Name: fabricating multi-component lipid nanotube networks using the gliding kinesin motility assay
Uploaded: 2021-07-26T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fabricating Multi-Component Lipid Nanotube Networks Using the Gliding Kinesin Motility Assay at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av U.S. Department of Energy, Office of Basic Energy Sciences, Division of Materials Sciences and Engineering (BES-MSE). Kinesin syntese og fluorescensmikroskopi ble utført gjennom et brukerprosjekt (ZIM) ved Center for Integrated Nanotechnologies, et Office of Science User Facility som drives for U.S. Department of Energy (DOE) Office of Science.

1. Utarbeidelse av lagermikrotubulløsninger
FORSIKTIG: Vernebriller, hansker og labfrakk skal alltid brukes i hele protokollen.
<ol><li>Forbered 5x BRB80 buffer: tilsett 24,19 g RØR (piperazine-N,N′-bis[2-etesulfonsyre]) og 0,38 g EGTA (etylenglykol-bis[β-aminoetyl eter]-N,N,N,N′-tetraacetic acid) til en 1 L glassflaske. Tilsett 1 ml 1 M MgCl2 og juster pH til 6,9 med KOH. Tilsett deionisert vann for å bringe løsningen til et 500 ml sluttvolum.</li>
	<li>Forbered 100 mM l...

<ol>
	<li>Bouxsein, N. F., Carroll-Portillo, A., Bachand, M., Sasaki, D. Y., Bachand, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+continuous+network+of+lipid+nanotubes+fabricated+from+the+gliding+motility+of+kinesin+powered+microtubule+filaments.">A continuous network of lipid nanotubes fabricated from the gliding motility of kinesin powered microtubule filaments.</a> Langmuir. 29 (9), 2992-2999 (2013).</li><li>Paxton, W. F., Bouxsein, N. F., Henderson, I. M., Gomez, A., Bachand, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+assembly+of+polymer+nanotube+networks+via+kinesin+powered+microtubule+filaments.">Dynamic assembly of polymer nanotube networks via kinesin powered microtubule filaments.</a> Nanoscale. 7 (25), 10998-11004 (2015).</li><li>Leduc, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperative+extraction+of+membrane+nanotubes+by+molecular+motors.">Cooperative extraction of membrane nanotubes by molecular motors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (49), 17096-17101 (2004).</li><li>Lippincott-Schwartz, J., Roberts, T. H., Hirschberg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secretory+protein+trafficking+and+organelle+dynamics+in+living+cells.">Secretory protein trafficking and organelle dynamics in living cells.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 16, 557-589 (2000).</li><li>Belting, M., Wittrup, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanotubes,+exosomes,+and+nucleic+acid-binding+peptides+provide+novel+mechanisms+of+intercellular+communication+in+eukaryotic+cells:+implications+in+health+and+disease.">Nanotubes, exosomes, and nucleic acid-binding peptides provide novel mechanisms of intercellular communication in eukaryotic cells: implications in health and disease.</a> Journal of Cell Biology. 183 (7), 1187-1191 (2008).</li><li>Rustom, A., Saffrich, R., Markovic, I., Walther, P., Gerdes, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanotubular+highways+for+intercellular+organelle+transport.">Nanotubular highways for intercellular organelle transport.</a> Science. 303 (5660), 1007-1010 (2004).</li><li>Onfelt, B., Nedvetzki, S., Yanagi, K., Davis, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutting+edge:+Membrane+nanotubes+connect+immune+cells.">Cutting edge: Membrane nanotubes connect immune cells.</a> Journal of Immunology. 173 (3), 1511-1513 (2004).</li><li>Sciaky, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Golgi+tubule+traffic+and+the+effects+of+brefeldin+A+visualized+in+living+cells.">Golgi tubule traffic and the effects of brefeldin A visualized in living cells.</a> J Cell Biol. 139 (5), 1137-1155 (1997).</li><li>Sprong, H., van der Sluijs, P., van Meer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+proteins+move+lipids+and+lipids+move+proteins.">How proteins move lipids and lipids move proteins.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2 (7), 504-513 (2001).</li><li>Keenan, T. W., Morre, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospholipid+class+and+fatty+acid+composition+of+golgi+apparatus+isolated+from+rat+liver+and+comparison+with+other+cell+fractions.">Phospholipid class and fatty acid composition of golgi apparatus isolated from rat liver and comparison with other cell fractions.</a> Biochemistry. 9 (1), 19-25 (1970).</li><li>Imam, Z. I., Bachand, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicomponent+and+Multiphase+Lipid+Nanotubes+Formed+by+Gliding+Microtubule-Kinesin+Motility+and+Phase-Separated+Giant+Unilamellar+Vesicles.">Multicomponent and Multiphase Lipid Nanotubes Formed by Gliding Microtubule-Kinesin Motility and Phase-Separated Giant Unilamellar Vesicles.</a> Langmuir. 35 (49), 16281-16289 (2019).</li><li>Wesolowska, O., Michalak, K., Maniewska, J., Hendrich, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Giant+unilamellar+vesicles+-+a+perfect+tool+to+visualize+phase+separation+and+lipid+rafts+in+model+systems.">Giant unilamellar vesicles - a perfect tool to visualize phase separation and lipid rafts in model systems.</a> Acta Biochimica Polonica. 56 (1), 33-39 (2009).</li><li>Momin, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designing+lipids+for+selective+partitioning+into+liquid+ordered+membrane+domains.">Designing lipids for selective partitioning into liquid ordered membrane domains.</a> Soft Matter. 11 (16), 3241-3250 (2015).</li><li>Fygenson, D. K., Braun, E., Libchaber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+diagram+of+microtubules.">Phase diagram of microtubules.</a> Physical Review E. 50, 1579 (1994).</li><li>Greene, A. C., Sasaki, D. Y., Bachand, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forming+Giant-sized+Polymersomes+Using+Gel-assisted+Rehydration.">Forming Giant-sized Polymersomes Using Gel-assisted Rehydration.</a> Journal of Visualized Experiments. (111), (2016).</li><li>Bachand, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+self-assembly+of+1D+microtubule+nano-arrays.">Directed self-assembly of 1D microtubule nano-arrays.</a> Royal Society of Chemistry Advances. 4 (97), 54641-54649 (2014).</li></ol>

