Name: fabricating multi-component lipid nanotube networks using the gliding kinesin motility assay
Uploaded: 2021-07-26T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fabricating Multi-Component Lipid Nanotube Networks Using the Gliding Kinesin Motility Assay at JoVE.com

Эта работа была поддержана Министерством энергетики США, Управлением фундаментальных энергетических наук, Отделом материаловедения и инженерии (BES-MSE). Синтез кинезина и флуоресцентная микроскопия были выполнены в рамках пользовательского проекта (ZIM) в Центре интегрированных нанотехнологий, пользовательском объекте Управления науки, управляемом для Управления науки Министерства энергетики США (DOE).

1. Приготовление стоковых растворов микротрубочек
ВНИМАНИЕ: Защитные очки, перчатки и лабораторное пальто должны всегда носиться на протяжении всего протокола.
<ol><li>Приготовьте 5x буфер BRB80: добавьте 24,19 г PIPES (пиперазин-N,N'-бис[2-этанесульфоновая кислота]) и 0,38 г EGTA (этиленг?...

<ol>
	<li>Bouxsein, N. F., Carroll-Portillo, A., Bachand, M., Sasaki, D. Y., Bachand, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+continuous+network+of+lipid+nanotubes+fabricated+from+the+gliding+motility+of+kinesin+powered+microtubule+filaments.">A continuous network of lipid nanotubes fabricated from the gliding motility of kinesin powered microtubule filaments.</a> Langmuir. 29 (9), 2992-2999 (2013).</li><li>Paxton, W. F., Bouxsein, N. F., Henderson, I. M., Gomez, A., Bachand, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+assembly+of+polymer+nanotube+networks+via+kinesin+powered+microtubule+filaments.">Dynamic assembly of polymer nanotube networks via kinesin powered microtubule filaments.</a> Nanoscale. 7 (25), 10998-11004 (2015).</li><li>Leduc, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperative+extraction+of+membrane+nanotubes+by+molecular+motors.">Cooperative extraction of membrane nanotubes by molecular motors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (49), 17096-17101 (2004).</li><li>Lippincott-Schwartz, J., Roberts, T. H., Hirschberg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secretory+protein+trafficking+and+organelle+dynamics+in+living+cells.">Secretory protein trafficking and organelle dynamics in living cells.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 16, 557-589 (2000).</li><li>Belting, M., Wittrup, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanotubes,+exosomes,+and+nucleic+acid-binding+peptides+provide+novel+mechanisms+of+intercellular+communication+in+eukaryotic+cells:+implications+in+health+and+disease.">Nanotubes, exosomes, and nucleic acid-binding peptides provide novel mechanisms of intercellular communication in eukaryotic cells: implications in health and disease.</a> Journal of Cell Biology. 183 (7), 1187-1191 (2008).</li><li>Rustom, A., Saffrich, R., Markovic, I., Walther, P., Gerdes, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanotubular+highways+for+intercellular+organelle+transport.">Nanotubular highways for intercellular organelle transport.</a> Science. 303 (5660), 1007-1010 (2004).</li><li>Onfelt, B., Nedvetzki, S., Yanagi, K., Davis, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutting+edge:+Membrane+nanotubes+connect+immune+cells.">Cutting edge: Membrane nanotubes connect immune cells.</a> Journal of Immunology. 173 (3), 1511-1513 (2004).</li><li>Sciaky, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Golgi+tubule+traffic+and+the+effects+of+brefeldin+A+visualized+in+living+cells.">Golgi tubule traffic and the effects of brefeldin A visualized in living cells.</a> J Cell Biol. 139 (5), 1137-1155 (1997).</li><li>Sprong, H., van der Sluijs, P., van Meer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+proteins+move+lipids+and+lipids+move+proteins.">How proteins move lipids and lipids move proteins.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2 (7), 504-513 (2001).</li><li>Keenan, T. W., Morre, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospholipid+class+and+fatty+acid+composition+of+golgi+apparatus+isolated+from+rat+liver+and+comparison+with+other+cell+fractions.">Phospholipid class and fatty acid composition of golgi apparatus isolated from rat liver and comparison with other cell fractions.</a> Biochemistry. 9 (1), 19-25 (1970).</li><li>Imam, Z. I., Bachand, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicomponent+and+Multiphase+Lipid+Nanotubes+Formed+by+Gliding+Microtubule-Kinesin+Motility+and+Phase-Separated+Giant+Unilamellar+Vesicles.">Multicomponent and Multiphase Lipid Nanotubes Formed by Gliding Microtubule-Kinesin Motility and Phase-Separated Giant Unilamellar Vesicles.</a> Langmuir. 35 (49), 16281-16289 (2019).</li><li>Wesolowska, O., Michalak, K., Maniewska, J., Hendrich, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Giant+unilamellar+vesicles+-+a+perfect+tool+to+visualize+phase+separation+and+lipid+rafts+in+model+systems.">Giant unilamellar vesicles - a perfect tool to visualize phase separation and lipid rafts in model systems.</a> Acta Biochimica Polonica. 56 (1), 33-39 (2009).</li><li>Momin, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designing+lipids+for+selective+partitioning+into+liquid+ordered+membrane+domains.">Designing lipids for selective partitioning into liquid ordered membrane domains.</a> Soft Matter. 11 (16), 3241-3250 (2015).</li><li>Fygenson, D. K., Braun, E., Libchaber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+diagram+of+microtubules.">Phase diagram of microtubules.</a> Physical Review E. 50, 1579 (1994).</li><li>Greene, A. C., Sasaki, D. Y., Bachand, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forming+Giant-sized+Polymersomes+Using+Gel-assisted+Rehydration.">Forming Giant-sized Polymersomes Using Gel-assisted Rehydration.</a> Journal of Visualized Experiments. (111), (2016).</li><li>Bachand, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+self-assembly+of+1D+microtubule+nano-arrays.">Directed self-assembly of 1D microtubule nano-arrays.</a> Royal Society of Chemistry Advances. 4 (97), 54641-54649 (2014).</li></ol>

