Name: fabricating multi-component lipid nanotube networks using the gliding kinesin motility assay
Uploaded: 2021-07-26T13:00:00
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이 작업은 미국 에너지부, 기본 에너지 과학 사무소, 재료 과학 및 엔지니어링 부서 (BES-MSE)의 지원을 받았습니다. Kinesin 합성 및 형광 현미경 검사는 미국 에너지부 (DOE) 과학 사무소에서 운영되는 과학 사용자 시설 인 통합 나노 기술 센터 (Center for Integrated Nanotechnologies)의 사용자 프로젝트 (ZIM)를 통해 수행되었습니다.

1. 재고 미세소관 용액의 제조
주의: 안전 고글, 장갑 및 실험실 코트는 항상 프로토콜 전체에서 착용해야 합니다.
<ol><li>5x BRB80 버퍼를 준비하십시오: 24.19 g의 파이프(피페라진-N,N'-비스[2-에탄설폰산])와 0.38g의 EGTA(에틸렌 글리콜-비스[β-아미노에틸 에테르]-N,N,N',N'-테트라아세트산)를 1L 유리 병에 넣으십시오. 1 mL의 1 MMgCl2 를 첨가하고, KOH로 pH를 6.9로 조정하였다. 탈?...

<ol>
	<li>Bouxsein, N. F., Carroll-Portillo, A., Bachand, M., Sasaki, D. Y., Bachand, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+continuous+network+of+lipid+nanotubes+fabricated+from+the+gliding+motility+of+kinesin+powered+microtubule+filaments.">A continuous network of lipid nanotubes fabricated from the gliding motility of kinesin powered microtubule filaments.</a> Langmuir. 29 (9), 2992-2999 (2013).</li><li>Paxton, W. F., Bouxsein, N. F., Henderson, I. M., Gomez, A., Bachand, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+assembly+of+polymer+nanotube+networks+via+kinesin+powered+microtubule+filaments.">Dynamic assembly of polymer nanotube networks via kinesin powered microtubule filaments.</a> Nanoscale. 7 (25), 10998-11004 (2015).</li><li>Leduc, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperative+extraction+of+membrane+nanotubes+by+molecular+motors.">Cooperative extraction of membrane nanotubes by molecular motors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (49), 17096-17101 (2004).</li><li>Lippincott-Schwartz, J., Roberts, T. H., Hirschberg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secretory+protein+trafficking+and+organelle+dynamics+in+living+cells.">Secretory protein trafficking and organelle dynamics in living cells.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 16, 557-589 (2000).</li><li>Belting, M., Wittrup, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanotubes,+exosomes,+and+nucleic+acid-binding+peptides+provide+novel+mechanisms+of+intercellular+communication+in+eukaryotic+cells:+implications+in+health+and+disease.">Nanotubes, exosomes, and nucleic acid-binding peptides provide novel mechanisms of intercellular communication in eukaryotic cells: implications in health and disease.</a> Journal of Cell Biology. 183 (7), 1187-1191 (2008).</li><li>Rustom, A., Saffrich, R., Markovic, I., Walther, P., Gerdes, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanotubular+highways+for+intercellular+organelle+transport.">Nanotubular highways for intercellular organelle transport.</a> Science. 303 (5660), 1007-1010 (2004).</li><li>Onfelt, B., Nedvetzki, S., Yanagi, K., Davis, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutting+edge:+Membrane+nanotubes+connect+immune+cells.">Cutting edge: Membrane nanotubes connect immune cells.</a> Journal of Immunology. 173 (3), 1511-1513 (2004).</li><li>Sciaky, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Golgi+tubule+traffic+and+the+effects+of+brefeldin+A+visualized+in+living+cells.">Golgi tubule traffic and the effects of brefeldin A visualized in living cells.</a> J Cell Biol. 139 (5), 1137-1155 (1997).</li><li>Sprong, H., van der Sluijs, P., van Meer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+proteins+move+lipids+and+lipids+move+proteins.">How proteins move lipids and lipids move proteins.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2 (7), 504-513 (2001).</li><li>Keenan, T. W., Morre, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospholipid+class+and+fatty+acid+composition+of+golgi+apparatus+isolated+from+rat+liver+and+comparison+with+other+cell+fractions.">Phospholipid class and fatty acid composition of golgi apparatus isolated from rat liver and comparison with other cell fractions.</a> Biochemistry. 9 (1), 19-25 (1970).</li><li>Imam, Z. I., Bachand, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicomponent+and+Multiphase+Lipid+Nanotubes+Formed+by+Gliding+Microtubule-Kinesin+Motility+and+Phase-Separated+Giant+Unilamellar+Vesicles.">Multicomponent and Multiphase Lipid Nanotubes Formed by Gliding Microtubule-Kinesin Motility and Phase-Separated Giant Unilamellar Vesicles.</a> Langmuir. 35 (49), 16281-16289 (2019).</li><li>Wesolowska, O., Michalak, K., Maniewska, J., Hendrich, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Giant+unilamellar+vesicles+-+a+perfect+tool+to+visualize+phase+separation+and+lipid+rafts+in+model+systems.">Giant unilamellar vesicles - a perfect tool to visualize phase separation and lipid rafts in model systems.</a> Acta Biochimica Polonica. 56 (1), 33-39 (2009).</li><li>Momin, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designing+lipids+for+selective+partitioning+into+liquid+ordered+membrane+domains.">Designing lipids for selective partitioning into liquid ordered membrane domains.</a> Soft Matter. 11 (16), 3241-3250 (2015).</li><li>Fygenson, D. K., Braun, E., Libchaber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+diagram+of+microtubules.">Phase diagram of microtubules.</a> Physical Review E. 50, 1579 (1994).</li><li>Greene, A. C., Sasaki, D. Y., Bachand, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forming+Giant-sized+Polymersomes+Using+Gel-assisted+Rehydration.">Forming Giant-sized Polymersomes Using Gel-assisted Rehydration.</a> Journal of Visualized Experiments. (111), (2016).</li><li>Bachand, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+self-assembly+of+1D+microtubule+nano-arrays.">Directed self-assembly of 1D microtubule nano-arrays.</a> Royal Society of Chemistry Advances. 4 (97), 54641-54649 (2014).</li></ol>