LNT-nettverk er et nyttig verktøy for in vitro-studier til membranegenskaper og transport av biomolekyler som transmembranproteiner. Videre muliggjør bruk av komplekse lipidformuleringer for å fremstille LNT-nettverk mer biologisk relevante studier. Andre fabrikasjonsstudier har brukt enten 1) enkle lipidformuleringer og multilamellar vesicles eller 2) mer tungvinte motilitetsteknikker for å fremstille nettverk fra GUVer som består av komplekse lipidformuleringer. Metoden som er beskrevet her muliggjør effektiv fab...

Fabrikasjonen av lipid nanorør (LNT) nettverk er av økende interesse for in vitro undersøkelse av nonequilibrium lipid strukturer 1,2,3. Celler bruker lipid tubuli for diffusiv transport av proteiner4 og nukleinsyrer5 samt celle-til-celle kommunikasjon 6,7. Det endoplasmatiske retikulum- og Golgi-apparatet er spesielt interessant, da disse membranbundne organellene er de primære stedene for lipid- og proteinsyntese samt transport av disse integrerte biomolekylene i cytoplasma i en celle 8,9. Membranene i disse organellene består av flere lipidarter, inkludert sphingolipids, kolesterol og fosfolipider10 som til slutt bidrar til å definere deres funksjonalitet. For å gjenskape og studere disse organellene nærmere, må in vitro LNTs fremstilles fra vesikler med stadig mer komplekse lipidformuleringer11.
Giant unilamellar vesikler (GUVs) brukes gjennomgripende for å studere lipidmembranadferd fordi de på en pålitelig måte kan syntetiseres med komplekse formuleringer som inkluderer kolesterol, fosfatidylkolin (PC), fosfatidyletanolamin (PE), fosfatidylserin (PS) og fosfafatidylinositol (PI)12,13. Beskrevet her er en metode for å fremstille LNTs fra GUVs med varierende lipidformuleringer ved hjelp av glidende motility analyse (GMA), der LNTs ekstruderes basert på arbeidet utført av kinesinmotorer og mikrotubule filamenter som virker på GUVs. I dette systemet adsorberte kinesinmotorproteiner til en overflate som driver biotinylerte mikrotubuler, og konverterer kjemisk energi fra hydrolysen av ATP til nyttig arbeid (spesielt ekstrudering av LNTs fra biotinylerte vesikler)11. Det resulterende LNT-nettverket gir en modellplattform for å studere effekter av forskjellene i lipidfaser på endringer i LNT-morfologi.
Kort sagt blir kinesinmotorproteiner introdusert i et strømningskammer i en løsning som inneholder kasein, noe som gjør det mulig å adsorpsjon av motorene på glassoverflaten av kammeret. Deretter biotinylerte mikrotubuler i en løsning som inneholder ATP-strømning gjennom kammeret og får lov til å binde seg til kinesinmotorene og begynne motilitet. En streptavidinløsning blir deretter introdusert i kammeret og tillatt å binde ikke-kovalent til mikrotubulene. Til slutt blir GUVer som inneholder en biotinylert lipid introdusert i kammeret og binder seg til de streptavidinbelagte mikrotubulene, og ekstruderer deretter LNTs for å danne store nettverk i løpet av 15-30 minutter. Denne metoden produserer store, forgrenede LNT-nettverk ved hjelp av standard laboratorieutstyr og reagenser til en lav pris11.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1071px;" width="1071">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:65px;width:328px;">100x/1.4 Numerical Aperture Oil Immersion Objective</td>
			<td style="width:104px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;">1-U2B836</td>
			<td style="width:520px;">Olympus UPlanSApo 100x/1.40 Oil Objective Infinity Corrected, RMS Thread 
			Working Distance 0.12mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">3.0 ND Filter</td>
			<td style="width:104px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Neutral Density Filter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">AMP-PNP</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A2647</td>
			<td>(&#946;,&#947;-imidoadenosine 5&#8242;-triphosphate)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">ATP</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A7699</td>
			<td>Adenosine 5&#39;-triphosphate disodium salt hydrate BioXtra</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:328px;">Brightline Pinkel DA/FI/TR/Cy5/Cy7-5X-A000 filter set</td>
			<td style="width:104px;">Semrock</td>
			<td style="width:119px;">LED-DA/FI/TR/Cy5/Cy7-5X-A-000</td>
			<td style="width:520px;"> 
			BrightLine Pinkel filter set, optimized for DAPI, FITC, TRITC, Cy5 &#38; Cy7 and other like fluorophores, illuminated with LED-based light sources</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Casein</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">22090</td>
			<td>Casein hydrolysate for microbiology</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Catalase</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C9322</td>
			<td>Catalase from Bovine Liver</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Chloroform</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">288306</td>
			<td>Chloroform anhydrous contains 0.5-1.0% ethanol as stabilizer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Cholesterol</td>
			<td style="width:104px;">Avanti</td>