Сети LNT являются полезным инструментом для исследований in vitro свойств мембран и транспорта биомолекул, таких как трансмембранные белки. Кроме того, использование сложных липидных составов для изготовления сетей LNT позволяет проводить более биологически значимые исследования. В других...

Изготовление липидных нанотрубочных сетей (ЛНТ) представляет все больший интерес для исследования in vitro неравновесных липидных структур 1,2,3. Клетки используют липидные канальцы для диффузного транспорта белков4 и нуклеиновых кислот5, а также межклеточной связи 6,7. Эндоплазматический ретикулум и аппарат Гольджи особенно интересны, так как эти мембранно-связанные органеллы являются основными местами синтеза липидов и белков, а также транспорта этих интегральных биомолекул в цитоплазме клетки 8,9. Мембраны этих органелл состоят из нескольких видов липидов, включая сфинголипиды, холестерин и фосфолипиды10, которые в конечном итоге помогают определить их функциональность. Таким образом, чтобы более точно воспроизвести и изучить эти органеллы, LLNT in vitro должны быть изготовлены из везикул со все более сложными липидными составами11.
Гигантские одноламельные везикулы (ГУВ) широко используются для изучения поведения липидных мембран, поскольку они могут быть надежно синтезированы с помощью сложных составов, которые включают холестерин, фосфатидилхолин (ПК), фосфатидилэтаноламин (ПЭ), фосфатидилсерин (PS) и фосфатидилинозитол (PI)12,13. Здесь описан способ изготовления LNT из ГУВ с различными липидными составами с использованием скользящего анализа подвижности (GMA), в котором LNT экструдируются на основе работы, выполняемой кинезиновыми двигателями и микротрубочками, действующими на ГУВ. В этой системе кинезин-моторные белки, адсорбированные на поверхности, продвигают биотинилированные микротрубочки, превращая химическую энергию от гидролиза АТФ в полезную работу (в частности, экструзию ЛНТ из биотинилированных везикул)11. Полученная сеть LNT предоставляет модельную платформу для изучения влияния различий в липидных фазах на изменения морфологии LNT.
Вкратце, кинезиновые моторные белки вводят в проточную камеру в растворе, содержащем казеин, что позволяет адсорбцию двигателей на стеклянную поверхность камеры. Далее биотинилированные микротрубочки в растворе, содержащем АТФ, протекают через камеру и позволяют связываться с кинезиновыми двигателями и начинать подвижность. Затем раствор стрептавидина вводят в камеру и дают связываться нековалентно с микротрубочками. Наконец, ГУВ, содержащие биотинилированный липид, вводят в камеру и связывают с микротрубочками, покрытыми стрептавидином, а затем экструдируют ЛНТ с образованием крупномасштабных сетей в течение 15-30 мин. Этот метод позволяет получить большие разветвленные сети LNT с использованием стандартного лабораторного оборудования и реагентов по низкой стоимости11.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1071px;" width="1071">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:65px;width:328px;">100x/1.4 Numerical Aperture Oil Immersion Objective</td>
			<td style="width:104px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;">1-U2B836</td>
			<td style="width:520px;">Olympus UPlanSApo 100x/1.40 Oil Objective Infinity Corrected, RMS Thread 
			Working Distance 0.12mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">3.0 ND Filter</td>
			<td style="width:104px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Neutral Density Filter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">AMP-PNP</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A2647</td>
			<td>(&#946;,&#947;-imidoadenosine 5&#8242;-triphosphate)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">ATP</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A7699</td>
			<td>Adenosine 5&#39;-triphosphate disodium salt hydrate BioXtra</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:328px;">Brightline Pinkel DA/FI/TR/Cy5/Cy7-5X-A000 filter set</td>
			<td style="width:104px;">Semrock</td>
			<td style="width:119px;">LED-DA/FI/TR/Cy5/Cy7-5X-A-000</td>
			<td style="width:520px;"> 
			BrightLine Pinkel filter set, optimized for DAPI, FITC, TRITC, Cy5 &#38; Cy7 and other like fluorophores, illuminated with LED-based light sources</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Casein</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">22090</td>
			<td>Casein hydrolysate for microbiology</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Catalase</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C9322</td>
			<td>Catalase from Bovine Liver</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Chloroform</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">288306</td>
			<td>Chloroform anhydrous contains 0.5-1.0% ethanol as stabilizer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Cholesterol</td>
			<td style="width:104px;">Avanti</td>
			<td style="width:119px;">700000P</td>
