Name: fabricating multi-component lipid nanotube networks using the gliding kinesin motility assay
Uploaded: 2021-07-26T13:00:00
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この研究は、米国エネルギー省基礎エネルギー科学局、材料科学工学部(BES-MSE)の支援を受けた。キネシン合成と蛍光顕微鏡は、米国エネルギー省(DOE)科学局のために運営されている科学局のユーザー施設である統合ナノテクノロジーセンターのユーザープロジェクト(ZIM)を通じて実施されました。

1. ストック微小管溶液の調製
警告: 安全ゴーグル、手袋、および白衣は、プロトコル全体を通して常に着用する必要があります。
<ol><li>5x BRB80バッファーを調製する:1Lのガラス瓶に、24.19gのパイプ(ピペラジン-N,N'-ビス[2-エタンスルホン酸])と0.38gのEGTA(エチレングリコール-ビス[β-アミノエチルエーテル]-N,N,N',N'-四酢酸)を加える。1 mL の 1 M MgCl2 を加え、KOH で pH ?...

<ol>
	<li>Bouxsein, N. F., Carroll-Portillo, A., Bachand, M., Sasaki, D. Y., Bachand, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+continuous+network+of+lipid+nanotubes+fabricated+from+the+gliding+motility+of+kinesin+powered+microtubule+filaments.">A continuous network of lipid nanotubes fabricated from the gliding motility of kinesin powered microtubule filaments.</a> Langmuir. 29 (9), 2992-2999 (2013).</li><li>Paxton, W. F., Bouxsein, N. F., Henderson, I. M., Gomez, A., Bachand, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+assembly+of+polymer+nanotube+networks+via+kinesin+powered+microtubule+filaments.">Dynamic assembly of polymer nanotube networks via kinesin powered microtubule filaments.</a> Nanoscale. 7 (25), 10998-11004 (2015).</li><li>Leduc, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperative+extraction+of+membrane+nanotubes+by+molecular+motors.">Cooperative extraction of membrane nanotubes by molecular motors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (49), 17096-17101 (2004).</li><li>Lippincott-Schwartz, J., Roberts, T. H., Hirschberg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secretory+protein+trafficking+and+organelle+dynamics+in+living+cells.">Secretory protein trafficking and organelle dynamics in living cells.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 16, 557-589 (2000).</li><li>Belting, M., Wittrup, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanotubes,+exosomes,+and+nucleic+acid-binding+peptides+provide+novel+mechanisms+of+intercellular+communication+in+eukaryotic+cells:+implications+in+health+and+disease.">Nanotubes, exosomes, and nucleic acid-binding peptides provide novel mechanisms of intercellular communication in eukaryotic cells: implications in health and disease.</a> Journal of Cell Biology. 183 (7), 1187-1191 (2008).</li><li>Rustom, A., Saffrich, R., Markovic, I., Walther, P., Gerdes, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanotubular+highways+for+intercellular+organelle+transport.">Nanotubular highways for intercellular organelle transport.</a> Science. 303 (5660), 1007-1010 (2004).</li><li>Onfelt, B., Nedvetzki, S., Yanagi, K., Davis, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutting+edge:+Membrane+nanotubes+connect+immune+cells.">Cutting edge: Membrane nanotubes connect immune cells.</a> Journal of Immunology. 173 (3), 1511-1513 (2004).</li><li>Sciaky, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Golgi+tubule+traffic+and+the+effects+of+brefeldin+A+visualized+in+living+cells.">Golgi tubule traffic and the effects of brefeldin A visualized in living cells.</a> J Cell Biol. 139 (5), 1137-1155 (1997).</li><li>Sprong, H., van der Sluijs, P., van Meer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+proteins+move+lipids+and+lipids+move+proteins.">How proteins move lipids and lipids move proteins.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2 (7), 504-513 (2001).</li><li>Keenan, T. W., Morre, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospholipid+class+and+fatty+acid+composition+of+golgi+apparatus+isolated+from+rat+liver+and+comparison+with+other+cell+fractions.">Phospholipid class and fatty acid composition of golgi apparatus isolated from rat liver and comparison with other cell fractions.</a> Biochemistry. 9 (1), 19-25 (1970).</li><li>Imam, Z. I., Bachand, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicomponent+and+Multiphase+Lipid+Nanotubes+Formed+by+Gliding+Microtubule-Kinesin+Motility+and+Phase-Separated+Giant+Unilamellar+Vesicles.">Multicomponent and Multiphase Lipid Nanotubes Formed by Gliding Microtubule-Kinesin Motility and Phase-Separated Giant Unilamellar Vesicles.</a> Langmuir. 35 (49), 16281-16289 (2019).</li><li>Wesolowska, O., Michalak, K., Maniewska, J., Hendrich, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Giant+unilamellar+vesicles+-+a+perfect+tool+to+visualize+phase+separation+and+lipid+rafts+in+model+systems.">Giant unilamellar vesicles - a perfect tool to visualize phase separation and lipid rafts in model systems.</a> Acta Biochimica Polonica. 56 (1), 33-39 (2009).</li><li>Momin, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designing+lipids+for+selective+partitioning+into+liquid+ordered+membrane+domains.">Designing lipids for selective partitioning into liquid ordered membrane domains.</a> Soft Matter. 11 (16), 3241-3250 (2015).</li><li>Fygenson, D. K., Braun, E., Libchaber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+diagram+of+microtubules.">Phase diagram of microtubules.</a> Physical Review E. 50, 1579 (1994).</li><li>Greene, A. C., Sasaki, D. Y., Bachand, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forming+Giant-sized+Polymersomes+Using+Gel-assisted+Rehydration.">Forming Giant-sized Polymersomes Using Gel-assisted Rehydration.</a> Journal of Visualized Experiments. (111), (2016).</li><li>Bachand, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+self-assembly+of+1D+microtubule+nano-arrays.">Directed self-assembly of 1D microtubule nano-arrays.</a> Royal Society of Chemistry Advances. 4 (97), 54641-54649 (2014).</li></ol>