			<td style="width:119px;">700000P</td>
			<td>cholesterol (ovine wool, &#62;98%) (powder)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:328px;">D-Glucose</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G7021</td>
			<td style="width:520px;">D-(+)-Glucose powder, BioReagent, suitable for cell culture, suitable for insect cell culture, suitable for plant cell culture, &#8805;99.5%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">DOPC</td>
			<td style="width:104px;">Avanti</td>
			<td style="width:119px;">850375C</td>
			<td>1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (in chloroform)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">DOPE-Biotin</td>
			<td style="width:104px;">Avanti</td>
			<td style="width:119px;">870282C</td>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(biotinyl) (sodium salt)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">DPPC</td>
			<td style="width:104px;">Avanti</td>
			<td style="width:119px;">850355P</td>
			<td>1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (powder)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">DPPE-Biotin</td>
			<td style="width:104px;">Avanti</td>
			<td style="width:119px;">870285P</td>
			<td>1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(biotinyl) (sodium salt)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">DTT</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">43816</td>
			<td>DL-Dithiothreitol solution 1 M</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:328px;">EGTA</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">E4378</td>
			<td style="width:520px;">EGTA, Egtazic acid, Ethylene-bis(oxyethylenenitrilo)tetraacetic acid, Glycol ether diamine tetraacetic acid</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:328px;">Glucose Oxidase</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G6125</td>
			<td style="width:520px;">Glucose Oxidase from Aspergillus niger 
			Type II, &#8805;10,000 units/g solid (without added oxygen)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Glycerol</td>
			<td style="width:104px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">G33</td>
			<td>Glycerol (Certified ACS), Fisher Chemical</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">GTP</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G8877</td>
			<td>Guanosine 5&#8242;-triphosphate sodium salt hydrate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">IX-81 Olympus Microscope</td>
			<td style="width:104px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>IX81 Inverted Microscope from Olympus</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">KOH</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">1050121000</td>
			<td>Potassium Hydroxide</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Magnesium Chloride</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M1028</td>
			<td>1.00 M magnesium chloride solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Orca Flash 4.0 Digital Camera</td>
			<td style="width:104px;">Hamamatsu</td>
			<td style="width:119px;">C13440-20CU</td>
			<td>ORCA-Flash 4.0 V3 Digital CMOS camera</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Oregon Green-DHPE</td>
			<td style="width:104px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">O12650</td>
			<td>Oregon Green 488 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Paclitaxel</td>
			<td style="width:104px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">P3456</td>
			<td>Paclitaxel (Taxol Equivalent) - for use in research only</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:328px;">PIPES</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P6757</td>
			<td style="width:520px;">1,4-Piperazinediethanesulfonic acid, Piperazine-1,4-bis(2-ethanesulfonic acid), Piperazine-N,N&#8242;-bis(2-ethanesulfonic acid)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:328px;">Texas Red-DHPE</td>
			<td style="width:104px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">T1395MP</td>
			<td style="width:520px;">Texas Red 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine, 
			Triethylammonium Salt</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Trolox</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">238813</td>
			<td>(&#177;)-6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Tubulin, Biotin</td>
			<td style="width:104px;">Cytoskeleton</td>
			<td style="width:119px;">T333P</td>
			<td>Tubulin protein (biotin) porcine brain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Tubulin, Hy-Lite 488</td>
			<td style="width:104px;">Cytoskeleton</td>
			<td style="width:119px;">TL488M</td>
			<td>Tubulin protein (fluorescent HiLyte 488) porcine brain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Tubulin, Unlabeled</td>
			<td style="width:104px;">Cytoskeleton</td>
			<td style="width:119px;">T240</td>
			<td>Tubulin protein porcine brain</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fabricating multi-component lipid nanotube networks using the gliding kinesin motility assay

