensing for the Quantification of Endothelial Proliferation, Barrier Function, and Motility

Elettrico Cell-substrato Impedance Sensing per la quantificazione dei Endothelial proliferazione, Barriera funzione e motilità

Electric Cell-substrate Impedance Sensing (ECIS) is an in vitro impedance measuring system to quantify the behavior of cells within adherent cell layers. ...

Lipid Bilayer Vesicle Generation Using Microfluidic Jetting

Doppio strato lipidico delle vescicole Generation Uso Microfluidic getto

Bottom-up synthetic biology presents a novel approach for investigating and reconstituting biochemical systems and, potentially, minimal organisms. This ...

Fabricating Complex Culture Substrates Using Robotic Microcontact Printing (R-&#181;CP) and Sequential Nucleophilic Substitution

Fabricating Complex Culture Substrates Using Robotic Microcontact Printing R-Ãƒâ€šÃ‚ÂµCP and Sequential Nucleophilic Substitution

Realizzazione substrati di coltura complessi utilizzando robotica microcontact stampa (R-μCP) e sequenziale Sostituzione nucleofila

In tissue engineering, it is desirable to exhibit spatial control of tissue morphology and cell fate in culture on the micron scale. Culture substrates ...

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer (SALB) Method

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Biomembrane Fabrication dal solvente assistita doppio strato lipidico (SALB) Metodo

In order to mimic cell membranes, the supported lipid bilayer (SLB) is an attractive platform which enables in vitro investigation of membrane-related ...

Solid Lipid Nanoparticles (SLNs) for Intracellular Targeting Applications

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Solid Lipid nanoparticelle (linfonodi sentinella) Applicazioni per intracellulare targeting

Nanoparticle-based delivery vehicles have shown great promise for intracellular targeting applications, providing a mechanism to specifically alter ...

Fabricating Superhydrophobic Polymeric Materials for Biomedical Applications

Realizzazione superidrofobiche Materiali Polimerici per applicazioni biomediche

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Fabricating Cotton Analytical Devices

Fabbricazione di dispositivi analitici cotone

A robust, low-cost analytical device should be user-friendly, rapid, and affordable. Such devices should also be able to operate with scarce samples and ...