LNT 네트워크는 막횡단 단백질과 같은 생체분자의 특성 및 수송에 대한 시험관내 연구에 유용한 도구이다. 또한, LNT 네트워크를 제조하기 위해 복잡한 지질 제제를 사용하는 것은 생물학적으로 더 관련성이 높은 연구를 가능하게 한다. 다른 제조 연구는 1) 단순 지질 제제 및 다중 라멜라 소포 또는 2) 복잡한 지질 제형으로 구성된 GUV의 네트워크를 제조하기 위해보다 성가신 운동성 기술을 사용했?...

지질 나노튜브(LNT) 네트워크의 제작은 비평형 지질 구조 1,2,3의 시험관내 검사에 대한 관심이 증가하고 있다. 세포는 단백질(4)과 핵산(5)의 확산 수송뿐만 아니라 세포-세포간 통신(6,7)을 위해 지질 세관을 사용한다. 소포체 및 골지 장치는 특히 흥미로운데, 이러한 막-결합된 소기관은 지질 및 단백질 합성을 위한 주요 위치일 뿐만 아니라 세포의 세포질 내에서 이들 필수적인 생체분자의 수송을 위한 주요 위치이기 때문이다8,9. 이들 소기관의 막은 궁극적으로 그들의 기능을 정의하는 데 도움이 되는 스핑고지질, 콜레스테롤 및 인지질(10)을 포함하는 다수의 지질 종으로 구성된다. 따라서, 이들 소기관을 보다 밀접하게 복제하고 연구하기 위해, 시험관내 LNT는 점점 더 복잡한 지질 제형(11)을 갖는 소포로부터 제조되어야 한다.
거대 유니라멜라 소포(GUVs)는 콜레스테롤, 포스파티딜콜린(PC), 포스파티딜에탄올아민(PE), 포스파티딜세린(PS) 및 포스파티딜이노시톨(PI)12,13을 포함하는 복잡한 제형으로 안정적으로 합성될 수 있기 때문에 지질막 거동을 연구하는 데 널리 사용됩니다. 여기에 설명 된 것은 글라이딩 운동성 분석 (GMA)을 사용하여 다양한 지질 제형을 가진 GUVs에서 LNT를 제조하는 방법이며, LNT는 GUV에 작용하는 키네신 모터 및 미세 소관 필라멘트에 의해 수행 된 작업을 기반으로 압출됩니다. 이 시스템에서, 표면에 흡착된 키네신 모터 단백질은 비오티닐화된 미세소관을 추진하여, ATP의 가수분해로부터 화학 에너지를 유용한 작업(특히, 비오티닐화 소포로부터 LNT의 압출)으로 변환한다11. 생성된 LNT 네트워크는 LNT 형태학의 변화에 대한 지질 위상의 차이의 영향을 연구하기 위한 모델 플랫폼을 제공한다.
간략하게, 키네신 모터 단백질은 카제인을 함유하는 용액의 유동 챔버 내로 도입되며, 이는 챔버의 유리 표면 상으로의 모터의 흡착을 가능하게 한다. 다음으로, ATP를 함유하는 용액 중의 비오티닐화된 미세소관은 챔버를 통해 유동하고 키네신 모터에 결합하고 운동성을 시작하도록 허용된다. 그런 다음 스트렙타비딘 용액을 챔버 내로 도입하고 미세 소관에 비공유적으로 결합하도록 허용한다. 마지막으로, 비오티닐화 지질을 함유하는 GUVs를 챔버 내로 도입하고 스트렙타비딘 코팅된 미세소관에 결합시킨 다음, LNT를 압출하여 15-30분 동안 대규모 네트워크를 형성한다. 이 방법은 표준 실험실 장비 및 시약을 사용하여 대규모 분기 LNT 네트워크를 저렴한 비용으로 생산합니다11.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1071px;" width="1071">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:65px;width:328px;">100x/1.4 Numerical Aperture Oil Immersion Objective</td>
			<td style="width:104px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;">1-U2B836</td>
			<td style="width:520px;">Olympus UPlanSApo 100x/1.40 Oil Objective Infinity Corrected, RMS Thread 
			Working Distance 0.12mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">3.0 ND Filter</td>
			<td style="width:104px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Neutral Density Filter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">AMP-PNP</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A2647</td>
			<td>(&#946;,&#947;-imidoadenosine 5&#8242;-triphosphate)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">ATP</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A7699</td>
			<td>Adenosine 5&#39;-triphosphate disodium salt hydrate BioXtra</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:328px;">Brightline Pinkel DA/FI/TR/Cy5/Cy7-5X-A000 filter set</td>
			<td style="width:104px;">Semrock</td>
			<td style="width:119px;">LED-DA/FI/TR/Cy5/Cy7-5X-A-000</td>
			<td style="width:520px;"> 
			BrightLine Pinkel filter set, optimized for DAPI, FITC, TRITC, Cy5 &#38; Cy7 and other like fluorophores, illuminated with LED-based light sources</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Casein</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">22090</td>
			<td>Casein hydrolysate for microbiology</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Catalase</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C9322</td>
			<td>Catalase from Bovine Liver</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Chloroform</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">288306</td>
			<td>Chloroform anhydrous contains 0.5-1.0% ethanol as stabilizer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Cholesterol</td>
			<td style="width:104px;">Avanti</td>
			<td style="width:119px;">700000P</td>
			<td>cholesterol (ovine wool, &#62;98%) (powder)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:328px;">D-Glucose</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G7021</td>
			<td style="width:520px;">D-(+)-Glucose powder, BioReagent, suitable for cell culture, suitable for insect cell culture, suitable for plant cell culture, &#8805;99.5%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">DOPC</td>
			<td style="width:104px;">Avanti</td>
			<td style="width:119px;">850375C</td>
			<td>1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (in chloroform)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">DOPE-Biotin</td>
			<td style="width:104px;">Avanti</td>