Lipid nanorør (LNT) nettverk representerer et in vitro modellsystem for å studere molekylær transport og lipid biofysikk med relevans for allestedsnærværende lipid tubuli som finnes i eukaryote celler. In vivo LNTs er imidlertid svært likevektsstrukturer som krever at kjemisk energi og molekylære motorer monteres, vedlikeholdes og omorganiseres. Videre er sammensetningen av in vivo LNTs kompleks, bestående av flere forskjellige lipidarter. Typiske metoder for å ekstrudere LNTs er både tids- og arbeidskrevende, og de krever optiske pinsett, mikrober og mikropipetter for å tvinge nanorør fra gigantiske lipid vesikler. Presentert her er en protokoll for glidende motility analyse (GMA), der storskala LNT nettverk er raskt generert fra gigantiske unilamellar vesicles (GUVs) ved hjelp av kinesin-drevet mikrotubule motility. Ved hjelp av denne metoden dannes LNT-nettverk fra et bredt spekter av lipidformuleringer som etterligner kompleksiteten til biologiske LNTs, noe som gjør dem stadig mer nyttige for in vitro-studier av lipidbiofysikk og membranassosidig transport. I tillegg er denne metoden i stand til pålitelig produksjon av LNT-nettverk på kort tid (<30 min) ved hjelp av vanlig brukt laboratorieutstyr. LNT-nettverksegenskaper som lengde, bredde og lipidpartisjonering er også justerbare ved å endre lipidsammensetningen til GUVene som brukes til å fremstille nettverkene.