LNTネットワークは、膜特性および膜貫通タンパク質などの生体分子の輸送に対するin vitro研究のための有用なツールである。さらに、複合脂質製剤を使用してLNTネットワークを製造することで、より生物学的に関連する研究が可能になります。他の作製研究は、1)単純な脂質製剤および多層状小胞、または2)複雑な脂質製剤からなるGUVからネットワークを作製するために、より厄介な運動性技?...

脂質ナノチューブ(LNT)ネットワークの作製は、非平衡脂質構造のインビトロ検査のための関心が高まっている1、2、3。細胞は、タンパク質4および核酸5の拡散輸送ならびに細胞間通信6,7のために脂質細管を使用する。小胞体およびゴルジ体装置は、これらの膜結合小器官が脂質およびタンパク質合成ならびに細胞の細胞質内のこれらの不可欠な生体分子の輸送のための主要な場所であるため、特に興味深い8,9。これらの細胞小器官の膜は、スフィンゴ脂質、コレステロール、およびリン脂質10を含む複数の脂質種で構成されており、最終的にそれらの機能を定義するのに役立つ。したがって、これらの細胞小器官をより密接に複製および研究するためには、インビトロLNTは、ますます複雑な脂質製剤11を有する小胞から作製されなければならない。
巨大な単層小胞(GUV)は、コレステロール、ホスファチジルコリン(PC)、ホスファチジルエタノールアミン(PE)、ホスファチジルセリン(PS)、およびホスファチジルイノシトール(PI)12,13を含む複雑な製剤で確実に合成できるため、脂質膜挙動を研究するために広く使用されている。ここで説明するのは、グライダー運動性アッセイ(GMA)を使用して、GUVから様々な脂質製剤を有するGUVからLNTを製造する方法であり、LNTは、キネシンモーターおよびGUVに作用する微小管フィラメントによって行われる作業に基づいて押し出される。このシステムでは、表面に吸着したキネシンモータータンパク質がビオチン化微小管を推進し、ATPの加水分解からの化学エネルギーを有用な仕事(具体的には、ビオチン化小胞からのLNTの押し出し)に変換します11。得られたLNTネットワークは、LNT形態の変化に対する脂質相の違いの影響を研究するためのモデルプラットフォームを提供する。
簡単に言えば、キネシンモータータンパク質は、カゼインを含む溶液中のフローチャンバに導入され、チャンバのガラス表面へのモータの吸着を可能にする。次に、ATPを含む溶液中のビオチン化微小管がチャンバ内を流れ、キネシンモーターに結合し、運動性を開始する。次いで、ストレプトアビジン溶液をチャンバーに導入し、微小管に非共有結合で結合させる。最後に、ビオチン化脂質を含むGUVをチャンバーに導入し、ストレプトアビジン被覆微小管に結合し、LNTを押し出して15〜30分間にわたって大規模なネットワークを形成する。この方法は、標準的な実験装置と試薬を使用して大規模で分岐したLNTネットワークを低コストで生成します11。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1071px;" width="1071">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:65px;width:328px;">100x/1.4 Numerical Aperture Oil Immersion Objective</td>
			<td style="width:104px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;">1-U2B836</td>
			<td style="width:520px;">Olympus UPlanSApo 100x/1.40 Oil Objective Infinity Corrected, RMS Thread 
			Working Distance 0.12mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">3.0 ND Filter</td>
			<td style="width:104px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Neutral Density Filter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">AMP-PNP</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A2647</td>
			<td>(&#946;,&#947;-imidoadenosine 5&#8242;-triphosphate)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">ATP</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A7699</td>
			<td>Adenosine 5&#39;-triphosphate disodium salt hydrate BioXtra</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:328px;">Brightline Pinkel DA/FI/TR/Cy5/Cy7-5X-A000 filter set</td>
			<td style="width:104px;">Semrock</td>
			<td style="width:119px;">LED-DA/FI/TR/Cy5/Cy7-5X-A-000</td>
			<td style="width:520px;"> 
			BrightLine Pinkel filter set, optimized for DAPI, FITC, TRITC, Cy5 &#38; Cy7 and other like fluorophores, illuminated with LED-based light sources</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Casein</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">22090</td>
			<td>Casein hydrolysate for microbiology</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Catalase</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C9322</td>
			<td>Catalase from Bovine Liver</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Chloroform</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">288306</td>
			<td>Chloroform anhydrous contains 0.5-1.0% ethanol as stabilizer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Cholesterol</td>
			<td style="width:104px;">Avanti</td>
			<td style="width:119px;">700000P</td>
			<td>cholesterol (ovine wool, &#62;98%) (powder)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:328px;">D-Glucose</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G7021</td>
			<td style="width:520px;">D-(+)-Glucose powder, BioReagent, suitable for cell culture, suitable for insect cell culture, suitable for plant cell culture, &#8805;99.5%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">DOPC</td>
			<td style="width:104px;">Avanti</td>
			<td style="width:119px;">850375C</td>
			<td>1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (in chloroform)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">DOPE-Biotin</td>
			<td style="width:104px;">Avanti</td>
			<td style="width:119px;">870282C</td>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(biotinyl) (sodium salt)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">DPPC</td>