			<td style="width:119px;">870282C</td>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(biotinyl) (sodium salt)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">DPPC</td>
			<td style="width:104px;">Avanti</td>
			<td style="width:119px;">850355P</td>
			<td>1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (powder)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">DPPE-Biotin</td>
			<td style="width:104px;">Avanti</td>
			<td style="width:119px;">870285P</td>
			<td>1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(biotinyl) (sodium salt)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">DTT</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">43816</td>
			<td>DL-Dithiothreitol solution 1 M</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:328px;">EGTA</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">E4378</td>
			<td style="width:520px;">EGTA, Egtazic acid, Ethylene-bis(oxyethylenenitrilo)tetraacetic acid, Glycol ether diamine tetraacetic acid</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:328px;">Glucose Oxidase</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G6125</td>
			<td style="width:520px;">Glucose Oxidase from Aspergillus niger 
			Type II, &#8805;10,000 units/g solid (without added oxygen)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Glycerol</td>
			<td style="width:104px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">G33</td>
			<td>Glycerol (Certified ACS), Fisher Chemical</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">GTP</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G8877</td>
			<td>Guanosine 5&#8242;-triphosphate sodium salt hydrate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">IX-81 Olympus Microscope</td>
			<td style="width:104px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>IX81 Inverted Microscope from Olympus</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">KOH</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">1050121000</td>
			<td>Potassium Hydroxide</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Magnesium Chloride</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M1028</td>
			<td>1.00 M magnesium chloride solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Orca Flash 4.0 Digital Camera</td>
			<td style="width:104px;">Hamamatsu</td>
			<td style="width:119px;">C13440-20CU</td>
			<td>ORCA-Flash 4.0 V3 Digital CMOS camera</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Oregon Green-DHPE</td>
			<td style="width:104px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">O12650</td>
			<td>Oregon Green 488 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Paclitaxel</td>
			<td style="width:104px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">P3456</td>
			<td>Paclitaxel (Taxol Equivalent) - for use in research only</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:328px;">PIPES</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P6757</td>
			<td style="width:520px;">1,4-Piperazinediethanesulfonic acid, Piperazine-1,4-bis(2-ethanesulfonic acid), Piperazine-N,N&#8242;-bis(2-ethanesulfonic acid)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:328px;">Texas Red-DHPE</td>
			<td style="width:104px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">T1395MP</td>
			<td style="width:520px;">Texas Red 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine, 
			Triethylammonium Salt</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Trolox</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">238813</td>
			<td>(&#177;)-6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Tubulin, Biotin</td>
			<td style="width:104px;">Cytoskeleton</td>
			<td style="width:119px;">T333P</td>
			<td>Tubulin protein (biotin) porcine brain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Tubulin, Hy-Lite 488</td>
			<td style="width:104px;">Cytoskeleton</td>
			<td style="width:119px;">TL488M</td>
			<td>Tubulin protein (fluorescent HiLyte 488) porcine brain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Tubulin, Unlabeled</td>
			<td style="width:104px;">Cytoskeleton</td>
			<td style="width:119px;">T240</td>
			<td>Tubulin protein porcine brain</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fabricating multi-component lipid nanotube networks using the gliding kinesin motility assay