			<td>cholesterol (ovine wool, &#62;98%) (powder)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:328px;">D-Glucose</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G7021</td>
			<td style="width:520px;">D-(+)-Glucose powder, BioReagent, suitable for cell culture, suitable for insect cell culture, suitable for plant cell culture, &#8805;99.5%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">DOPC</td>
			<td style="width:104px;">Avanti</td>
			<td style="width:119px;">850375C</td>
			<td>1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (in chloroform)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">DOPE-Biotin</td>
			<td style="width:104px;">Avanti</td>
			<td style="width:119px;">870282C</td>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(biotinyl) (sodium salt)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">DPPC</td>
			<td style="width:104px;">Avanti</td>
			<td style="width:119px;">850355P</td>
			<td>1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (powder)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">DPPE-Biotin</td>
			<td style="width:104px;">Avanti</td>
			<td style="width:119px;">870285P</td>
			<td>1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(biotinyl) (sodium salt)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">DTT</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">43816</td>
			<td>DL-Dithiothreitol solution 1 M</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:328px;">EGTA</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">E4378</td>
			<td style="width:520px;">EGTA, Egtazic acid, Ethylene-bis(oxyethylenenitrilo)tetraacetic acid, Glycol ether diamine tetraacetic acid</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:328px;">Glucose Oxidase</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G6125</td>
			<td style="width:520px;">Glucose Oxidase from Aspergillus niger 
			Type II, &#8805;10,000 units/g solid (without added oxygen)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Glycerol</td>
			<td style="width:104px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">G33</td>
			<td>Glycerol (Certified ACS), Fisher Chemical</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">GTP</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G8877</td>
			<td>Guanosine 5&#8242;-triphosphate sodium salt hydrate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">IX-81 Olympus Microscope</td>
			<td style="width:104px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>IX81 Inverted Microscope from Olympus</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">KOH</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">1050121000</td>
			<td>Potassium Hydroxide</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Magnesium Chloride</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M1028</td>
			<td>1.00 M magnesium chloride solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Orca Flash 4.0 Digital Camera</td>
			<td style="width:104px;">Hamamatsu</td>
			<td style="width:119px;">C13440-20CU</td>
			<td>ORCA-Flash 4.0 V3 Digital CMOS camera</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Oregon Green-DHPE</td>
			<td style="width:104px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">O12650</td>
			<td>Oregon Green 488 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Paclitaxel</td>
			<td style="width:104px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">P3456</td>
			<td>Paclitaxel (Taxol Equivalent) - for use in research only</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:328px;">PIPES</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P6757</td>
			<td style="width:520px;">1,4-Piperazinediethanesulfonic acid, Piperazine-1,4-bis(2-ethanesulfonic acid), Piperazine-N,N&#8242;-bis(2-ethanesulfonic acid)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:328px;">Texas Red-DHPE</td>
			<td style="width:104px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">T1395MP</td>
			<td style="width:520px;">Texas Red 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine, 
			Triethylammonium Salt</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Trolox</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">238813</td>
			<td>(&#177;)-6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Tubulin, Biotin</td>
			<td style="width:104px;">Cytoskeleton</td>
			<td style="width:119px;">T333P</td>
			<td>Tubulin protein (biotin) porcine brain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Tubulin, Hy-Lite 488</td>
			<td style="width:104px;">Cytoskeleton</td>
			<td style="width:119px;">TL488M</td>
			<td>Tubulin protein (fluorescent HiLyte 488) porcine brain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">Tubulin, Unlabeled</td>
			<td style="width:104px;">Cytoskeleton</td>
			<td style="width:119px;">T240</td>
			<td>Tubulin protein porcine brain</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fabricating multi-component lipid nanotube networks using the gliding kinesin motility assay