			<td style="width:104px;">Avanti</td>
			<td style="width:119px;">850355P</td>
			<td>1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (powder)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">DPPE-Biotin</td>
			<td style="width:104px;">Avanti</td>
			<td style="width:119px;">870285P</td>
			<td>1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(biotinyl) (sodium salt)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">DTT</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">43816</td>
			<td>DL-Dithiothreitol solution 1 M</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:328px;">EGTA</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">E4378</td>
			<td style="width:520px;">EGTA, Egtazic acid, Ethylene-bis(oxyethylenenitrilo)tetraacetic acid, Glycol ether diamine tetraacetic acid</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:328px;">Glucose Oxidase</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G6125</td>
			<td style="width:520px;">Glucose Oxidase from Aspergillus niger 
			Type II, &#8805;10,000 units/g solid (without added oxygen)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Glycerol</td>
			<td style="width:104px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">G33</td>
			<td>Glycerol (Certified ACS), Fisher Chemical</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">GTP</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G8877</td>
			<td>Guanosine 5&#8242;-triphosphate sodium salt hydrate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">IX-81 Olympus Microscope</td>
			<td style="width:104px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>IX81 Inverted Microscope from Olympus</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">KOH</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">1050121000</td>
			<td>Potassium Hydroxide</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Magnesium Chloride</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M1028</td>
			<td>1.00 M magnesium chloride solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Orca Flash 4.0 Digital Camera</td>
			<td style="width:104px;">Hamamatsu</td>
			<td style="width:119px;">C13440-20CU</td>
			<td>ORCA-Flash 4.0 V3 Digital CMOS camera</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Oregon Green-DHPE</td>
			<td style="width:104px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">O12650</td>
			<td>Oregon Green 488 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Paclitaxel</td>
			<td style="width:104px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">P3456</td>
			<td>Paclitaxel (Taxol Equivalent) - for use in research only</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:328px;">PIPES</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P6757</td>
			<td style="width:520px;">1,4-Piperazinediethanesulfonic acid, Piperazine-1,4-bis(2-ethanesulfonic acid), Piperazine-N,N&#8242;-bis(2-ethanesulfonic acid)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:328px;">Texas Red-DHPE</td>
			<td style="width:104px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">T1395MP</td>
			<td style="width:520px;">Texas Red 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine, 
			Triethylammonium Salt</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Trolox</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">238813</td>
			<td>(&#177;)-6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Tubulin, Biotin</td>
			<td style="width:104px;">Cytoskeleton</td>
			<td style="width:119px;">T333P</td>
			<td>Tubulin protein (biotin) porcine brain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Tubulin, Hy-Lite 488</td>
			<td style="width:104px;">Cytoskeleton</td>
			<td style="width:119px;">TL488M</td>
			<td>Tubulin protein (fluorescent HiLyte 488) porcine brain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Tubulin, Unlabeled</td>
			<td style="width:104px;">Cytoskeleton</td>
			<td style="width:119px;">T240</td>
			<td>Tubulin protein porcine brain</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fabricating multi-component lipid nanotube networks using the gliding kinesin motility assay