지질 나노튜브(LNT) 네트워크는 진핵 세포에서 발견되는 유비쿼터스 지질 세관과 관련성이 있는 분자 수송 및 지질 생물물리학을 연구하기 위한 시험관내 모델 시스템을 나타낸다. 그러나 생체 내 LNT는 화학 에너지와 분자 모터를 조립, 유지 및 재구성해야하는 매우 비평형 구조입니다. 또한, 생체내 LNTs의 조성은 다수의 상이한 지질 종들로 구성된 복합체이다. LNT를 압출하는 일반적인 방법은 시간과 노동 집약적이며, 거대한 지질 소포에서 나노 튜브를 강제로 끌어 오기 위해 광학 핀셋, 마이크로 비드 및 마이크로 피펫이 필요합니다. 여기에 제시된 것은 글라이딩 운동성 분석 (GMA)을위한 프로토콜이며, 대규모 LNT 네트워크는 키네신 구동 미세 소관 운동성을 사용하여 거대한 unilamellar vesicles (GUVs)에서 빠르게 생성됩니다. 이 방법을 사용하여, LNT 네트워크는 생물학적 LNT의 복잡성을 모방하는 광범위한 지질 제형으로 형성되어, 지질 생물물리학 및 막 관련 수송의 시험관내 연구에 점점 더 유용하게 된다. 또한이 방법은 일반적으로 사용되는 실험실 장비를 사용하여 단시간 (<30 분) 내에 LNT 네트워크를 안정적으로 생산할 수 있습니다. 길이, 폭 및 지질 분할과 같은 LNT 네트워크 특성도 네트워크 제조에 사용되는 GUV의 지질 구성을 변경하여 조정할 수 있습니다.