Сети липидных нанотрубок (LNT) представляют собой модельную систему in vitro для изучения молекулярного транспорта и биофизики липидов с отношением к вездесущим липидным канальцам, обнаруженным в эукариотических клетках. Тем не менее, in vivo LNT являются высоко неравновесными структурами, которые требуют химической энергии и молекулярных двигателей для сборки, обслуживания и реорганизации. Кроме того, состав in vivo LNT является сложным, состоящим из нескольких различных видов липидов. Типичные методы экструзии ЛНТ являются трудоемкими и трудоемкими, и они требуют оптического пинцета, микрошариков и микропипеток для принудительного извлечения нанотрубок из гигантских липидных пузырьков. Здесь представлен протокол для анализа подвижности скольжения (GMA), в котором крупномасштабные сети LNT быстро генерируются из гигантских одноламеллярных везикул (GUV) с использованием подвижности микротрубочек на основе кинезина. Используя этот метод, сети LNT формируются из широкого спектра липидных составов, которые имитируют сложность биологических LNT, что делает их все более полезными для исследований in vitro липидной биофизики и мембранно-ассоциированного транспорта. Кроме того, этот метод способен надежно производить сети LNT за короткое время (<30 мин) с использованием широко используемого лабораторного оборудования. Характеристики сети LNT, такие как длина, ширина и липидное разделение, также настраиваются путем изменения липидного состава ГУВ, используемых для изготовления сетей.

Сети LNT (рисунок 4) были изготовлены с использованием описанного протокола, в котором используется работа, выполняемая кинезин-транспортом микротрубочек для экструзии ЛНТ из ГУВ. Вкратце, ГУВ готовили с использованием регидратации агарозного геля с использованием раст?...