脂質ナノチューブ(LNT)ネットワークは、真核細胞に見られるユビキタス脂質細管に関連する分子輸送および脂質生物物理学を研究するためのin vitroモデルシステムを表す。しかし、in vivo LNTは高度に非平衡な構造であり、化学エネルギーと分子モーターを組み立て、維持、再編成する必要があります。さらに、インビボLNTsの組成物は、複合体であり、複数の異なる脂質種からなる。LNTを押し出す典型的な方法は、時間と労力の両方を要し、巨大な脂質小胞からナノチューブを強制的に引き抜くために光学ピンセット、マイクロビーズ、およびマイクロピペットを必要とする。ここに提示されるのは、キネシン駆動微小管運動性を使用して巨大な単層小胞(GUV)から大規模なLNTネットワークが迅速に生成される滑空運動性アッセイ(GMA)のプロトコルです。この方法を使用して、LNTネットワークは、生物学的LNTの複雑さを模倣する幅広い脂質製剤から形成され、脂質生物物理学および膜関連輸送のin vitro研究にますます有用になる。さらに、この方法は、一般的に使用される実験装置を使用して、短時間(<30分)でLNTネットワークを確実に製造することができる。長さ、幅、脂質分配などのLNTネットワーク特性も、ネットワークの構築に使用されるGUVの脂質組成を変更することによって調整可能です。

LNTネットワーク(図4)は、微小管のキネシン輸送によって実行される作業を使用して、GUVからLNTを押し出すために記載されたプロトコルを使用して製造されました。簡単に説明すると、GUVsは、スクロース溶液を用いたアガロースゲル再水和を用いて調製され、微小管は、GPEM溶液中で重合され、BRB80T中で安定化された。次に、キネシンモータをフローセルに導入し、カバ?...