LNT 네트워크(그림 4)는 GUV로부터 LNT를 밀어내기 위해 미세소관의 키네신 수송에 의해 수행된 작업을 사용하는 설명된 프로토콜을 사용하여 제작되었다. 간략하게, GUVs는 수크로오스 용액을 사용하여 재수화된 아가로스 겔을 사용하여 제조되었고, 미세소관은 GPEM 용액에서 중합되고 BRB80T에서 안정화되었다. 다음으로, kinesin 모터를 유동 셀에 도입하여 커버슬립 표면에 모터?...

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Fabricating Multi-Component Lipid Nanotube Networks Using the Gliding Kinesin Motility Assay

이 프로토콜은 거대한 유니라멜라 지질 소포와 함께 글라이딩 키네신 운동성을 사용하여 지질 나노튜브 네트워크를 제조하는 과정을 기술한다.

글라이딩 키네신 운동성 분석을 이용한 다성분 지질 나노튜브 네트워크 제작

Lipid nanotube (LNT) networks represent an in vitro model system for studying molecular transport and lipid biophysics with relevance to the ubiquitous ...

이 프로토콜은 개별 나노튜브가 모 소포와 유사한 위상 분리 거동을 표시하는 대규모 지질 나노튜브 네트워크의 간단한 생성을 허용한다. 이 접근법의 주요 장점은 인간의 개입없이 지질 나노 튜브를 매우 평행 한 방식으로 자체 조립하기 위해 분자 모터가 수행 한 작업을 공동 선택한다는 것입니다. 글라이딩 운동성 분석을 설정하려면 먼저 다섯 밀리미터 떨어진 유리 슬라이드에 양면 테이프 스트립 세 세트를 부착하십시오.커버 슬립을 테이프 위로 부드럽게 누르고 30 마이크로리터의 일마이크로몰 키네신 용액을 준비된 플로우 셀에 첨가한다. 5분 후, 30마이크로리터의 10마이크로그램/밀리리터 마이크로소관 용액을 세포에 넣고 실험실을 눌러 유동 채널의 반대쪽 끝을 부드럽게 닦아내어 용액 교환을 용이하게 합니다. 또 다른 5분 인큐베이션 후, 30 마이크로리터의 10마이크로그램/밀리리터 스트렙타비딘 용액을 유동 세포에 첨가하기 전에 세척당 50 마이크로리터의 실온 운동성 용액으로 세포를 1 내지 3회 세척한다.10분 후, 30 마이크로리터의 10X GUV 용액을 첨가하여 실온에서 30분간 인큐베이션하였다. 그런 다음 100 밀리몰 AMP-PNP 용액 두 마이크로 리터를 추가하고 실란트로 챔버를 닫으십시오. 이미징을 위해 유동 챔버를 거꾸로 된 현미경으로 옮기고 적절한 필터 세트를 선택하십시오.100X 오일 목표를 사용하여 관심 네트워크의 이미지를 얻기 전에 커버 슬립의 표면을 먼저 집중시킵니다. 그런 다음 ImageJ에서 이미지를 열고 이미지, 색상 및 컴포지트를 클릭하여 빨강 및 녹색 채널을 오버레이하여 합성 이미지를 만듭니다. 이미징 후 관심 있는 이미지를 열고 분석 및 배율 설정을 클릭하여 현미경의 눈금을 보정합니다.픽셀을 마이크로미터 변환 계수로 채우고 확인을 클릭합니다. 다중 포인트 라인 도구를 사용하여 부모 GUV에서 시작하는 나노 튜브를 추적하고 Control 및 M을 길게 눌러 길이를 측정하십시오. 이미지 처리 도구는 각각의 새로운 측정을 결과 창에 저장합니다. 모든 튜브가 측정되면 이미지, 조정 및 임계값을 선택하고 적용을 클릭하여 임계값을 적용합니다.그런 다음 원하는 튜브 위에 알려진 길이의 사각형을 그립니다. 영역의 집적 밀도를 측정하려면 분석 및 측정을 클릭하여 액체 나노튜브 노드의 지질 분할을 결정하고 선 도구를 사용하여 관심 노드 위에 선을 그리고 녹색과 빨간색 채널 모두에서 노드 강도를 측정합니다. 이 대표적인 분석에서, 액체 나노튜브 네트워크는 액체 무질서 및 순서화된 상뿐만 아니라 상-분리된 소포를 생성하는 것으로 입증된 바와 같이 제작되었다.예를 들어, 45 %의 포화 지질 및 55 % 불포화 지질로 합성 된 소포는 공존하는 액체 무질서 및 고체상으로 분리되는 소포를 초래합니다. 그러나 콜레스테롤이 포함되면 액체 - 액체 공존이 관찰 될 수 있으며, 공존하는 액체 순서 및 액체 무질서 단계로 분리되는 GUV를 생성합니다. 더욱이, 노드는 상-분리된 혼합물 내에서 관찰될 수 있다.기억해야 할 가장 중요한 것은 형광단을 광표백하지 않고 지질 나노튜브를 시각화할 수 있도록 적절한 노출 시간 및 ND 필터 세트를 선택하는 것이다. 지질 나노 튜브의 위상 거동 구성을 조정하면 최소한의 모델 시스템을 사용하여 세포를 연결하는 터널링 나노 튜브의 생물 물리학 연구를 시작할 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Plasma Lithography Surface Patterning for Creation of Cell Networks