LNT-nettverk (figur 4) ble fremstilt ved hjelp av den beskrevne protokollen, som bruker arbeidet utført av kinesintransport av mikrotubuler for å ekstrudere LNTs fra GUVer. Kort sagt ble GUVs tilberedt ved hjelp av agarose gel rehydrering ved hjelp av sukroseoppløsning, og mikrotubuler ble polymerisert i GPEM-løsning og stabilisert i BRB80T. Deretter ble kinesinmotorer introdusert i en strømningscelle som danner et aktivt lag av motorer på overflaten av dekslene. Mikrotubuler ble deret...

Watch this Scientific Journal Video about Fabricating Multi-Component Lipid Nanotube Networks Using the Gliding Kinesin Motility Assay at JoVE.com

Fabricating Multi-Component Lipid Nanotube Networks Using the Gliding Kinesin Motility Assay

Denne protokollen beskriver en prosess for fremstilling av lipid nanorørnettverk ved hjelp av glidende kinesinmotilitet i forbindelse med gigantiske unilamellar lipid vesicles.

Fabrikasjon av Lipid Nanotube-nettverk med flere komponenter ved hjelp av Gliding Kinesin Motility Assay

Lipid nanotube (LNT) networks represent an in vitro model system for studying molecular transport and lipid biophysics with relevance to the ubiquitous ...

Denne protokollen tillater enkel generering av store lipid nanorørnettverk der de enkelte nanorørene viser faseseparasjonsatferd som ligner på foreldre vesicle. Den viktigste fordelen med denne tilnærmingen er at vi velger arbeidet som gjøres av molekylærmotorene for å selvmontere lipid nanorørene på en svært parallell måte og uten menneskelig inngrep. For å sette opp en glidende motility-analyse, først, fest tre sett med dobbeltsidige båndstrimler på et glasssklie fem millimeter fra hverandre.Trykk forsiktig en dekselglidning på båndet og tilsett 30 mikroliter av en enmikromolar kinesinløsning i den forberedte strømningscellen. Etter fem minutter legger du til 30 mikroliter av en mikrogram/milliliter mikrotubulløsning på 10 mikrogram/milliliter i cellen, og trykker forsiktig på en laboratorieserviett mot motsatt ende av strømningskanalen for å lette løsningsutvekslingen. Etter ytterligere fem minutters inkubasjon, vask cellen en til tre ganger med 50 mikroliter romtemperaturmotilitetsløsning per vask før du tilsetter 30 mikroliter 10-mikrogram / milliliter streptavidin-løsning til strømningscellen.Etter 10 minutter, tilsett 30 mikroliter av en 10X GUV-løsning for en 30 minutters inkubasjon ved romtemperatur. Tilsett deretter to mikroliter av en 100 millimolar AMP-PNP-løsning og lukk kammeret med tetningsmasse. Overfør strømningskammeret til et invertert mikroskop for avbildning, og velg riktig filtersett.Bruk et 100X oljemål for å fokusere først overflaten på dekkslippet før du kjøper et bilde av et nettverk av interesse. Deretter åpner du bildet i ImageJ og klikker Bilde, Farge og Sammensatt for å overlappe de røde og grønne kanalene for å opprette et sammensatt bilde. Etter avbildning åpner du bildet av interesse og klikker på Analyser og angi skala for å kalibrere skalaen for mikroskopet.Fyll ut pikslene til omregningsfaktoren for mikrometeret, og klikk OK. Bruk flerpunktslinjeverktøyet til å spore nanorørene fra foreldre-GUV og trykk og hold inne Kontroll og M for å måle lengden. Bildebehandlingsverktøyet lagrer hver nye måling i resultatvinduet. Når alle rørene er målt, velger du Bilde, Juster og Terskelverdi og klikker Bruk for å bruke terskelen.Tegn deretter et rektangel med kjent lengde over ønsket rør. For å måle den integrerte tettheten i området, klikk Analyser og mål For å bestemme lipidpartisjoneringen i de flytende nanorørnodene, bruk linjeverktøyet til å tegne en linje over interessenoden og måle nodeintensiteten i både de grønne og røde kanalene. I denne representative analysen ble flytende nanorørnettverk fremstilt som demonstrert for å generere væskeforstyrrelser og bestilte faser, samt fasedelte vesikler.Vesikler syntetisert med for eksempel 45% mettet lipid og 55% umettet lipid resulterer i vesikler som skiller seg ut i sameksistenserte væskeforstyrrelser og faste faser. Hvis kolesterol er inkludert, kan imidlertid væske-flytende sameksistens observeres, og skape GUVer som skiller seg ut i samtidige væskebestilte og væskeforstyrrelser. Videre kan noder observeres i de fasedelte blandingene.Det viktigste å huske er å velge riktig eksponeringstid og ND-filtersett for å kunne visualisere lipid nanorørene uten å bleke fluoroforene. Skreddersy sammensetningen av faseadferd av lipid nanorør gjør at vi kan bruke et minimalistisk modellsystem for å begynne å studere biofysikken til tunnel nanorørene som forbinder celler.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Plasma Lithography Surface Patterning for Creation of Cell Networks