Watch this Scientific Journal Video about Fabricating Multi-Component Lipid Nanotube Networks Using the Gliding Kinesin Motility Assay at JoVE.com

Fabricating Multi-Component Lipid Nanotube Networks Using the Gliding Kinesin Motility Assay

Этот протокол описывает процесс изготовления липидных сетей нанотрубок с использованием скользящей подвижности кинезина в сочетании с гигантскими одноламеллярными липидными везикулами.

Изготовление многокомпонентных липидных нанотрубочных сетей с использованием скользящего кинезинового анализа подвижности

Lipid nanotube (LNT) networks represent an in vitro model system for studying molecular transport and lipid biophysics with relevance to the ubiquitous ...

Этот протокол позволяет просто генерировать крупномасштабные сети липидных нанотрубок, в которых отдельные нанотрубки демонстрируют поведение разделения фаз, аналогичное поведению родительского пузырька. Ключевым преимуществом этого подхода является то, что мы кооптируем работу, проделанную молекулярными двигателями, для самостоятельной сборки липидных нанотрубок очень параллельным образом и без вмешательства человека. Чтобы настроить анализ скользящей подвижности, сначала прикрепите три комплекта двусторонних ленточных полос на стеклянный слайд на расстоянии пяти миллиметров друг от друга.Аккуратно прижмите крышку на ленту и добавьте 30 микролитров одномикролярного раствора кинезина в подготовленную проточную ячейку. Через пять минут добавьте в клетку 30 микролитров раствора микротрубочек размером 10 микрограмм/миллилитр, осторожно прижимая лабораторную салфетку к противоположному концу проточного канала, чтобы облегчить обмен раствором. После еще одной пятиминутной инкубации промыть клетку один-три раза 50 микролитрами раствора для подвижности комнатной температуры за одну промывку, прежде чем добавлять 30 микролитров раствора стрептавидина 10 мкг/миллилитр стрептавидина в проточную клетку.Через 10 минут добавьте 30 микролитров 10-кратного раствора ГУВ для 30-минутной инкубации при комнатной температуре. Затем добавляют два микролитра 100-миллимолярного раствора AMP-PNP и закрывают камеру герметиком. Перенесите проточную камеру в перевернутый микроскоп для визуализации и выберите соответствующий набор фильтров.Используйте масляный объектив 100X, чтобы сфокусировать сначала поверхность скольжения крышки, прежде чем получить изображение интересующей сети. Затем откройте изображение в ImageJ и щелкните Изображение, Цвет и Композит, чтобы наложить красный и зеленый каналы для создания составного изображения. После получения изображения откройте интересующее изображение и нажмите «Проанализировать и установить масштаб», чтобы откалибровать шкалу для микроскопа.Введите пикселы в коэффициент пересчета микрометра и нажмите кнопку ОК. Используйте инструмент многоточечной линии для трассировки нанотрубок, начиная с родительского GUV, а также нажмите и удерживайте Control и M для измерения длины. Инструмент обработки изображений будет сохранять каждое новое измерение в окне результатов. Когда все трубки будут измерены, выберите Изображение, Настройка и Пороговое значение и нажмите кнопку Применить, чтобы применить пороговое значение.Затем нарисуйте прямоугольник известной длины над нужной трубкой. Чтобы измерить интегрированную плотность области, нажмите «Анализировать и измерять» Чтобы определить разделение липидов в узлах жидких нанотрубок, используйте инструмент «Линия», чтобы провести линию над интересующим узлом и измерить интенсивность узла как в зеленом, так и в красном каналах. В этом репрезентативном анализе были изготовлены сети жидких нанотрубок, которые, как было продемонстрировано, генерируют жидкие неупорядоченные и упорядоченные фазы, а также фазовые везикулы.Например, везикулы, синтезированные с 45% насыщенными липидами и 55% ненасыщенными липидами, приводят к образованию везикул, которые разделяются на сосуществующие жидко-неупорядоченные и твердые фазы. Однако, если включить холестерин, можно наблюдать сосуществование жидкости и жидкости, создавая ГУВ, которые разделяются на сосуществующие жидко-упорядоченные и жидко-неупорядоченные фазы. Кроме того, узлы могут наблюдаться внутри фазоразделенных смесей.Самое главное, что нужно помнить, это выбрать подходящее время экспозиции и установить фильтр ND, чтобы иметь возможность визуализировать липидные нанотрубки без фотоотбеливания флуорофоров. Адаптация состава фазового поведения липидных нанотрубок позволяет использовать минималистичную модельную систему, чтобы начать изучение биофизики туннельных нанотрубок, соединяющих клетки.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Plasma Lithography Surface Patterning for Creation of Cell Networks