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Fabricating Multi-Component Lipid Nanotube Networks Using the Gliding Kinesin Motility Assay

このプロトコルは、巨大な単層脂質小胞と組み合わせて滑空キネシン運動性を使用して脂質ナノチューブネットワークを作製するためのプロセスを記載している。

グライダーキネシン運動性アッセイを用いた多成分脂質ナノチューブネットワークの構築

Lipid nanotube (LNT) networks represent an in vitro model system for studying molecular transport and lipid biophysics with relevance to the ubiquitous ...

このプロトコルは、個々のナノチューブが親小胞の相分離挙動に類似した相分離挙動を示す大規模な脂質ナノチューブネットワークの単純な生成を可能にする。このアプローチの主な利点は、分子モーターによって行われる作業を取り入れて、脂質ナノチューブを高度に並列的に、人間の介入なしに自己組織化することです。滑空運動性アッセイを設定するには、まず、5ミリメートル離れたスライドガラスに3組の両面テープストリップを貼り付けます。カバースリップをテープに静かに押し付け、調製したフローセルに30マイクロリットルの1マイクロモルのキネシン溶液を加える。5分後、30マイクロリットルの10マイクログラム/ミリリットル微小管溶液を細胞に加え、溶液交換を容易にするために流路の反対側の端に実験室ワイプを穏やかに押し当てる。さらに5分間のインキュベーションの後、30マイクロリットルの10マイクログラム/ミリリットルのストレプトアビジン溶液をフローセルに加える前に、洗浄ごとに50マイクロリットルの室温運動性溶液で細胞を1〜3回洗浄する。10分後、30マイクロリットルの10X GUV溶液を加え、室温で30分間インキュベートする。次に、100ミリモルのAMP-PNP溶液を2マイクロリットル加え、シーラントでチャンバーを閉じます。フローチャンバをイメージング用の倒立顕微鏡に移し、適切なフィルタセットを選択します。100Xオイル対物レンズを使用して、まずカバースリップの表面に焦点を合わせてから、目的のネットワークの画像を取得します。次に、ImageJ で画像を開き、「画像」、「カラー」、「合成」をクリックして、赤と緑のチャンネルを重ね合わせて合成画像を作成します。イメージング後、目的の画像を開き、[分析とスケールの設定]をクリックして、顕微鏡のスケールを校正します。ピクセルをマイクロメーター変換係数に入力し、「OK」をクリックします。マルチポイントラインツールを使用して、親GUVから始まるナノチューブをトレースし、CtrlとMを長押しして長さを測定します。画像処理ツールは、新しい各測定値を結果ウィンドウに保存します。すべてのチューブが測定されたら、「画像」、「調整」、「しきい値」を選択し、「適用」をクリックしてしきい値を適用します。次に、目的のチューブの上に既知の長さの長方形を描きます。領域の積分密度を測定するには、[分析と測定]をクリックして液体ナノチューブノードの脂質分配を決定し、線ツールを使用して目的のノードに線を引き、緑と赤の両方のチャネルでノード強度を測定します。この代表的な分析では、液体ナノチューブネットワークは、液体無秩序で秩序のある相、ならびに相分離された小胞を生成することが実証されたように作製された。例えば、45%飽和脂質および55%不飽和脂質で合成された小胞は、共存する液体無秩序相および固相に分離する小胞をもたらす。しかし、コレステロールを含めると、液液の共存が観察され、共存する液体秩序相と液体無秩序相に分離するGUVが生成される。さらに、節は相分離混合物内で観察することができる。覚えておくべき最も重要なことは、フルオロフォアを光退色することなく脂質ナノチューブを視覚化できるように、適切な露光時間とNDフィルターセットを選択することです。脂質ナノチューブの相挙動の組成を調整することで、最小限のモデルシステムを使用して、細胞をつなぐトンネルナノチューブの生物物理学の研究を開始することができます。

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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