Systematic manipulation of a cell microenvironment with micro- and nanoscale resolution is often required for deciphering various cellular and molecular ...

Flexural Rigidity Measurements of Biopolymers Using Gliding Assays

Microtubules are cytoskeletal polymers which  play a role in cell division, cell mechanics, and intracellular transport. Each of these functions requires ...

Generation of Shear Adhesion Map Using SynVivo Synthetic Microvascular Networks

Generering av skjæradhesjon Kart Bruke SynVivo Syntetisk mikrovaskulære Networks

Cell/particle adhesion assays are critical to understanding the biochemical interactions involved in disease pathophysiology and have important ...

Electric Cell-substrate Impedance Sensing for the Quantification of Endothelial Proliferation, Barrier Function, and Motility

Elektrisk Cell-substrat Impedans Sensing for kvantifisering av endotel Proliferation, barrierefunksjon, og Motilitet

Electric Cell-substrate Impedance Sensing (ECIS) is an in vitro impedance measuring system to quantify the behavior of cells within adherent cell layers. ...

Lipid Bilayer Vesicle Generation Using Microfluidic Jetting

Lipidbllag Vesikkel Generation Bruke Microfluidic Spyling

Bottom-up synthetic biology presents a novel approach for investigating and reconstituting biochemical systems and, potentially, minimal organisms. This ...

Fabricating Complex Culture Substrates Using Robotic Microcontact Printing (R-&#181;CP) and Sequential Nucleophilic Substitution

Fabricating Complex Culture Substrates Using Robotic Microcontact Printing R-Ãƒâ€šÃ‚ÂµCP and Sequential Nucleophilic Substitution

Fabrikere Komplekse Kultur Underlag Bruke Robotic mikro utskrift (R-μCP) og sekvensiell Nukleofil Innbytte

In tissue engineering, it is desirable to exhibit spatial control of tissue morphology and cell fate in culture on the micron scale. Culture substrates ...

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer (SALB) Method

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer SALB Method

Biomembranen Fabrication av Løsemiddel assistert lipidbilag (SalB) Metode

In order to mimic cell membranes, the supported lipid bilayer (SLB) is an attractive platform which enables in vitro investigation of membrane-related ...

Solid Lipid Nanoparticles (SLNs) for Intracellular Targeting Applications

Solid Lipid Nanoparticles SLNs for Intracellular Targeting Applications

Solid Lipid Nanopartikler (SLNs) for Intracellulær målretting Applications

Nanoparticle-based delivery vehicles have shown great promise for intracellular targeting applications, providing a mechanism to specifically alter ...

Fabricating Superhydrophobic Polymeric Materials for Biomedical Applications

Fabrikere superhydrophobic polymere materialer for Biomedical Applications

Superhydrophobic materials, with surfaces possessing permanent or metastable non-wetted states, are of interest for a number of biomedical and industrial ...

Fabricating Cotton Analytical Devices

Fabrikere Bomull Analytiske Devices

A robust, low-cost analytical device should be user-friendly, rapid, and affordable. Such devices should also be able to operate with scarce samples and ...