세포 네트워크의 창조를위한 플라즈마 리소그래피 표면 Patterning

Systematic manipulation of a cell microenvironment with micro- and nanoscale resolution is often required for deciphering various cellular and molecular ...

연구

생체공학

Flexural Rigidity Measurements of Biopolymers Using Gliding Assays

글라이딩 Assays를 사용 Biopolymers의 굽힘 강성 측정

Microtubules are cytoskeletal polymers which  play a role in cell division, cell mechanics, and intracellular transport. Each of these functions requires ...

Generation of Shear Adhesion Map Using SynVivo Synthetic Microvascular Networks

SynVivo 합성 미세 혈관의 네트워크를 사용하여 전단 접착지도의 생성

Cell/particle adhesion assays are critical to understanding the biochemical interactions involved in disease pathophysiology and have important ...

Electric Cell-substrate Impedance Sensing for the Quantification of Endothelial Proliferation, Barrier Function, and Motility

Electric Cell-substrate Impedance Sensing (ECIS) is an in vitro impedance measuring system to quantify the behavior of cells within adherent cell layers. ...

Lipid Bilayer Vesicle Generation Using Microfluidic Jetting

미세 유체 제트를 사용하여 지질 이중층 소포 세대

Bottom-up synthetic biology presents a novel approach for investigating and reconstituting biochemical systems and, potentially, minimal organisms. This ...

Fabricating Complex Culture Substrates Using Robotic Microcontact Printing (R-&#181;CP) and Sequential Nucleophilic Substitution

Fabricating Complex Culture Substrates Using Robotic Microcontact Printing R-Ãƒâ€šÃ‚ÂµCP and Sequential Nucleophilic Substitution

로봇 미세 접촉 인쇄 (R-μCP)를 사용하여 복합 문화 기판 및 순차 친 핵성 치환 제조

In tissue engineering, it is desirable to exhibit spatial control of tissue morphology and cell fate in culture on the micron scale. Culture substrates ...

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer (SALB) Method

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer SALB Method

용매를 이용한 지질 이중층 (SALB) 방법에 의해 생체막 제작

In order to mimic cell membranes, the supported lipid bilayer (SLB) is an attractive platform which enables in vitro investigation of membrane-related ...

Solid Lipid Nanoparticles (SLNs) for Intracellular Targeting Applications

Solid Lipid Nanoparticles SLNs for Intracellular Targeting Applications

고체 지질 나노 입자 (SLNs) 세포 내 타겟팅을위한 응용 프로그램

Nanoparticle-based delivery vehicles have shown great promise for intracellular targeting applications, providing a mechanism to specifically alter ...

Fabricating Superhydrophobic Polymeric Materials for Biomedical Applications

바이오 메디컬 응용 프로그램에 대한 초 소수성 고분자 재료를 제조

Superhydrophobic materials, with surfaces possessing permanent or metastable non-wetted states, are of interest for a number of biomedical and industrial ...

Fabricating Cotton Analytical Devices

면 분석 장치를 제조

A robust, low-cost analytical device should be user-friendly, rapid, and affordable. Such devices should also be able to operate with scarce samples and ...