Плазменные литографии поверхности паттернов для создания сотовых сетей

Systematic manipulation of a cell microenvironment with micro- and nanoscale resolution is often required for deciphering various cellular and molecular ...

Flexural Rigidity Measurements of Biopolymers Using Gliding Assays

Жесткость на изгиб измерений биополимеров Использование Gliding Анализы

Microtubules are cytoskeletal polymers which  play a role in cell division, cell mechanics, and intracellular transport. Each of these functions requires ...

Generation of Shear Adhesion Map Using SynVivo Synthetic Microvascular Networks

Генерация сдвига адгезии карте с помощью SynVivo Синтетический микрососудистых сетей

Cell/particle adhesion assays are critical to understanding the biochemical interactions involved in disease pathophysiology and have important ...

Electric Cell-substrate Impedance Sensing for the Quantification of Endothelial Proliferation, Barrier Function, and Motility

Электрический клетки с субстратом Сопротивление зондирования для количественной оценки эндотелиальной пролиферации, барьерную функцию, и Подвижность

Electric Cell-substrate Impedance Sensing (ECIS) is an in vitro impedance measuring system to quantify the behavior of cells within adherent cell layers. ...

Lipid Bilayer Vesicle Generation Using Microfluidic Jetting

Липидов Bilayer везикул поколения Использование микрофлюидных струйное

Bottom-up synthetic biology presents a novel approach for investigating and reconstituting biochemical systems and, potentially, minimal organisms. This ...

Fabricating Complex Culture Substrates Using Robotic Microcontact Printing (R-&#181;CP) and Sequential Nucleophilic Substitution

Fabricating Complex Culture Substrates Using Robotic Microcontact Printing R-Ãƒâ€šÃ‚ÂµCP and Sequential Nucleophilic Substitution

Изготовление Комплексные Субстраты культуры с помощью робота-микроконтактной печати (R-μCP) и Sequential нуклеофильного замещения

In tissue engineering, it is desirable to exhibit spatial control of tissue morphology and cell fate in culture on the micron scale. Culture substrates ...

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer (SALB) Method

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer SALB Method

Биомембрана Изготовление растворителем-помощь липидного бислоя (SALB) метод

In order to mimic cell membranes, the supported lipid bilayer (SLB) is an attractive platform which enables in vitro investigation of membrane-related ...

Solid Lipid Nanoparticles (SLNs) for Intracellular Targeting Applications

Solid Lipid Nanoparticles SLNs for Intracellular Targeting Applications

Твердые липидов Наночастицы (SLNS) для внутриклеточного Ориентация Приложения

Nanoparticle-based delivery vehicles have shown great promise for intracellular targeting applications, providing a mechanism to specifically alter ...

Fabricating Superhydrophobic Polymeric Materials for Biomedical Applications

Изготовление супергидрофобных полимерных материалов для биомедицинских применений

Superhydrophobic materials, with surfaces possessing permanent or metastable non-wetted states, are of interest for a number of biomedical and industrial ...

Fabricating Cotton Analytical Devices

Перерабатывающие Ватные Аналитические приборы

A robust, low-cost analytical device should be user-friendly, rapid, and affordable. Such devices should also be able to operate with scarce samples and ...